עבודה זו נתמכה על ידי Cluster-DFG של אקסלנס &quot;דלקת ממשקים&quot; (RA-אם, RA-D). אנו אסירי תודה על הסיוע הטכני מצוין של קריסטין Wischnat.

1. הכנת מאגר כלמידיה Serovar trachomatis D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק confluent 175 ס&quot;מ 2 תאים התרבות בקבוק המכיל הלה-229 תאים עם 4 מ&quot;ל ג trachomatis פ SPG המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה למשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס במהלך הרעידות קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מ&quot;ל DMEM עם FCS 10% ו 240 Cycloheximide μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של חממה humidified עבור H 48 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל חרוזי זכוכית סטריליות, לוחצים חזק לנתק ולהרוס ג trachomatis מחסה הלה-229 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant ולהוסיף עוד 5 מ&quot;ל של חרוזי זכוכית סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוק שלוש פעמים דקות 1 להשמיד את כל-229 הלה תאים ושחרור ג trachomatis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 rpmi ו 4 ° C כדי לסלק פסולת תאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant לזיהום של 8 עד 10 175 התרבות 2 ס&quot;מ תא צלוחיות גרם confluentrown עם הלה 229 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל בקבוק עם חיץ 4 מ&quot;ל SPG ו 4 supernatant מ&quot;ל מזיהום הקודם למשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עם הרעידות קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה מוסיפים 15 מ&quot;ל DMEM עם FCS 10% ו 230 cycloheximide μl ואחריו הדגירה 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל חרוזי זכוכית מעוקרים, ללחוץ לנתק ולהרוס ג trachomatis מחסה הלה-229 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant ולהוסיף עוד 5 מ&quot;ל של חרוזי זכוכית סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוק שלוש פעמים דקות 1 להשמיד את כל-229 הלה תאים ושחרור ג trachomatis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 rpmi ב 4 ° C כדי לסלק פסולת תאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי 40 מ&quot;ל של supernatant ב -50 צינורות מ&quot;ל פלקון, צנטריפוגות דקות 99 עם 11000 rpmi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה לבטל supernatant ולשטוף גלולה עם 1 מ&quot;ל SPG המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenizeגלולה ב SPG 1 מ&quot;ל ו - 20 μl aliquot ב 1, 5 מ&quot;ל חנות Eppendorf צינור, ב -70 ° C עד השימוש. הפעילות הביולוגית של מלאי מוכן אושר מודל הוקמה הלה-229 זיהום התא. </li></ol> 2. הכנת החצוצרות האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החנות אדם צינורות השחלה (HFT) של נשים שעברו כריתת רחם מיד לאחר הניתוח RPMI FCS המכיל 5% ללא אנטיביוטיקה ב 4 ° C עד הכנה. פרוטוקול שאושר על ידי ועדת אתיקה של אוניברסיטת ליבק (09-153). הנשים שנכללו במחקר (גיל 34 עד 53) ללא היסטוריה של ג לפני trachomatis זיהום. רקמות של החצוצרות נאסף על עיקור peripartum על פי בקשה של האם במהלך חלקים קיסרי או במהלך כריתת רחם עקב שרירנים ברחם סימפטומטיים בשלב הלוטאלי. HFT הכל נבדקו שלילי ג trachomatis ידי PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח HFT בצלחת פטרי שמכילה RPMI עם5% FCS ללא אנטיביוטיקה. במהלך עיבוד כל רקמה יש שקוע התקשורת כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנותקים