1. MEA Hazırlık <ol><li> Daha önce 18 açıklandığı veya Çok Kanallı Sistemler olarak MEA üreticilerinden satıcılardan doğrudan satın gibi elektroporasyon deneylerde kullanılmak için ÇÇA&#39;lar ya standart fotolitografi tekniği kullanılarak imal edilebilir <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> ve Alpha MED Scientific, Inc <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . Deneylerde kullanılan ÇÇA&#39;lar Katıhal Elektroniği Araştırma (CSSER) Merkezi tarafından yönetilir Arizona Eyalet Üniversitesi, temiz oda tesisi in-house imal edilmiştir. Deneylerde kullanılan ÇÇA&#39;lar iyi bir 1 cm iç çapı camın içinde 50-200 mikron gelen elektrot çapı boyutları ile 4 dizisi tarafından 8 32 indiyum kalay oksit elektrotlar vardı. Camın çok iyi MEA kullanarak polidimetilsiloksan (PDMS) üzerine bağlanmıştır. </li><li> Hücre s önce otoklavda sterilize MEAeeding. Bunlar MEA bütünlüğünü tehlikeye olmayan uzun gibi% 70 etanol içinde bir nemlendirici gibi diğer sterilizasyon yöntemleri, başka yerlerde açıklandığı gibi UV tedavisi ve sıcak su arıtma de kullanılabilir. </li><li> Bir laminer akış kaputu otoklavlanmış MEA aktarın ve standart steril polistiren Petri yerleştirin. Önceki MEA üzerinde hücre tohumlama için, 20 dakika boyunca UV ışığı açarak laminer akış kaputu sterilize. MEA UV ışığı akış kaputu UV ışık altında iken steril alüminyum folyo ile MEA içeren Petri kabı kapsayacak şekilde hassas ise. </li></ol> 2. MEA üzerinde Tohum Hücreler <ol><li> Tripsin / EDTA ile kaplama için 1 ml hücre ortamı içinde 100-200 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon ile onlara yapışık yükseltmek kullanılarak memeli hücrelerinde çalışan bir hücre çizgisi Hasat hücreleri. Deneylerde biz kültür NIH 3T3 fibroblast hücre hattı, HeLa hücre hattı ve MEA birincil kortikal ve hipokampal nöronlarda başarılı olmuştur. </li><li&gt; MEA üzerinde hücreleri ile ortam 20-30 ul damla yerleştirin. Inkübatör MEA ile Petri kabı aktarın. Bu hücre damla boyutu MEA tüm elektrotlar kaplayacak kadar büyük olduğundan emin olmak için önemlidir. </li><li> Hücreler laminer akış kaputu inkübatör MEA ile Petri kabı aktarmak ve hafifçe de MEA önceden ısıtılmış medya 400-500 ul (37 ° C) ekleyin tohumlama sonrası 2 saat. Bu hücreler hala bağlı ve eşit MEA yüzeye yayılır sağlamak için mikroskop altında kontrol edin. Inkübatör MEA geri aktarın. Ortam ilave edilmeden önce 2 saat bekleme süresi hücreleri MEA yüzeyi ile bağlı kalmak için yeterli zaman sağlar. Çok yakında hücreleri tohumlama sonrası hücre ortam ilavesi hücreleri uzak yıkayabilirsiniz. Hücre MEA üzerinde iyi uymayan, yüzeyi hücre adezyonu artırmak için hücre bağlanma gibi faktörler aspolylysine, fibronektin ve laminin ile tedavi edilebilir. Bizim HeLa hücre deneylerde biz genellikle fibronecti ile MEA yüzey tedavi1-2 saat için n (10 ug / ml). </li><li> Hücreler tohumlama sonrası 8-12 saat, herhangi bir ölü hücreleri çıkarmak için PBS ile 1-2 yıkar gerçekleştirin. Gerektiğinde Hücre orta her 24-48 saat değiştirilir. Tipik bir deneyde, hücreler transfeksiyon ekim sonrasında genellikle 24-48 saat için hazırdır. Elektroporasyon verimlilik tutarlılığı sağlamak için bu kültürü elektroporasyon önce konfluent en az% 80 kadar beklenmesi tavsiye edilir. </li></ol> 3. SiRNA Siteye özgü Transfeksiyon <ol><li> Nükleik asit çözeltisi hazırlayın. SiRNA transfeksiyon için, 200-400 ul nihai hacim elde etmek için buz gibi soğuk tampon içinde elektroporasyon, 1-2 uM siRNA elektroporasyon solüsyon hazırlanır. Bu video yazıda siRNA