1. MEA Preparación <ol><li> MEA para su uso en experimentos de electroporación puede ser fabricado utilizando la técnica de fotolitografía estándar como se describe anteriormente 18 o comprados directamente a los vendedores de los fabricantes de MEA, tales como sistemas de canales múltiples <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> y alfa MED Scientific Inc., <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . Los AMUMA utilizados en nuestros experimentos se fabrican en el local en la sala limpia en Arizona State University, el cual es administrado por el Centro de Investigación Electrónica de estado sólido (CSSER). Los AMUMA utilizados en nuestros experimentos con 32 electrodos de óxido de estaño e indio en un 8 por 4 matriz con diámetros de electrodos 50 a 200 micras dentro de un vaso 1 cm de diámetro interior también. El vidrio también se unió a la MEA polidimetilsiloxano utilizando (PDMS). </li><li> Esterilizar el MEA en autoclave antes de célula seeding. Otros métodos de esterilización tal como un remojo en 70% de etanol, tratamiento UV y tratamiento con agua caliente como se describe en otra parte también se puede utilizar siempre y cuando no comprometan la integridad de la MEA. </li><li> Transferir el autoclave MEA a una campana de flujo laminar y colocarlo en un patrón de poliestireno placa de Petri estéril. Antes de la siembra de células sobre la MEA, esterilizar la campana de flujo laminar mediante la activación de la luz UV durante 20 min. Si el MEA es sensible a la luz UV cubrir la placa de Petri que contiene el MEA con papel de aluminio estéril mientras que la campana de flujo es bajo iluminación UV. </li></ol> 2. Las células siembra sobre el MEA <ol><li> Cosecha células de una línea celular adherente de funcionamiento de las células de mamífero utilizando tripsina / EDTA y elevarlas a una concentración de 100-200 células / l en 1 ml de medio de células para la siembra. En nuestros experimentos hemos tenido éxito en el cultivo de línea celular NIH 3T3 fibroblastos, la línea de células HeLa y neuronas corticales primarias del hipocampo y en el MEA. </li><li&gt; Coloque una gota 20-30 l de medios de comunicación con las celdas de la MEA. Transferir la placa de Petri con el MEA a la incubadora. Es importante asegurarse de que el tamaño de la gota de células es lo suficientemente grande como para cubrir todos los electrodos en el MEA. </li><li> 2 horas después de la siembra de las células transferir la placa de Petri con el MEA de la incubadora para campana de flujo laminar y suavemente añadir 400-500 l de preparación de soportes calentado (37 ° C) a la MEA bien. Ver bajo el microscopio para asegurar que las células están todavía unido y distribuida uniformemente en la superficie de MEA. Transferir la parte posterior MEA a la incubadora. El período de 2 hr de espera antes de la adición de medios de comunicación asegura un tiempo suficiente para que las células se adhieran a la superficie de MEA. La adición de medios de células demasiado pronto después de la siembra de las células puede lavar las células. Si las células no se adhieren bien sobre la MEA, su superficie puede ser tratada con factores de unión celular, tales aspolylysine, fibronectina y laminina para mejorar la adhesión celular. En nuestros experimentos con células HeLa que solemos tratar la superficie con MEA fibronectin (10 ug / ml) durante 1-2 hr. </li><li> 8-12 horas después de la siembra de las células, realizar 1-2 lavados con PBS para eliminar las células muertas. Medio celular puede cambiarse cada 24-48 horas, según sea necesario. En un experimento típico, las células generalmente están listos para la transfección 24-48 h después de la siembra. Para mantener la coherencia en la eficiencia de la electroporación, se recomienda que esperar hasta que el cultivo es de al menos 80% confluentes antes de la electroporación. </li></ol> 3. Específica de sitio La transfección de siRNA <ol><li> Preparar la solución de ácido nucleico. Para la transfección siRNA, preparar un siRNA 1-2 mM solución electroporación en tampón de