וזורקים רקמות רקמת חיבור והרסו במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דיסקציה לפתוח את HFT בזהירות עם אזמל קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשך הניסויים להכין חתיכות של רקמות בגודל של 0.5 ס&quot;מ X 0.5 ס&quot;מ עד 1 ס&quot;מ x 1 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדגימה חנות זיהום HFT ב 1 מ&quot;ל RPMI המכיל FCS 5% ללא אנטיביוטיקה. דגימות HFT נדבקו 5.5x10 5 IFU (הכללה יוצרי יחידות) של C. trachomatis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימה HFT ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו - 21% מ 2, כמו גם 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו - 2% O 2 במשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן דגירה לאסוף הדגימה חנות מקבע של מונטי לפחות שלושה ימים ב 4 ° C עד הכנה SEM / TEM. </li></ol> 3. אופן ההכנה של הדגימה HFT עבור TEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבורTEM להסיר דגימה מן מקבע של מונטי וחותכים 2 X 2 מ&quot;מ עד 4 x 5 מ&quot;מ חתיכות. רקמת הנותרים יכולים לשמש עבור SEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את חתיכות עם חיץ נתרן cacodylate, pH 7.35 עבור H 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של% 1 (W / V) tetroxide אוסמיום ב אקווה dest. בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר tetroxide אוסמיום עודף ידי שטיפה דקות 6x5 במאגר נתרן cacodylate, pH 7.35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של מים על ידי דוגרים בריכוזים הולכים וגדלים של אתנול במים (V / V) (30% עבור 2 שעות, 40% עבור 2 שעות, 50% עבור 2 שעות, 60% עבור 2 שעות, 70% בין לילה, 80% עבור 2 ח, 90% עבור H 1, 95% עבור H 1, 100% עבור H 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את אתנול דקות 2 15 x ב פרופילן אוקסיד ולאחר מכן להעביר תערובת של 50% (V / V) araldite מוכן טרי (כולל כל הרכיבים) על פרופילן דגירה בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה araldite מוכן טרי (כולל כל הרכיבים) עבור שעות לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר תבניות הטבעת שטוחים וממלאים araldite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו araldite להקשות עללפחות 48 שעות ב 60 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חיתוך של מדגם מוטבע לחתוך חלקים דקים חצי (700 ננומטר) על ultramicrotome באמצעות סכינים זכוכית או סכין יהלום histo ואת כתם עם כתם של ריצ&#39;רדסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור דקים חלקים (כ -70 ננומטר) באמצעות סכין יהלום והעברה רשתות נחושת (למשל 150 רשת הריבוע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם דקים חלקים עם אצטט uranyl 0.5% (W / V) של אקווה dest. עקבו ב -3% (w / v) ציטראט להוביל אקווה dest. ב שטיינר בסעיף אוטומטי. לחלופין, ניתן לזהות קטעים מוכתמת באופן ידני על ידי השארת רשתות 15 דק &#39;על פתרון centrifuged רווי של אצטט uranyl ב אקווה dest. ואחריו ציטראט עופרת 0.3% (W / V) של אקווה dest. </li></ol> 4. הכנת הדגימה HFT עבור SEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור SEM להסיר דגימה מן מקבע של מונטי, המזרח עם אפיתל כלפי מעלה על 1.5 x גיליון 1 הפקק ס&quot;מ ולתקן המיקום באמצעות מחטים חרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הדגימה על הפקק כדי סלי מתכת מתאימיםלשטוף למשך 30 דקות במאגר נתרן cacodylate, pH 