Alexa 488 konjuge karıştırılmış sırası ile HeLa hücrelerinin transfeksiyon göstermektedir. </li><li> Inkübatör, steril laminer akış kaputu hücreleri ile MEA aktarın. MEA gelen hücre ortamı çıkarın ve PBS ile yıkama gerçekleştirin. Bundan sonra, i 200-400 ul ekleyinkuyuya ce soğuk 1 uM siRNA elektroporasyon çözüm. </li><li> Hedeflenen elektrotlar (elektrikli darbe optimal parametrelerin belirlenmesi için 4. adıma bakın) için anodik kare elektrik darbeleri uygulayın. Deneylerde biz elektrik bakliyat ve MEA bağ yastıkları ile temas yapmak için bir dual-inline-paketi (DIP) 16 pin klibi oluşturmak için Pragmatik Cihazları 2414A dalga üreteci kullanılır. Dalga biçimi üreteci tek tek elektrodların seçicilik sağlamak için bir demultiplexor baskılı devre kartı yoluyla DIP klip ile bağlanabilir. Referans elektrodu, hücre ortamı içinde bir çelik katot yerleştirin. Medyada çelik referans elektrot düşerken onu MEA yüzeyi ile temas yapmaz emin olmak için son derece önemlidir. Temas ettiğinde, bu hücreleri ve MEA zarar verebilir. Bu, hücrelerin yukarıda 1 mm bir konum ile referans elektrodu düşürmek için tavsiye edilir. 1 mm bir yüksekliğe sahip bir boşluk ref yerleştirilmesi yardımcı olmak için iyi yerleştirilebilirerence elektrot. Harici bir referans elektrot kullanarak alternatif bir yaklaşım katot-anot çiftleri olarak komşu elektrotlar kullanmaktır. </li><li> Hemen MEA üzerinde hedeflenen elektrotlara elektrik darbeleri uygulandıktan sonra, kuluçka için MEA geri aktarın. 5 dakikalık bir kuluçka döneminden sonra, yavaşça önceden ısıtılmış (37 ° C), hücre ortamı ile elektroporasyon tamponu% 75 değiştirin. Daha sonra, fosforlu görüntü hücrelerinin fluoresan etiketli siRNA teslim teyit etmek için yapılabilir. </li></ol> 4. Elektroporasyon Parametre Optimizasyonu <ol><li> Darbe genlik, darbe süresi ve darbe sayısı değerlerinin bir aralığı için elektroporasyon, tasarım elektroporasyon deney için optimal elektrik nabız parametreleri belirlemek için. HeLa hücreleri ile bizim deneyim, biz gözlenen mil ile başarılı elektroporasyon yol açtı 100 mikron bir elektrot boyutu için tek bir gerilimi 3 V ila 9 V genlikli darbe ve msn 1 den 10 msn sürelinimal hücre ölümü. Bu bir parametre bir seferde değiştirilebilir ve diğerlerinin sabit tutulması bizim tavsiyedir. Nabız parametrelerin her biri için elektroporasyon etkinliğini ölçmek için, olduğu gibi adımlar 4,2-4,5 açıklandığı propidyum iyodür (PI), bir hücre laktobionat, boya ki lekeleri nükleik malzeme, ve canlı deney esaslı yönteme kullanır. </li><li> Adım 1 ve 2&#39;de belirtilen yön takip eden MEA üzerinde bir hücre kültür oluşturulması. </li><li> Önceki elektroporasyon bir buz gibi soğuk elektroporasyon tamponu içinde 30 ug / ml solüsyon PI 300-500 ve calcien ul PBS içinde çözelti AM 4 uM 400 ul hazırlamak için. </li><li> Inkübatör laminer akış kaputu MEA aktarın. MEA gelen hücre ortamı çıkarın ve PBS ile yıkama gerçekleştirin. Bundan sonra, PI ile buz soğuk elektroporasyon tamponu 300-500 ul ekleyin. </li><li> Hedeflenen elektrotlar (elektrik üretme ve uygulama için Deneylerde kullanılan ekipmana istenen darbe genliği ve süresi ile elektrik darbeleri uygulayınMEA ile mide darbe adım 3.3) anlatılmıştır. Referans elektrot için ya iyi MEA elektroporasyon tampon içine çelik elektrot düşürmek veya referans olarak komşu elektrodu kullanın. Seçici farklı elektrotlarla değişen genlik veya süreleri darbeleri uygulayarak birden fazla deneyler aynı cihaz üzerinde yapılabilir. Örneğin, bir 32 elektrot MEA üzerinde, 8 deneyler 8 grup, 4 elektrot oluşan her bir bölme ile 32 elektrotlar gerçekleştirilebilir. 