Bu çalışma &quot;Interfaces inflamasyon&quot; Mükemmeliyet DFG-Küme (RA-Eğer, RA-D) tarafından desteklenmiştir. Biz Kristin Wischnat mükemmel teknik destek için minnettarız.

1. Chlamydia trachomatis serovar D Stok hazırlanması <ol><li> 4 ml C. ile HeLa-229 hücre içeren konfluent 175 cm 2 hücre kültürü şişesi Infect tampon SPG içinde trachomatis D. </li><li> Sürekli sarsıntı sırasında 37 ° C&#39;de bir saat inkübe edin. </li><li> % 10 FCS ve 240 ul Cycloheximide ile 20 ml DMEM ekleyin. </li><li> 37 de 48 saat süre ile nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe ° C&#39;de ve% 5 CO2. </li><li> C. ayırmak ve yok etmek için 5 ml steril cam boncuk, güçlü sarsıntı ekle HeLa-229 hücreleri barındıran trachomatis. </li><li> Süpernatant toplayın ve steril cam boncuk başka bir 5 ml ekleyin. </li><li> 1 dakika Kaya üç kez tüm HeLa-229 hücrelerini yok ve serbest C&#39;ye trachomatis. </li><li> 5 1000 RPMI dk ve 4 santrifüjleyin ° C hücresel enkaz kurtulmak için. </li><li> 8-10 175 cm 2 hücre kültürü enfeksiyonu için supernatant toplamak konfluent g şişelerHeLa 229 hücrelerle rown. </li><li> 37 az bir saat için 4 ml SPG tampon ve önceki enfeksiyondan 4 ml supernatant ° sürekli sarsıntı ile C hastası olan her şişesi inkübe edin. </li><li> Bir saat% 10 FCS ile 37 ° C ve% 5 CO2 az 48 saatlik inkübasyondan ardından 230 ul sikloheksimid ile 15 ml DMEM ekledikten sonra. </li><li> , 5 ml steril cam boncuk ekle ayırmak için sallayın ve C. yok HeLa-229 hücreleri barındıran trachomatis. </li><li> Süpernatant toplayın ve steril cam boncuk başka bir 5 ml ekleyin. </li><li> 1 dakika Kaya üç kez tüm HeLa-229 hücrelerini yok ve serbest C&#39;ye trachomatis. </li><li> 4 1000 RPMI az 5 dakika boyunca santrifüj ° C hücresel enkaz kurtulmak için. </li><li> Süpernatant toplayın. </li><li> 11000 RPMI ile 99 dakika boyunca 50 ml Falcon tüpleri, santrifüj süpernatant 40 ml doldurun. </li><li> Santrifüj sonra süpernatan atmak ve 1 ml tampon SPG ile pelet yıkayın. </li><li> Homojenizepelet -70 az 1, 5 ml Eppendorf tüp, mağaza ° C&#39;de kullanılıncaya kadar 1 ml SPG ve tablet 20 ul içinde. Hazırlanan stok biyolojik aktivite kurulu bir HeLa-229 hücre enfeksiyon modelinde doğrulandı. </li></ol> 2. İnsan Fallop Tüp hazırlanması <ol><li> Hemen RPMI hazırlık kadar 4 antibiyotik olmadan ° C% 5 FCS içeren cerrahi sonrası histerektomi geçiren kadınlarda Store&#39;dan insan fallop tüpleri (HFT). Protokolü Lübeck Üniversitesi (09-153) etik komitesi tarafından onaylandı. (53 yaşına kadar 34) çalışmaya dahil Kadınlar önceden C. öyküsü yoktu trachomatis enfeksiyonu. Fallop tüplerinin Doku sezaryen sırasında veya luteal faz semptomatik miyom nedeniyle histerektomi sırasında annenin isteği üzerine peripartum sterilizasyon toplanmıştır. Tüm HFT C. için negatif test edildi PCR ile trachomatis. </li><li> RPMI içeren Petri içinde HFT teşrihAntibiyotikler olmadan% 5 FCS. Bütün işleme sırasında doku kurumasını önlemek için ortam içine daldırılmış edilmelidir. </li><li> Kesiniz ve ameliyat sırasında tahrip bağ dokusu ve doku atın. </li><li> Diseksiyon sonra küçük bir bistüri ile dikkatlice HFT