7.35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של מים על ידי דוגרים הדגימה ריכוז גדל והולך של אצטון / מים תערובות (V / V) 30% עבור 6 שעות, 40% עבור 6 שעות, 60% עבור 8 שעות, 70% בין לילה, 80% עבור 2 שעות, 90% עבור 2 שעות ו - 100% על הלילה (להיות זהירים מאוד כדי לשמור על הדגימה שקוע ברציפות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה אצטון 100% טרי הדגימה יבש על ידי ייבוש נקודה קריטית (טמפרטורה 40 ° C, לחץ 80 בר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מחטים, הפקק הדגימה דבק עם האפיתל כלפי מעלה בהר הדגימה SEM מצוידים הכרטיסייה פחמן מוליך באמצעות מלט פחמן מוליך. השתמש כסף מוליך נוזלי כדי לשפר את המוליכות בין הר ואת הכרטיסייה פחמן מוליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין ציפוי מוליך, זהב או פלטינה ופלדיום של הדגימה באמצעות גמגום coater. </li></ol> 5. מכתים סעיפים דקים דו עם הכתם של ריצ&#39;רדסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו חלקים דקים חצי יבש בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם חלקים עם מכתים פתרון על 60 מעלות צלזיוס במשך 1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרחץ אקווה dest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטעים יבשים coverslip. </li></ol> 6. נציג תוצאות בתוך המודל הדבקת בני אדם השחלה צינור הצלחנו לדמיין הבדלים מורפולוגיה אפיתל בין שאינם נגועים שולטת (איור 1) ו ג trachomatis - שפופרות נגועות (איור 2) בתנאי normoxic. ההבדלים המורפולוגיים האופייניים משתמעת הפתוגן הנגרמת הנפיחות תמוגה של תאים החצוצרה אפיתל כי לא ניתן היה לזהות שאינם נגועים שולטת. באמצעות סעיפים דקים חצי אלקטרונים מיקרוסקופית הילוכים הצלחנו להוכיח ג תאיים הכללת trachomatis היווצרות in vivo לשעבר נגוע צינור האדם רקמות השחלה (איור 3, 5), אך לא בלתי נגועים שולטת (איור 4). כמו ריכוז החמצןtions בדרכי המין הנשי כבר נמוכה בתנאים פיסיולוגיים 11, ולהפחית עוד יותר בתהליך דלקתי כמו כן, אנו לחקור המודל שלנו בתנאי חוסר חמצן. תוצאות ראשוניות מצביעות מודל שימושי לנתח גידול הצאצאים כלמידיה ותחת חמצן בריכוזים שונים. כלמידיה הנגרמת נזק לתאים אפיתל יש להיפרד חפצים מתווכים דרך הכנת טיפול זהיר של החצוצרות לפני הזיהום (איור 6). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של השחלה הלא נגוע האדם לאחר הדגירה יום אחד בינוני הביקורת (החץ הירוק מראה תא ריסי, החץ הכחול מראה שאינו ריסי התא). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. סריקת אלקטרונים MICROS<html> עותק (SEM) של trachomatis vivo ג לשעבר נגוע החצוצרה האדם 1 הודעה ביום זיהום (הכללה לבן החץ סימן מקרע). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="איור 3" /> באיור 3. סעיפים דקים דו להראות תכלילים תאיים אופיינית (חיצים לבנים) 1D לאחר ההדבקה של חצוצרת הרחם האנושי עם ג לשעבר trachomatis vivo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. הילוכים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) של צינור שאינו נגוע השחלה אדם לאחר הדגירה יום אחד במדיום שליטה. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. הילוכים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) של vivo לשעבר ג trachomatis נגוע החצוצרה האדם 1 הודעה ביום זיהום (חיצים לבנים מסמנים תכלילים כלמידיה). ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של האפיתל החצוצרה נזק תוך הכנת טיפול זהיר של הדגימה (לבן חיצים סימן יחסל את רקמת אפיתל).