electroporación enfriado en hielo para alcanzar un volumen final de 200-400 l. En este artículo de vídeo se demuestra la transfección de células HeLa con Alexa 488 conjugada revueltos secuencia de siRNA. </li><li> Transferir la MEA con células de la incubadora a la campana de flujo laminar estéril. Eliminar los medios celulares a partir de la MEA y realizar un lavado con PBS. Después de eso, añadir 200-400 l de la ice frío 1 mM siRNA electroporación solución al pozo. </li><li> Aplicar anódicos impulsos eléctricos a los electrodos cuadrados específicas (Consulte el paso 4 para determinar los parámetros óptimos de los impulsos eléctricos). En nuestros experimentos hemos utilizado algunos instrumentos pragmáticos 2414a generador de forma de onda para generar impulsos eléctricos y una dual-inline-paquetes (DIP) 16 pin clip de entrar en contacto con los terminales de unión de los AMUMA. El generador de forma de onda puede ser conectado a la pinza DIP a través de una placa de circuito impreso demultiplexor para proporcionar selectividad de los electrodos individuales. Para el electrodo de referencia, colocar un cátodo de acero en los medios celulares. Aunque bajar el electrodo de referencia de acero en los medios de comunicación es extremadamente importante para asegurarse de que no hace contacto con la superficie del MEA. Tras el contacto, puede causar daño a las células y la MEA. Se recomienda para bajar el electrodo de referencia a una posición de 1 mm por encima de las células. Un separador con una altura de 1 mm puede ser colocado en el pozo para ayudar en la colocación de la refrencia electrodo. Un enfoque alternativo a la utilización de un electrodo de referencia externo es el uso de electrodos vecinos como pares de ánodo cátodo. </li><li> Inmediatamente después de aplicar los impulsos eléctricos a los electrodos de destino de la MEA, transferir la parte posterior MEA a la incubadora. Después de un período de incubación de 5 min, suavemente reemplazar 75% del tampón de electroporación con pre-calentado (37 ° C) medios celulares. Más tarde, fluorescente de imágenes puede realizarse para confirmar la entrega de ARNsi marcado fluorescentemente a las células. </li></ol> 4. Electroporación optimización de parámetros <ol><li> Para determinar los parámetros óptimos de impulsos eléctricos para electroporación, diseñar experimentos de electroporación para una gama de valores de amplitud de pulso, duración del pulso, y el número de pulsos. En nuestra experiencia con células HeLa, se observó que un pulso de voltaje único de la amplitud de 3 V a 9 V, y la duración de 1 ms a 10 ms para un electrodo de tamaño de 100 micras llevaron a electroporación con éxito millasla muerte celular nimal. Es nuestra recomendación de que un parámetro puede variar a la vez y los demás se mantienen constantes. Para cuantificar la eficiencia de la electroporación para cada uno de los parámetros del pulso, se utiliza yoduro de propidio (PI), un colorante impermeant celular que el material de manchas nucleico, y la metodología de ensayo basado en directo, como se describe en los pasos 4.2-4.5. </li><li> Establecer un cultivo de células en el MEA siguiendo las instrucciones descritas en los pasos 1 y 2. </li><li> Antes de la electroporación preparar un 300-500 l de 30 mg / ml de solución PI en tampón de electroporación enfriada con hielo y 400 l de 4 mM calcien AM solución en PBS. </li><li> Transferir la MEA de la incubadora a la campana de flujo laminar. Eliminar los medios celulares a partir de la MEA y realizar un lavado con PBS. Después de eso, añadir 300-500 l del tampón de electroporación hielo frío con PI. </li><li> Aplicar impulsos eléctricos con la amplitud del pulso deseado y la duración de los electrodos dirigidos (El equipo usado en nuestros experimentos para generar y aplicar la electric pulso a la MEA se describe en el paso 3,3). Para el electrodo de referencia, bien bajar un electrodo de acero en el tampón de electroporación en la MEA o bien utilizar el electrodo vecino como referencia. Aplicando selectivamente impulsos de