açın. </li><li> Daha ayrıntılı bilgi için deneyler x 0,5 cm yukarı 1 cm x 1 cm ile 0.5 cm büyüklüğünde doku parçalarını hazırlamak. </li><li> Enfeksiyon mağaza HFT numune için 1 ml RPMI antibiyotikler olmadan% 5 FCS içeren. HFT örneklerinin C. 5.5x10 5 IFU (dahil oluşturan birim) ile enfekte olduğunu trachomatis. </li><li> 37 içinde HFT numunesi inkübe ° C,% 5 CO2 ve% 21 O2 gibi 37 ° C,% 5 CO2 ve 2 saat süre ile% 24 O2. </li><li> İnkübasyon süresi 4 en az üç gün Monti en sabitleştirici olarak örnek ve mağaza toplamak sonra SEM / TEM hazırlık kadar ° C. </li></ol> 3. TEM için HFT Numune Hazırlanması <ol><li> IçinTEM Monti en sabitleştirici gelen örnek kaldırmak ve 4 x 5 mm adet 2 x 2 mm kesti. Geriye kalan doku SEM için kullanılabilir. </li><li> 1 saat süreyle sodyum cacodylate tamponu, pH 7.35 ile parçalara yıkanır. </li><li> % 1 (w / v) su içinde hedef osmiyum tetroksit de inkübe. gecede. </li><li> Sodyum cacodylate tamponu, pH 7.35 olarak 6x5 dakika yıkanması ile aşırı osmiyum tetroksit çıkarın. </li><li> Su içinde etanol artan yoğunluklarda (v / v) (2 saat süreyle% 30, 2 saat süreyle% 40, 2 saat süreyle% 50, 2 saat süreyle 60%, gece boyunca 70%, 2 için 80% in kuluçkaya suyu uzaklaştırmak s, 1 saat boyunca 90%, 1 saat boyunca 95%, 1 saat boyunca 100%. </li><li> Propilen oksit in 2 x 15 dakika boyunca etanol dışarı yıkanır ve daha sonra% 50 oranında bir karışımı (v / v) içinde propilen taze hazırlanmış araldit (tüm bileşenler de dahil olmak üzere) aktarmak ve bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> En az 1 saat için taze hazırlanmış araldit (tüm bileşenler de dahil olmak üzere) transfer edilir. </li><li> Düz gömme kalıpları transfer ve araldit ile doldurun. </li><li> Için araldit sertleştiriniz60 ° C&#39;de en az 48 saat </li><li> Gömülü örnek Kesimden sonra cam bıçak veya histo elmas bıçak kullanılarak bir ultramicrotome üzerine yarı ince kesitler (700 nm) kesilmiş ve Richardson ile leke leke. </li><li> Bir elmas bıçak ve bakır ızgaralar (örneğin 150 kare gözlü) transfer kullanan ultra-ince kesitler (yaklaşık 70 nm) kesin. </li><li> Aqua dest% 0.5 (w / v) uranil asetat ile ultra-ince kesitler Leke. % 3 (w / v) su hedef kurşun sitrat izledi. otomatik bir bölümü yapıcısı içinde. Alternatif olarak, bölüm ızgaraları su hedef olarak uranil asetat ile doymuş bir çözelti santrifüje üzerinde 15 dakika bırakarak elle boyanmış edilebilir. su hedef olarak% 0.3 kurşun sitrat (w / v) izledi. </li></ol> 4. SEM için HFT numune hazırlanması <ol><li> SEM epitel 1.5 x 1 cm mantar levha üzerinde yukarı bakacak şekilde Monti en fiksatörü, orient örnek kaldırmak ve böcek iğneleri kullanarak konumunu düzeltmek için. </li><li> Uygun metal sepet mantar üzerinde örnek aktarın vesodyum cacodylate tamponu, pH 7.35 olarak 30 dakika süre ile yıkanır. </li><li> Aseton / su karışımları artan konsantrasyonları (v / v) 6 saat süreyle% 30, 6 saat süre ile% 40, 8 saat boyunca 60%, gece boyunca 70%, 2 saat süreyle% 80,% 90 oranında içinde Örnek kuluçkaya suyu uzaklaştırmak Gece boyunca 2 saat ve% 100 (numune sürekli su altında tutmak son derece dikkatli