<ol>
	<li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping.">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li><li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility.">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li><li>Peipert, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Genital+chlamydial+infections.">Clinical practice. Genital chlamydial infections.</a> N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).</li><li>Mardh, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubal+factor+infertility,+with+special+regard+to+chlamydial+salpingitis.">Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).</li><li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells.">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55 (2006).</li><li>Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gamma+interferon-mediated+antichlamydial+defense+mechanisms+in+human+and+mouse+cells.">Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells.</a> Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li><li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection.">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li><li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo.">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li><li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin.">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li><li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring.">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

ויזואליזציה של פגיעה הפתוגן הנגרמת לרקמה הנגועה הוא קשה ומוגבל קרובות להליכים ניסויים בעכברים. הקמנו מודל לשעבר זיהום vivo של החצוצרות האדם לנתח ג trachomatis זיהומים של דרכי המין הנשי העליון. על ידי שימוש בשיטה זו, הצלחנו לדמיין ג trachomatis - הנזק הנגרם על אפיתל האדם החצוצרה תוך זיהום פוסט אחד ביום. נפיחות תמוגה הסלולר היו שינויים מורפולוגיים אופייניים שנצפו ב C. trachomatis - החצוצרות נגועים אך לא בלתי נגועים שולטת. ניתוחים TEM גילה כי chlamydiae ליישם מחזור טיפוסי התפתחותי תאיים בתוך רקמות נגועות, מראה גדולה עם תכלילים מחדש הבדיל הגופים היסודיים, אלא גם תכלילים קטנים עם גופים reticulate מוגדלים שעשוי להצביע על ההתמדה. עם זאת, את התמונה המורפולוגית לבדו אינו מספיק כדי להבחין בין replזיהומים icating ומתמשך, המאופיינים חילוף החומרים מופחת גדל התנגדות antimicrobials 10. הרס של רקמת האפיתל של החצוצרות הוא נגוע או בשל שיבוש ג trachomatis - לתאי האפיתל נגוע לאחר השלמת מחזור ההתפתחות תאיים ושחרור של הגוף יסודיים זיהומיות או שחרור של ציטוקינים דלקתיים Pro-8. מחולל המחלה הנגרמת לרקמה נזק המארח המושרה תגובות חיסוניות נגד ג trachomatis אמורים להיות הגורמים העיקריים שהובילו אובדן תפקוד תא אפיתל, שיפוץ פיברובלסטים ועקרות תובל בסופו של דבר in vivo 8,11. אחת המגבלות העיקריות של מודל זה הוא העדר תאים דלקתיים אשר מעכבת את ניתוח של השפעות משניות על ג הראשונית trachomatis זיהום של האפיתל החצוצרה. עם זאת, המודל הוא APpropriate לחקור תנאים סביבתיים שונים (לדוגמא: תכולת החמצן) ואת התגובה הראשונית מארח חיסונית חריפה ג trachomatis זיהומים 8,9. תוכניות נוספות הן לבסס מודל לבדיקה של antimicrobials נגד ג trachomatis על שלמות החצוצרות אדם לאפיין את חילוף החומרים של מדינות בשלבי התפתחות שונים שנצפו האפיתל תובל על ידי מיקרוסקופ 2-פוטון סריקת לייזר.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-802 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> ת 15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> סיגמא - אולדריץ&#39; </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPG מאגר </td><td> שונים </td><td></td><td> ראו מתכון בהמשך </td></tr><tr><td> מונטי של מקבע </td><td> שונים </td><td></td><td> ראו מתכון בהמשך </td></tr><tr><td> cacodylate נתרן חיץ </td><td> שונים </td><td></td><td> ראו מתכון בהמשך </td></tr><tr><td> Rשל כתם ichardson </td><td> שונים </td><td></td><td> ראו מתכון בהמשך </td></tr></tbody></table> מתכונים: 1. SPG מאגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 75 גרם סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.47 גר &#39;הרכב: פוספט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.36 גר &#39;מונוסודיום פוספט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.72 גרם חומצה גלוטמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי 1 ליטר עם אקווה dest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH 7.3. </li></ol> 2. 0.1 cacodylate M חיץ נתרן, pH 7.35. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 42.80 גרם נתרן dimethylarsenic מלח חומצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 68.46 גרם סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי 1 ליטר עם אקווה dest. כדי לקבל 0.2 נתרן M חיץ cacodylate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש פתרון לדלל עם אקווה dest. כדי הרצויה ריכוז ולהתאים את ה-pH 7.35 במידת הצורך. </li></ol> 3. מונטי של מקבע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 156 מ&quot;ל 0.12 cacodylate M חיץ נתרן. 3.2 הוסף 25 מ&quot;ל glutardialdehyde 25% אקווה dest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 19 מ&quot;לParaformaldehyde 10% אקווה dest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל 3 CaCl 2% בשנת אקווה dest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH 7.35 וממלאים אקווה dest. לפתרון 312 מ&quot;ל הסופי. </li></ol> 4. כתם של ריצ&#39;רדסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים חלקים שווים של כחול מתילן 1% 1% בתמיסה מימית בורקס ו 1% Azur השנייה אקווה dest. </li></ol>