8 gruplarının her biri daha sonra, bir kontrol olarak kullanılan 0,5 V artışlarla ve bir grupta, 3 V-6 V aralığında değişen genlikleri ile süresi 5 msn dikdörtgen tek bir voltaj palsı ile stimüle edilebilir. </li><li> Hemen uyguladıktan sonra voltaj darbeleri 5 dakika inkübatör MEA aktarın. Daha sonra, hafifçe de MEA gelen elektroporasyon tampon% 75&#39;i kaldırmak ve sıcak hücre ortam ile değiştirin. Inkübatör MEA geri aktarın. </li><li> 2-4 saat bir kuluçka döneminden sonra4 uM 300-500 ul ile iyice MEA ortamı içinde hücre değiştirmek Calcein AM PBS çözeltisi. Başka bir 30 dakika için inkübatöre geri MEA aktarın. </li><li> Calcein AM ile hücrelerin inkübasyonu takiben, PBS ile iki yıkamadan sonra PBS ile iyice MEA içinde çözelti Calcein AM değiştirin. Ve Calcein AM (Uyarma / Emisyon - 490 nm/520 nm) - PI (535 nm/617 nm Uyarma / Emisyon) için filtreler optik mikroskopla kullanarak hücrelerin floresan görüntüler elde edin. Elektroporasyon nedeniyle PI alımı, hücre kırmızı floresan ve Calcein AM yeşil floresan için canlı hücreler neden olmuştur. Görülebilir Üç olası senaryo)) canlı hücre electroporated ve canlı (kırmızı ve yeşil iki floresan olacak), 2) Hücreler 1 ama electroporated (sadece yeşil floresan olacaktır) ve 3 değil, elektroporasyon nedeniyle ölü hücreler (sadece kırmızı floresan olacaktır) . Hücre canlılığı elektrot üzerinde canlı hücrelerin toplam sayısının yüzde ve elektroporasyon eff olarak hesaplandıiciency PI / siRNA ile yüklü hücrelerin toplam sayısının yüzde olarak hesaplanmıştır. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1, PI ile HeLa hücrelerinin site-spesifik yükleme göstermektedir. Bu, elektrot üzerinde tek hücreler PI (Şekil 1B) bir alımı gösteren olduğu görülmektedir. Canlı test sonrası elektroporasyon hücreler (Şekil 1A) canlılığı değerlendirmek için kullanılmıştır yapılır. Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, örneğin elektroporasyon verim ve hücre viabilitesi, sırasıyla% 81.8 ve% 96.1 &#39;bulunmaktadır. Yüksek hücre canlılığı ve elektroporasyon verim elektroporasyon darbe parametreleri optimize edilmesi ile elde edilebilir. Optimize edilmiş bir elektroporasyon puls için floresan etiketlendi siRNA (8 V, 1 mili saniye) ile HeLa hücrelerinin Yere-özgü transfeksiyon Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. 8. V, 1 milisaniye de siRNA için elektroporasyon verim ± 74.4 bulundu% 16.0 ve edildiHücre canlılığı 87.9 ±% 8.4 (ortalama olarak temsil edilen tüm veriler ortalama ± standart sapma, N = 5) olarak tespit edilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> Şekil 200 mikron elektrot (6 V, 5 ms) hakkında HeLa hücrelerinde PI 1. Siteye özgü teslimat. A) Calcien göre canlı assay 2 saat sonrası elektroporasyon gerçekleştirilir. Canlı hücreleri yeşil floresan ile gösterilir. B) Kırmızı floresan elektrot üzerinde hücreleri tarafından PI alımını gösterir. C) A ve B beyaz oklar A bindirilmiş görüntü electroporated ve canlı hücreleri gösterir. Siyah oklar ölü hücreleri gösterir. A, B ve C &#39;de beyaz bir daire elektrot dış hatlarını göstermektedir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> Şekil 2. Floresan etiketlendi scrambl ile HeLa hücrelerinin transfeksiyonusiRNA e dizisi. A) bir 100 um elektrot üzerinde HeLa hücreleri ile ilgili görüntü Alexa 488 etiketli siRNA (8 V, 1 mili saniye) ile transfekte. B) hücre çekirdeğinin Görüntü DAPI ile boyanmış. Beyaz bir daire elektrot kenarına işaretler.