olmalı). </li><li> Kritik nokta kurutma (sıcaklık 40 ° C, basıncı 80 bar) tarafından taze% 100 aseton ve kuru numune transfer. </li><li> Iletken karbon çimento kullanarak bir iletken karbon sekmesi ile donatılmış SEM numune montaj bakacak şekilde epitel ile iğne, mantar ve tutkal örnek çıkarın. Montaj ve iletken karbon sekmesini arasındaki iletkenliği artırmak için sıvı iletken gümüş kullanın. </li><li> Bir lak sputter kullanılan numunenin iletken bir platin, altın veya paladyum kaplama hazırlayın. </li></ol> 5.. Richardson&#39;ın Leke Yarı İnce Kesitler boyanması <ol><li> Slaytta yarı ince kesitler kurumasını bekleyin. </li><li> 1-2 dakika süreyle 60 ° C sıcaklıkta çözelti boyama ile bölümlere leke. </li><li> Aqua dest yıkayın. </li><li> Kuru bölümleri ve kapak. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Insan fallop tüpü enfeksiyonu modeli içinde biz enfekte olmayan kontroller (Şekil 1) ve C arasında epitelyal morfoloji farklılıklar görselleştirmek başardık trachomatis - normoksik koşul altında enfekte tüpleri (Şekil 2). Karakteristik morfolojik farklılıklar enfekte olmayan kontroller tespit edilemedi fallop tüpü epitel hücrelerinin patojen bağlı şişme ve lizis ima etti. Yarı ince kesit ve transmisyon elektron mikroskobu kullanarak bizim hücre içi C ispat başardık insan fallop tüpü doku enfekte ex vivo trachomatis dahil oluşumu (Şekil 3, 5) ancak enfekte olmayan kontrollerde (Şekil 4). Oksijen konsantrasyonu gibikadın genital yollarında ASIZ biz de hipoksik koşullarda bizim modeli incelenmiştir inflamatuar sürecinde fizyolojik koşullarda 11 ve daha fazla azalma altında zaten düşük. Ön sonuçlar modeli oksijen biyokatalist altında klamidyal büyüme ve döl analiz etmek yararlı olduğunu göstermektedir. Chlamydia-indüklenen epitel hücre hasarına enfeksiyonu önce fallop tüpleri (Şekil 6) dikkatsizce kullanımı ve kullanım aracılığı ile ortaya eserler ayrılması gerekir. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Kontrolü ortamda bir gün inkübasyon (yeşil ok silli hücre, mavi ok olmayan silli hücre hepsini göster) sonra enfekte olmayan insan fallop elektron mikroskobu (SEM). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Tarama elektron mikro<html> insan fallop tüpü bir gün sonrası enfeksiyon (beyaz ok işareti rüptüre dahil) enfekte bir ex vivo C. trachomatis kopyası (SEM). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Yarı ince kesitler C ile insan tuba enfeksiyondan sonra tipik intraselüler inklüzyon (beyaz oklar) 1d göstermek trachomatis ex vivo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Kontrolü ortamda bir gün inkübasyondan sonra non-enfekte insan tuba transmisyon elektron mikroskobu (TEM). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Bir ex vivo C. Şekil 5. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) trachomatis insan fallop tüpü bir gün sonrası enfeksiyon (beyaz oklar klamidyal kapanım işaretleyin) bulaşmış. ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6. Numunenin dikkatsizce hazırlama ve işleme (beyaz ok işareti epitel doku tahrip) yoluyla zarar fallop tüpü epitelin elektron mikroskobu (SEM).