a human fallopian tube model for investigation of c. trachomatis infections

זיהומים בדרכי המין עם trachomatis כלמידיה (trachomatis ג) הם השכיח ביותר למחלות המועברות במגע מיני בקרב נשים ברחבי העולם. אישור התמדה בלתי יעיל או של פתוגנים עלולים להוביל עולה דלקות בדרכי המין העליון אמורים לגרום לנזק דלקתית כרונית 1,2 רקמות נגועים. כתוצאה מכך, sequelae קליני קשה כמו מחלה דלקתית של אגן הירכיים (PID), חסימת חצוצרות ו פוריות עלולה להתרחש 3,4. רוב המחקר עם ג trachomatis נערך על שורות תאים אפיתל (למשל הממולחים, 2 תאים והלה-229) או בעכברים. עם זאת, כמו התרבות תאים מבוססי מודלים, הם עושים לא משקפים את הפיזיולוגיה של רקמת יליד ולא פתופיזיולוגיה של C. המין trachomatis זיהומים בדרכי in vivo 5. מגבלות נוספות ניתנות על ידי העובדה כי איתות מפלי מרכזיים (למשל IFN-γ mediatאד Jak / מסלול איתות STAT) כי הצמיחה לשלוט כלמידיה תאיים שונים באופן בסיסי בין עכברים ובני אדם 6,7. אנחנו ואחרים הקימו ולכן האיבר כולו השחלה מודל צינור לחקור אינטראקציות ישירות בין ג trachomatis האדם תאים צינור השחלה לשעבר vivo 8,9. לשם כך, החצוצרות אדם מן הנשים שעברו כריתת רחם נאספו נגוע ג trachomatis serovar ד זיהום בתוך 24 שעות הודעה, הדגימה שבו ניתח באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ו במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) כדי לזהות trachomatis כלמידיה בתיווך נזק אפיתל, כמו גם ג הכללת trachomatis היווצרות של רקמת השחלה.

Watch this Scientific Journal Video about A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections at JoVE.com

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

אנו מתארים<em&gt; לשעבר vivo זיהום</em&gt; מודל הדמיה של אינטראקציות ישירות עם חיידקים פתוגנים אנושיים לתאי החצוצרה. דגם כל רקמות איבר הוקמה כדי לחקור<em&gt; ג trachomatis</em&gt; המושרה הפתולוגיה כדי חצוצרת הרחם הנשי תחת &quot;כמו החיים&quot; התנאים.

דגם האדם החצוצרה לחקירות<em&gt; ג trachomatis</em&gt; זיהומים

Genital tract infections with Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) are the most frequent transmitted sexually disease in women worldwide. Inefficient ...

a-human-fallopian-tube-model-for-investigation-c-trachomatis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

12.9K Views.  University of Lübeck. אנו מתארים לשעבר vivo זיהום מודל הדמיה של אינטראקציות ישירות עם חיידקים פתוגנים אנושיים לתאי החצוצרה. דגם כל רקמות איבר הוקמה כדי לחקור ג trachomatis המושרה הפתולוגיה כדי חצוצרת הרחם הנשי תחת "כמו החיים" התנאים.

Video: A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. Infective eggs are given by oral gavage, hatch in the distal small intestine, invade the intestinal epithelial cells (IECs) 
that line the crypts of the cecum and proximal colon and upon maturation the worms release eggs into the environment1. This model is a powerful tool to 
examine factors that control CD4+ T helper (Th) cell activation as well as changes in the intestinal epithelium. The immune response that occurs in 
resistant inbred strains, such as C57BL/6 and BALB/c, is characterized by Th2 polarized cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13) and expulsion of worms while Th1-associated 
cytokines (IL-12, IL-18, IFN-&gamma;) promote chronic infections in genetically susceptible AKR/J mice2-6. Th2 cytokines promote physiological changes in 
the intestinal microenvironment including rapid turnover of IECs, goblet cell differentiation, recruitment and changes in epithelial permeability and smooth muscle 
contraction, all of which have been implicated in worm expulsion7-15. Here we detail a protocol for propagating Trichuris muris eggs which can 
be used in subsequent experiments. We also provide a sample experimental harvest with suggestions for post-infection analysis. Overall, this protocol will provide 
researchers with the basic tools to perform a Trichuris muris mouse infection model which can be used to address questions pertaining to Th proclivity in 
the gastrointestinal tract as well as immune effector functions of IECs.

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris infection is an intestinal model of Th2 immunity where resistant mice generate a protective Th2 response and susceptible mice generate a pathological Th1 response.