<ol>
	<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+gene+expression+by+small+double-stranded+RNAs+in+invertebrate+and+vertebrate+systems.">Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742 (2001).</li><li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550 (2002).</li><li>Lee, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+small+interfering+RNAs+targeted+against+HIV-1+rev+transcripts+in+human+cells.">Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).</li><li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3'+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells.">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li><li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells.">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li><li>Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-mediated+gene+silencing+in+vitro+and+in+vivo.">siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).</li><li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA.">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15, 1311 (1987).</li><li>Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection:+a+highly+efficient,+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure.">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413 (1987).</li><li>Raptis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=applications+of+electroporation+of+adherent+cells+in+situ,+on+a+partly+conductive+slide.">applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide.</a> Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+mammalian+cells:+optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation.">Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).</li><li>Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+on+siRNA+delivery+with+nonviral+carriers.">Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1017 (2011).</li><li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs.">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411, 107-110 (2001).</li><li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+gene+transfer+by+electroporation+into+adherent+cells+on+plasmid+DNA-loaded+electrodes.">Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes.</a> Nucleic Acids Res. 32, e187 (2004).</li><li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-Layer+Assembly+of+Poly+(ethyleneimine)+and+Plasmid+DNA+onto+Transparent+Indium?+Tin+Oxide+Electrodes+for+Temporally+and+Spatially+Specific+Gene+Transfer.">Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells.">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture.">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+array+(MEA)+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording.">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li><li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays.">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li><li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery.">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li><li>Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+high-throughput+electroporation+chips.">Efficient and high-throughput electroporation chips.</a> , (2011).</li><li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays.">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo.">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region.">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594 (2005).</li><li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+electroporation:+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications.">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li><li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells.">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu video yazıda siRNA karıştırılmış dizisi ile HeLa hücrelerinin siteye özgü transfeksiyon için MEA kullanımını göstermektedir. Bu teknolojinin avantajlarından biri primer hücre hatları da dahil olmak üzere farklı hücre hatları uygulanabilmesidir. Bizim laboratuarında önce E18 gün yaşlı sıçan ve pişmiş siRNA dizileri ve plazmid GFP 18, 19 ile NIH-3T3 hücreleri primer hipokampal nöronal kültür siteye özgü transfeksiyon için bu teknolojinin kullanımını göstermiştir. Biz de HeLa hücrelerinde bulunan endojen hedef (yayınlanmamış veri) karşı fonksiyonel siRNA teslim başarı oldu. Tipik bir ticari MEA floresan immun teknikleri kullanarak, gen susturulması fonksiyonel etkisinin nicel değerlendirmesi sağlayan optik görüntüleme (dik mikroskop) ile uyumludur. Buna ek olarak, MEA mikroelektrot genetik pertürbasyon yanıt olarak, bu tür birincil nöronlar gibi hücrelerinin elektriksel aktivitesini izlemek için kullanılabilir.MEA eşsiz doğası böylece deneysel verim artırılması, tek bir hücre kültürü ile eş zamanlı birden fazla deneyler sağlar. Önceki MEA tabanlı bir sistem ile önemli bir sınırlama yüksek geleneksel kimyasal Transfeksiyondan bazlı yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında transfeksiyon (1 mikrona siRNA 400 ul) için gerekli olan siRNA büyük miktarda ve böylece sistemin maliyet etkinliği sınırlar. Bu kısmen birkaç mikrolitre az için siRNA elektroporasyon çözümün toplam hacmi azaltmak için MEA tabanlı sistem ile mircofluidics birleştiren aşılabilir. Buna ek olarak, farklı ve arayüz siRNA moleküllerin seri teslim sağlayabilir, böylece büyük ölçüde MEA tabanlı teknolojinin hacmi artar. Alternatif olarak, siRNA moleküllerin hücre ekim öncesi mikroelektrot üzerinde tespit edilebilir ve daha sonra siRNA molekülleri ters elektroporasyon 15, 23 tarafından hücrelere transfekte edilebilir. Bu teknolojinin daha da geliştirilmesi, yeni bir yüksek-t sunuyorgen manipülasyonu çalışmaları için, hroughput verimli ve düşük maliyetli bir yöntemdir.