<ol>
	<li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping.">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li><li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility.">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li><li>Peipert, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Genital+chlamydial+infections.">Clinical practice. Genital chlamydial infections.</a> N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).</li><li>Mardh, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubal+factor+infertility,+with+special+regard+to+chlamydial+salpingitis.">Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).</li><li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells.">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55 (2006).</li><li>Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gamma+interferon-mediated+antichlamydial+defense+mechanisms+in+human+and+mouse+cells.">Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells.</a> Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li><li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection.">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li><li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo.">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li><li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin.">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li><li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring.">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Enfekte dokuya patojen ile endüklenen zarar görselleştirme zahmetli ve farelerde deney prosedürleri genellikle sınırlı değildir. Biz C. analiz etmek, insan fallop tüpleri bir ex vivo enfeksiyon modelinde kurulan Üst kadın genital sistem enfeksiyonları trachomatis. Bu metodun kullanılması suretiyle, C. görsel mümkün olduğu trachomatis - bir gün sonrası enfeksiyon içinde insan fallop tüpü epitel hasarını. Hücresel şişme ve lizis C. gözlendi tipik morfolojik değişiklikler vardı trachomatis - enfekte fallop tüpleri ancak enfekte olmayan kontrol. TEM analizleri klamidyalar yeniden farklılaşmış temel organları değil, aynı zamanda kalıcılık gösterebilir genişlemiş retiküler organları ile küçük inklüzyonlar büyük inklüzyonları gösteren, enfekte dokuların içinde tipik bir hücre içi gelişim döngüsünü gerçekleştirirken ortaya koymuştur. Ancak tek başına morfolojik resmi repl arasında ayrım yeterli değilazalmış metabolizma ile karakterize edilir ve icating ve inatçı enfeksiyonlar, antibiyotik 10 dayanıklılığı artar. Enfekte fallop tüpleri epitel tahribatı C. bozulması için iki nedeni trachomatis - hücre içi gelişim döngüsü ve enfeksiyöz elementer cisimlerin serbest bırakılması veya pro-inflamatuvar 8 sürümü tamamlanmasından sonra enfekte olmuş epitel hücreleri. Patojen bağlı doku hasarı ve C&#39;ye karşı konak bağlı immün reaksiyonlar trachomatis epitel hücre fonksiyonu, fibroblast şekillenmesi ve in vivo 8,11 nihayet tubal kaybına yol açan başlıca faktörler olması gerekiyordu. Bu model önemli kısıtlamaları biri başlangıç ​​C. sekonder etkileri analizi engellemektedir inflamatuar hücrelerin yokluğudur Fallop tüpü epitel trachomatis enfeksiyonu. Bununla birlikte, modeli ap olduğufarklı çevresel koşullarda (örneğin oksijen içeriği) ve akut C. ilk ana-immün yanıtı araştırmak için propriate trachomatis enfeksiyonları 8,9. Daha planları C&#39;ye karşı antibiyotik test için bir model oluşturmaktır Tüm insan fallop tüpleri ve 2-foton lazer tarama mikroskop ile tuba epiteli gözlenen farklı gelişim aşamalarında metabolik durumları karakterize etmek trachomatis.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-802 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma - Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampon SPG </td><td> çeşitli </td><td></td><td> aşağıdaki tarife bakınız </td></tr><tr><td> Monti en fiksatif </td><td> çeşitli </td><td></td><td> aşağıdaki tarife bakınız </td></tr><tr><td> sodyum cacodylate tampon </td><td> çeşitli </td><td></td><td> aşağıdaki tarife bakınız </td></tr><tr><td> Richardson en leke </td><td> çeşitli </td><td></td><td> aşağıdaki tarife bakınız </td></tr></tbody></table> Tarifler: 1. Tampon SPG <ol><li> 75 g sakaroz ekleyin. </li><li> 2.47 g disodyum fosfat ekleyin. </li><li> 0.36 g monosodyum fosfat ekleyin. </li><li> 0.72 g glutamik asit ekleme. </li><li> Aqua dest ile 1 l doldurun. </li><li> 7.3 pH ayarlayın. </li></ol> 2. 0.1 M sodyum cacodylate tamponu, pH 7.35. <ol><li> 42.80 g dimethylarsenic asit sodyum tuzu ekleyin. </li><li> 68.46 g sakaroz ekleyin. </li><li> Aqua dest ile 1 l doldurun. 0.2 M sodyum cacodylate tamponu almak için. </li><li> Aqua dest ile çözelti kullanmadan önce. istenen konsantrasyonu ve 7,35 gerekirse üzere pH&#39;ı ayarlamak için. </li></ol> 3. Monti en fiksatif <ol><li> 156 ml 0,12 M sodyum cacodylate tamponunu ekleyin. 3,2 su hedef olarak 25 mL% 25 Glutaraldehit ekleyin. </li><li> 19 ml ekleAqua dest% 10 paraformaldehit. </li><li> Aqua dest 3 ml% 3 CaCI2 ekleyin. </li><li> 7,35 pH ayarlayın ve aqua dest ile doldurun. 312 ml nihai bir çözüm için. </li></ol> 4. Richardson&#39;ın leke <ol><li> Aqua dest% 1 sulu boraks çözeltisi ve% 1 Azur II% 1 metilen mavisi eşit hacimde karıştırılır. </li></ol>