distintas amplitudes o duraciones de diferentes electrodos múltiples experimentos se pueden realizar en el mismo dispositivo. Por ejemplo, en un electrodo de 32 MEA, 8 experimentos se pueden realizar mediante el fraccionamiento de los 32 electrodos en 8 grupos, cada uno compuesto de 4 electrodos. Cada uno de los 8 grupos entonces puede ser estimulado por un pulso rectangular de una sola tensión de una duración de 5 ms con amplitudes que varían en 3 V-6 rango de V en incrementos de 0,5 V y un grupo se puede utilizar como un control. </li><li> Inmediatamente después de aplicar los impulsos de tensión transferir el MEA a la incubadora durante 5 min. Posteriormente, retirar suavemente el 75% del tampón de electroporación de la MEA bien y reemplazarlo con medios celulares cálidos. Transferir la parte posterior MEA a la incubadora. </li><li> Después de un periodo de incubación de 2-4 hrsustituir los medios celulares en el MEA bien con 300-500 l de 4 mM de calceína AM solución en PBS. Transferir la parte posterior MEA a la incubadora durante otros 30 min. </li><li> Después de la incubación de las células con calceína AM, sustituir la solución de calceína AM en el MEA bien con PBS después de dos lavados con PBS. Obtener imágenes fluorescentes de las células utilizando un microscopio óptico con filtros para PI (excitación / emisión - 535 nm/617 nm) y calceína AM (excitación / emisión - 490 nm/520 nm). La captación de PI, debido a la electroporación, hace que las células fluorescencia roja y la calceína AM hace que las células que están vivas que emite fluorescencia verde. Tres escenarios posibles que se pueden observar son: 1) celulares electroporadas y vivo será fluorescente (rojo y verde), 2) células vivas pero no electroporación (sólo presenta fluorescencia verde) y 3) células muertas debido a la electroporación (sólo presenta fluorescencia roja) . La viabilidad celular se calcula como un porcentaje del número total de células vivas en el electrodo y la electroporación efficiency se calculó como porcentaje del número total de células cargadas con PI / siRNA. </li></ol> 5. Los resultados representativos La Figura 1 muestra la carga específica del sitio de células HeLa con PI. Se puede observar que sólo las células en el electrodo de demostrar una captación de PI (Figura 1B). Un ensayo realizado en vivo después de la electroporación se utilizó para evaluar la viabilidad de las células (Figura 1A). La eficiencia de la electroporación y la viabilidad celular para el ejemplo mostrado en la Figura 1 son 81,8% y 96,1% respectivamente. Alta viabilidad celular y la eficiencia de la electroporación se puede lograr mediante la optimización de los parámetros del pulso de electroporación. Sitio específico de la transfección de células HeLa con ARNsi marcado fluorescentemente y para un pulso de electroporación optimizado (8 V, 1 ms) se muestra en la Figura 2. La eficiencia de la electroporación para el siRNA en V 8 mseg, 1 se encontró que era 74,4 ± 16,0% yla viabilidad celular se encontró que era 87,9 ± 8,4% (todos los datos representados como media ± desviación estándar, n = 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> Figura 1. Específica de sitio de entrega de PI en células HeLa en un electrodo m 200 (6 V, 5 mseg). A) calcien ensayo basado en directo interpretada 2 h después de la electroporación. Células vivas se indican con fluorescencia verde. B) Red de fluorescencia demuestra la captación de PI por las células en el electrodo. C) Una imagen superpuesta de A y B. Las flechas blancas indican que las células se someten a electroporación y vivo. Las flechas negras indican que las células están muertas. El círculo blanco en A, B y C indica el contorno del electrodo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> Figura 2. Transfección de células HeLa con scrambl marcado fluorescentementee secuencia de siRNA. A) Imagen de células HeLa en un electrodo 100 micras transfectadas con siRNA Alexa 488 marcado (8 V, 1 mseg). B) Imagen de núcleos de células teñidas con DAPI. El círculo blanco marca el borde del electrodo.