<table border="1"><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Hücre ortamı: Gelişmiş MEM L-Glutamine 200 mM Penisilin / Streptomisin Fetal bovin serumu </td><td> Gibco / Invitrogen HIMEDIA Laboratuvarlar / VWR Lonza grup Ltd Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> Hücre ortamı bileşimi: Peşin MEM içinde% 2 FCS,% 2 L-glutamin ve% 2 Pennstrep </td></tr><tr><td> Tripsin EDTA </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Tagged Alexa 488 ve rodamin sequ şifrelience siRNA </td><td> Qiagen, Inc </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> Elektroporasyon tampon </td><td> BioRad Laboratuvarlar </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> Dalga jeneratörü </td><td> Pragmatik </td><td> 2414A </td><td> İstediğiniz darbe sunabilirsiniz Herhangi dalga / puls üreteci kullanılabilir. </td></tr></table>

high efficiency, site-specific transfection of adherent cells with sirna using microelectrode arrays (mea)

Ökaryotlarda ve böyle siRNA ve shRNA olarak RNAi ajanlar, sonraki gelişimi RNAi yolunun keşfi, fonksiyonel genomik ve tedavi için spesifik genler 1-8 susturmak için güçlü bir yöntem elde ettik. RNAi temelli çalışmalarda görev alan önemli bir sorun hedeflenen hücrelere RNAi ajanların teslimat. Böyle toplu elektroporasyon ve kimyasal transfeksiyon yöntemleri gibi geleneksel olmayan viral dağıtım teknikleri, genellikle teslimi üzerinde gerekli mekansal kontrol eksikliği ve 9-12 kötü transfeksiyon verimliliği göze. Bu tür katyonik lipidler, katyonik polimerler ve nanopartiküller olarak kimyasal transfeksiyon yöntemleri son gelişmeler son derece gelişmiş transfeksiyon verimliliği 13 sonuçlandı. Ancak, bu teknikler hala son derece yüksek verimli teknolojiler, tek hücre çalışmaları ve hücre-hücre etkileşimleri soruşturma minyatürize yararlanabilir teslimat üzerinde kesin mekansal kontrol sunmak için başarısız. nt &quot;gen teslimat&gt; En son teknolojik gelişmeler. yapışık hücrelere yüksek-throughput transfeksiyon 14-23, mikro elektroporasyon kullandığınız bir çoğunluğu sağlamıştır Microscale elektroporasyon (kadar tek hücrelere) teslimi üzerinde hassas uzay-zamansal kontrol sunuyor ve kanıtlanmıştır Ayrıca yüksek verimlilik 19, 24-26. ulaşmak için, elektroporasyon temelli yaklaşımlar kimyasal bazlı transfeksiyon yöntemleri gerekli siRNA ve DNA kompleksleri ile inkübasyon uzun bir süre (genellikle 4 saat) gerektirir ve çıplak siRNA ve DNA&#39;nın doğrudan giriş yol açmaz hücre sitoplazması içine molekülleri. Bunun bir sonucu olarak gen ekspresyonu transfeksiyondan 27 saat sonra altı gibi erken elde edilebilir. Laboratuarımız önceden yapışık memeli hücre kültürleri 17-19 site-spesifik transfeksiyon için mikroelektrot dizilerin kullanımı (MEA) göstermiştir. MEA temelli yaklaşım, genetik yükü teslim lokalize mikro ölçekli electroporati yoluyla elde edilirhücreleri üzerinde. Seçilen elektrotlar ile elektrik sinyalinin bir uygulama uyarılan elektrot bölgesinde mevcut hücrelerin elektroporasyonu yol açar lokal elektrik alanı oluşturur. Mikro elektrotların bağımsız denetim transfeksiyon üzerinde mekansal ve zamansal kontrolü sağlar ve deneysel verim artırılması ve kültür-to-kültür değişkenliği azaltarak aynı kültürü üzerinde yapılacak birden transfeksiyon tabanlı deneyler sağlar. Burada deneysel kurulum ve elektroporasyon kullanarak bir floresan etiketli karıştırılmış dizisi siRNA ile yapışık HeLa hücrelerinin hedef transfeksiyon için protokol açıklar. Aynı protokol de plazmit vektörlerinin transfeksiyon için de kullanılabilir. Buna ek olarak, burada tarif edilen protokol küçük değişikliklerle kolaylıkla ile memeli hücre çizgileri, çeşitli için genişletilebilir. Önceden tanımlanmış ve özel her iki elektrot desenleri ile ÇÇA&#39;lar Ticari durumu bu teknik erişilebilir t olunTemel hücre kültürü ekipmanları ile o en fazla araştırma laboratuarları.

Watch this Scientific Journal Video about High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA at JoVE.com

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Bir mikroelektrot dizisi (MEA) kullanarak bir yapışkan memeli hücre kültüründe siRNA karıştırılmış dizi site-spesifik transfeksiyon için madde ayrıntılar protokolü.

Mikroelektrod Diziler Kullanarak siRNA Bağlanan Hücre Yüksek verim, Siteye özgü Transfeksiyon (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

high-efficiency-site-specific-transfection-adherent-cells-with-sirna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

13.4K Görüntüleme.  Arizona State University. Bir mikroelektrot dizisi (MEA) kullanarak bir yapışkan memeli hücre kültüründe siRNA karıştırılmış dizi site-spesifik transfeksiyon için madde ayrıntılar protokolü.

Video: High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

İnsan Pankreas Kanseri Hücrelerinde Epidermal Büyüme Faktörü kullanarak Gen Teslimat ve Transfeksiyon Jelatin Tabanlı Engineered Nanovectors Reseptör-hedefli

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Biyomühendislik

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

Siteye özgü Bakteriyel Kromozom Mühendislik: ΦC31 integraz Aracılı Kaset Borsası (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

Yağış oluşturulmuş polietilen glikol mikrojellerinin özellikleri reaktiflerin molekül ağırlığı ile kontrol edilir

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

SiRNA Therapeutics teslimi için Gözenekli Silikon Mikropartiküller

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Genetik olarak tadil edilmiş hücre transplantasyonu için Micropatterned kültür plakalarında Sferoid hücrelere karşı gene

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Yaşayan Hücreleri Mühendise Sentetik Biyoloji kullanarak That Programlanabilir Malzemelerle Arayüzü

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Kapsamlı değerlendirme etkinliği ve güvenliği üç tamamlayıcı yöntemlerle plasenta hedefli ilaç dağıtım

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...