a human fallopian tube model for investigation of c. trachomatis infections

Chlamydia trachomatis ile genital sistem enfeksiyonları (C. trachomatis) tüm dünyada kadınlarda en sık görülen cinsel yolla bulaşan hastalık vardır. Patojenlerin Verimsiz klirensi veya kalıcılık üst genital sistem enfeksiyonları artan ve enfekte dokuların 1,2 kronik inflamatuar zarar gerekiyordu yol açabilir. Sonuç olarak, pelvik inflamatuar hastalık (PID), tubal oklüzyon ve infertilite gibi ciddi klinik sekeller 3,4 oluşabilir. C ile araştırmaların çoğu trachomatis epitel hücre çizgilerinden (örneğin HEp-2 hücreleri ve HeLa-229) veya farelerde yapılmıştır. Bununla birlikte, hücre kültürü bazlı modelleri ile olduğu gibi, ne de ana doku fizyolojisini ya da C&#39;nin patofizyolojisini yansıtır yok in vivo 5 trachomatis genital sistem enfeksiyonları. Başka sınırlamalar gerçeği ile verilir, merkez sinyal şelaleri (ör. IFN-γ mediatintrasellüler klamidyal büyümesini kontrol ed JAK / STAT sinyal yolağı) temelde farelerde ve insanlarda 6,7 arasında farklılık. Biz ve diğerleri, bu nedenle C arasında doğrudan etkileşimleri araştırmak için bütün bir organın fallop tüpü model oluşturdu trachomatis ve insan fallop tüpü hücrelerinin ex vivo 8,9. Bu amaçla, histerektomi geçiren kadınlarda insan fallop tüpleri C ile toplanır ve enfekte edildi 24 saat sonrası enfeksiyon içinde trachomatis serovar D., örnek nerede Chlamydia trachomatis algılamak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak epitel hasarı gibi aracılık analiz C. Fallop dokusunda trachomatis dahil oluşumu.

Watch this Scientific Journal Video about A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections at JoVE.com

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Biz bir tarif<em&gt; Ex vivo enfeksiyon</emInsan fallop tüpü hücreleri ile bakteriyel patojenler doğrudan etkileşim görselleştirme&gt; modeli. Tüm organ doku modeli araştırmak için kuruldu<em&gt; C. trachomatis</em&quot;Hayat&quot; gibi koşullar altında kadın fallop tüpüne&gt; bağlı patoloji.

Incelenmesi için İnsan Fallop Tüp Modeli<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Enfeksiyonlar

Genital tract infections with Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) are the most frequent transmitted sexually disease in women worldwide. Inefficient ...

a-human-fallopian-tube-model-for-investigation-c-trachomatis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

12.9K Görüntüleme.  University of Lübeck. Biz bir tarif Ex vivo enfeksiyon modeli. Tüm organ doku modeli araştırmak için kuruldu C. trachomatis bağlı patoloji.

Video: A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. Infective eggs are given by oral gavage, hatch in the distal small intestine, invade the intestinal epithelial cells (IECs) 
that line the crypts of the cecum and proximal colon and upon maturation the worms release eggs into the environment1. This model is a powerful tool to 
examine factors that control CD4+ T helper (Th) cell activation as well as changes in the intestinal epithelium. The immune response that occurs in 
resistant inbred strains, such as C57BL/6 and BALB/c, is characterized by Th2 polarized cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13) and expulsion of worms while Th1-associated 
cytokines (IL-12, IL-18, IFN-&gamma;) promote chronic infections in genetically susceptible AKR/J mice2-6. Th2 cytokines promote physiological changes in 
the intestinal microenvironment including rapid turnover of IECs, goblet cell differentiation, recruitment and changes in epithelial permeability and smooth muscle 
contraction, all of which have been implicated in worm expulsion7-15. Here we detail a protocol for propagating Trichuris muris eggs which can 
be used in subsequent experiments. We also provide a sample experimental harvest with suggestions for post-infection analysis. Overall, this protocol will provide 
researchers with the basic tools to perform a Trichuris muris mouse infection model which can be used to address questions pertaining to Th proclivity in 
the gastrointestinal tract as well as immune effector functions of IECs.

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris infection is an intestinal model of Th2 immunity where resistant mice generate a protective Th2 response and susceptible mice generate a pathological Th1 response.