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Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells.">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture.">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+array+(MEA)+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording.">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li><li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays.">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li><li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery.">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li><li>Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+high-throughput+electroporation+chips.">Efficient and high-throughput electroporation chips.</a> , (2011).</li><li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays.">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li><li>Haas, K., Sin, W. 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No hay conflictos de interés declarado.

En este artículo de vídeo que demuestran el uso de MEA para sitio específico de la transfección de células HeLa con revueltos secuencia de siRNA. Una de las ventajas de esta tecnología es su aplicabilidad a diferentes líneas celulares, incluyendo líneas celulares primarias. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente la utilización de esta tecnología específica de sitio primario de la transfección de cultivo neuronal de hipocampo de rata E18 días de edad y células NIH-3T3 con revueltos secuencias de siRNA y GFP plásmido 18, 19. También hemos tenido éxito en la entrega de siRNA funcional contra una diana endógeno en células HeLa (datos no publicados). Un típico MEA comercialmente disponible es compatible con formación de imágenes ópticas (microscopio vertical), que permite una evaluación cuantitativa de impacto funcional de silenciamiento de genes, utilizando técnicas fluorescentes de inmunotinción. Además, los microelectrodos en MEA se puede utilizar para controlar la actividad eléctrica de las células, tales como las neuronas primarias, en respuesta a la perturbación genética. Lanaturaleza única de MEA permite simultáneamente varios experimentos en un cultivo de células individuales, lo que aumenta el rendimiento experimental. Actualmente una limitación importante con el sistema basado en MEA es la gran cantidad de siRNA necesario para la transfección (400 l de 1μM siRNA), que es alta en comparación con los enfoques convencionales de transfección basados ​​en químicos y por lo tanto limita la rentabilidad del sistema. En parte, esto se puede superar mediante la incorporación de mircofluidics con el sistema basado en MEA para disminuir el volumen total de solución de siRNA electroporación a menos de unos pocos microlitros. Además, los microfluidos puede habilitar la entrega de serie de moléculas de siRNA diferentes; mejorando así, enormemente el rendimiento de la tecnología basada en MEA. Alternativamente, las moléculas de siRNA pueden ser vistos en los microelectrodos antes de la siembra de células y entonces las moléculas de siRNA pueden ser transfectados en las células por electroporación inversa 15, 23. Un mayor desarrollo de esta tecnología ofrece una novela de gran throughput costo, eficiente y de bajo método para los estudios de manipulación de genes.

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Medios de comunicación celulares: Advanced MEM L-glutamina 200 mM Penicilina / Estreptomicina El suero fetal bovino </td><td> Gibco / Invitrogen Himedia Laboratorios / VWR Lonza Group Ltd. Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> Celular medios composición: 2% de FBS, Pennstrep 2% de L-glutamina y 2% en Advance MEM </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 21-040 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Alexa 488 y rodamina etiquetados revueltos SEQUcia siRNA </td><td> Qiagen, Inc. </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> La electroporación búfer </td><td> Biorad Laboratories </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> Generador de forma de onda </td><td> Pragmático </td><td> 2414a </td><td> Cualquier forma de onda / generador de impulsos que puede entregar los pulsos deseado puede ser utilizado. </td></tr></table>

high efficiency, site-specific transfection of adherent cells with sirna using microelectrode arrays (mea)

El descubrimiento de la vía de RNAi en eucariotas y el posterior desarrollo de los agentes de ARNi, como siRNA y shRNA, han logrado un método potente para el silenciamiento de genes específicos de 1-8 para la genómica funcional y la terapéutica. Un reto importante involucrado en estudios basados ​​en RNAi es el suministro de agentes de ARNi a células diana. Tradicionales técnicas no víricas de envío, tales como electroporación grandes cantidades y métodos químicos de transfección a menudo carecen del control necesario espacial sobre la entrega y proporcionar eficiencias de transfección 9-12 pobres. Los recientes avances en los métodos de transfección químicas tales como lípidos catiónicos, polímeros catiónicos y nanopartículas han dado lugar a eficiencias de transfección muy mejoradas 13. Sin embargo, estas técnicas aún no ofrecen un control preciso espacial sobre la entrega que se pueden beneficiar inmensamente miniaturizado tecnologías de alto rendimiento, estudios de células individuales y la investigación de las interacciones célula-célula. nt &quot;&gt; avances tecnológicos recientes en la administración génica han permitido alto rendimiento de transfección de células adherentes 14-23, una mayoría de los cuales utilizan electroporación microescala. electroporación Microscale ofrece espacio-temporal preciso control sobre la entrega (hasta células individuales) y se ha demostrado para lograr altas eficiencias de 19, 24-26. Además, los enfoques basados ​​en la electroporación no requieren un prolongado período de incubación (típicamente de 4 horas) con complejos de DNA y siRNA como sea necesario en los métodos químicos de transfección basados ​​en y conducir a la introducción directa de ADN desnudo y siRNA moléculas en el citoplasma de la célula. Como consecuencia la expresión génica se puede lograr tan pronto como seis horas después de la transfección 27. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente la utilización de matrices de microelectrodos (MEA) para sitio específico de transfección en cultivos celulares de mamíferos adherentes 17-19. En el enfoque basado en MEA, entrega de carga genética se logra a través de micro-escala localizada electroporatien las células. Una aplicación de pulsos eléctricos a los electrodos seleccionados genera el campo eléctrico local que conduce a la electroporación de células presentes en la región de los electrodos estimulados. El control independiente de los microelectrodos proporciona un control espacial y temporal sobre la transfección y también permite múltiples experimentos de transfección basados ​​en que se realizará en el mismo cultivo aumentando la producción experimental y la reducción de la cultura a la cultura variabilidad. Aquí se describe la configuración experimental y el protocolo para la transfección selectiva de adherentes células HeLa con un siRNA secuencia de marcado con fluorescencia codificado utilizando electroporación. El mismo protocolo también puede ser utilizado para la transfección de vectores de plásmido. Además, el protocolo aquí descrito puede extenderse fácilmente a una variedad de líneas celulares de mamíferos, con modificaciones menores. Disponibilidad comercial de los acuerdos ambientales multilaterales con modelos de electrodos tanto predefinidos y personalizados que este t técnica accesibleo La mayoría de los laboratorios de investigación con equipo básico de cultivo celular.

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High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

El artículo detalla el protocolo específico de sitio de la transfección de revueltos secuencia de siRNA en un cultivo de células adherentes de mamíferos usando una matriz de microelectrodos (MEA).

Alta eficiencia, específica del sitio La transfección de células adherentes con siRNA uso de arrays de microelectrodos (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

high-efficiency-site-specific-transfection-adherent-cells-with-sirna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

13.4K vistas.  Arizona State University. El artículo detalla el protocolo específico de sitio de la transfección de revueltos secuencia de siRNA en un cultivo de células adherentes de mamíferos usando una matriz de microelectrodos (MEA).

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Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

Entrega y transfección de genes en células humanas de cáncer de páncreas con factor de crecimiento epidérmico receptor dirigidos a base de gelatina Nanovectors Ingeniería

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Investigación

Bioingeniería

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Ingeniería bacterias adherentes mediante la creación de un único operón sintético curli

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

Características de los formados Precipitación microgeles polietilenglicol son controlados por Peso molecular de los reactivos

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

Silicio Poroso micropartículas para la entrega de siRNA Terapéutica

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

La transfección de genes hacia células Esferoide sobre placas micropatterned Cultura para el trasplante de células genéticamente modificadas

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Entrega de Therapeutic siRNA al SNC Usando catiónicos y aniónicos Los liposomas

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

El uso de la biología sintética para Ingeniero células vivas que interactúan con materiales programables

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Evaluación integral de la efectividad y seguridad de la entrega de drogas orientada a Placenta utilizando tres métodos complementarios

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...