Trichuris muris זיהום: מודל של חסינות סוג 2, דלקת במעיים

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Immunology and Infection

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo cancer models. The chicken chorioallantoic membrane (CAM) model provides an inexpensive, rapid alternative that permits direct visualization of tumor development and is suitable for in vivo imaging. As such, we sought to develop an optimized protocol for engrafting gynecological and urological tumors into this model, which we present here. Approximately 7 days postfertilization, the air cell is moved to the vascularized side of the egg, where an opening is created in the shell. Tumors from murine and human cell lines and primary tissues can then be engrafted. These are typically seeded in a mixture of extracellular matrix and medium to avoid cellular dispersal and provide nutrient support until the cells recruit a vascular supply. Tumors may then grow for up to an additional 14 days prior to the eggs hatching. By implanting cells stably transduced with firefly luciferase, bioluminescence imaging can be used for the sensitive detection of tumor growth on the membrane and cancer cell spread throughout the embryo. This model can potentially be used to study tumorigenicity, invasion, metastasis, and therapeutic effectiveness. The chicken CAM model requires significantly less time and financial resources compared to traditional murine models. Because the eggs are immunocompromised and immune tolerant, tissues from any organism can potentially be implanted without costly transgenic animals (e.g., mice) required for implantation of human tissues. However, many of the advantages of this model could potentially also be limitations, including the short tumor generation time and immunocompromised/immune tolerant status. Additionally, although all tumor types presented here engraft in the chicken chorioallantoic membrane model, they do so with varying degrees of tumor growth.

We present the chicken chorioallantoic membrane model as an alternative, transplantable, in vivo model for the engraftment of gynecological and urological cancer cell lines and patient-derived tumors.

שימוש בקרום כוראלאלי ממברנה במודל Vivo כדי ללמוד גינקולוגית ואורולוגיים סרטן

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Cancer Research

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

גישות גנטיות בקדימה<em&gt; כלמידיה trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Developmental Biology

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

זיהום בדרכי השתן במודל בעלי חיים קטנים: צנתור-Transurethral של זכר ונקבה עכברים

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

An Efficient Method for Extracting Human Fallopian Tube Epithelia for Single-cell Analyses

Human fallopian tubes are intrinsic to reproduction. The purpose of the fallopian tubes is to allow for the transit of sperm, the ovum, and if fertilization is successful, the embryo. The epithelial cells that line the inner surface of fallopian tubes are integral to both normal and abnormal fallopian tube processes, including disease initiation. After menopause, fallopian tubes cease to have a significant role in the body and the intraepithelial cell makeup changes. We describe a method in which these epithelial cells can be isolated from fresh fallopian tubes with minimal stromal cell contamination into a single-cell suspension. These cells can be grown in culture or used for further analysis such as flow cytometry and single-cell RNA sequencing. This isolation protocol can be achieved in 4-6 h and yields viable cells that can be used for immediate downstream analysis. This efficient protocol facilitates the isolation of fallopian tube epithelial cells with an enriched epithelial population.

This protocol describes a one-day method for the isolation of human fallopian tube epithelial cells. Isolated epithelial cells can be plated in 2-dimensional (2D) culture or dissociated into single-cell suspensions and utilized in downstream experiments, including flow cytometry and single-cell RNA sequencing.

שיטה יעילה לחילוץ אפיתל חצוצרות אנושיות לאנליזות של תאים בודדים

Human fallopian tubes are intrinsic to reproduction. The purpose of the fallopian tubes is to allow for the transit of sperm, the ovum, and if ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Biology

Tubal Cytology of the Fallopian Tube as a Promising Tool for Ovarian Cancer Early Detection

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to the lack of markers or tools for the ovarian cancer identification, the early detection of HGSC remains challenging. Direct sampling of the fallopian tube can enhance sensitivity for detection of neoplastic cells when the tumor is not grossly visible. We developed a procedure to collect fallopian tube cells directly from freshly received surgical specimens, which has shown excellent correlation with histological findings. This approach lays a foundation for the future utility of minimally invasive laparoscopic screening in high-risk patient populations.

We explored a tubal cytologic method by sampling the fallopian tube directly post-surgical excision as a tool of ovarian cancer early detection. Here, we present a protocol to collect fallopian tube cells from freshly received surgical specimens.

Tubal ציטולוגיה של שפופרת Tube ככלי מבטיח עבור סרטן השחלות איתור מוקדם

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

דגם האדם החצוצרה לחקירות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video