Trichuris muris Enfeksiyon: Gut Tip 2 Bağışıklık ve İnflamasyon Bir Model

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo cancer models. The chicken chorioallantoic membrane (CAM) model provides an inexpensive, rapid alternative that permits direct visualization of tumor development and is suitable for in vivo imaging. As such, we sought to develop an optimized protocol for engrafting gynecological and urological tumors into this model, which we present here. Approximately 7 days postfertilization, the air cell is moved to the vascularized side of the egg, where an opening is created in the shell. Tumors from murine and human cell lines and primary tissues can then be engrafted. These are typically seeded in a mixture of extracellular matrix and medium to avoid cellular dispersal and provide nutrient support until the cells recruit a vascular supply. Tumors may then grow for up to an additional 14 days prior to the eggs hatching. By implanting cells stably transduced with firefly luciferase, bioluminescence imaging can be used for the sensitive detection of tumor growth on the membrane and cancer cell spread throughout the embryo. This model can potentially be used to study tumorigenicity, invasion, metastasis, and therapeutic effectiveness. The chicken CAM model requires significantly less time and financial resources compared to traditional murine models. Because the eggs are immunocompromised and immune tolerant, tissues from any organism can potentially be implanted without costly transgenic animals (e.g., mice) required for implantation of human tissues. However, many of the advantages of this model could potentially also be limitations, including the short tumor generation time and immunocompromised/immune tolerant status. Additionally, although all tumor types presented here engraft in the chicken chorioallantoic membrane model, they do so with varying degrees of tumor growth.

We present the chicken chorioallantoic membrane model as an alternative, transplantable, in vivo model for the engraftment of gynecological and urological cancer cell lines and patient-derived tumors.

Jinekolojik ve Ürolojik Kanserleri Incelemek Için Vivo Modelinde Tavuk Chorioallantoic Membran Kullanma

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Kanser Araştırmaları

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

Ileri Genetik Yaklaşımlar<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Gelişim Biyolojisi

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

İdrar yolu enfeksiyonu küçük bir hayvan modeli: erkek ve dişi farelerin transüretral Kateterizasyon

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

An Efficient Method for Extracting Human Fallopian Tube Epithelia for Single-cell Analyses

Human fallopian tubes are intrinsic to reproduction. The purpose of the fallopian tubes is to allow for the transit of sperm, the ovum, and if fertilization is successful, the embryo. The epithelial cells that line the inner surface of fallopian tubes are integral to both normal and abnormal fallopian tube processes, including disease initiation. After menopause, fallopian tubes cease to have a significant role in the body and the intraepithelial cell makeup changes. We describe a method in which these epithelial cells can be isolated from fresh fallopian tubes with minimal stromal cell contamination into a single-cell suspension. These cells can be grown in culture or used for further analysis such as flow cytometry and single-cell RNA sequencing. This isolation protocol can be achieved in 4-6 h and yields viable cells that can be used for immediate downstream analysis. This efficient protocol facilitates the isolation of fallopian tube epithelial cells with an enriched epithelial population.

This protocol describes a one-day method for the isolation of human fallopian tube epithelial cells. Isolated epithelial cells can be plated in 2-dimensional (2D) culture or dissociated into single-cell suspensions and utilized in downstream experiments, including flow cytometry and single-cell RNA sequencing.

Tek Hücreli Analizler için İnsan Fallop Tüpü Epitelinin Çıkarılması İçin Etkili Bir Yöntem

Human fallopian tubes are intrinsic to reproduction. The purpose of the fallopian tubes is to allow for the transit of sperm, the ovum, and if ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Biyoloji

Tubal Cytology of the Fallopian Tube as a Promising Tool for Ovarian Cancer Early Detection

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to the lack of markers or tools for the ovarian cancer identification, the early detection of HGSC remains challenging. Direct sampling of the fallopian tube can enhance sensitivity for detection of neoplastic cells when the tumor is not grossly visible. We developed a procedure to collect fallopian tube cells directly from freshly received surgical specimens, which has shown excellent correlation with histological findings. This approach lays a foundation for the future utility of minimally invasive laparoscopic screening in high-risk patient populations.

We explored a tubal cytologic method by sampling the fallopian tube directly post-surgical excision as a tool of ovarian cancer early detection. Here, we present a protocol to collect fallopian tube cells from freshly received surgical specimens.

Yumurtalık Kanseri Erken Teşhisi İçin Umut Verici Bir Araç Olarak Fallop Tüpünün Tubal Sitolojisi

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to ...

Tıp

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Incelenmesi için İnsan Fallop Tüp Modeli

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler