<p class="jove_content"&gt; Bu çalışma NIH hibe P20RR018766 ve Alkol Araştırma ABMRF / Vakfı&#39;ndan hibe ile desteklenmiştir.</p

1. Hayvanlar <ol><li> Tüm işlemler, Louisiana State Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH yayın No 85-12, 1996 revize) kurallarına uygun olarak yapılmıştır. Erkek Sprague-Dawley sıçan (Charles River Laboratuvarları, 270-350 g vücut ağırlığı), kontrollü bir sıcaklık (22 ° C) ve kontrollü aydınlatma (00:12 saat aydınlık karanlık döngüsü) ortamında yerleştirildiler. Gelişinden sonra fareler, bir haftalık bir aklimasyonundan süre için sunulmuştur ve standart sıçan yemi (2018 Teklad Global% 18 Protein Kemirgen Diyet, Harlan) ve su ad libitum verilmiştir . </li></ol> 2. Set-Up Deney <ol><li> Montaj lenfatikler Cam mikropipetler filament OD 1.2mm ID 0.69mm (Sutter Enstrüman BF 120-69-15) Borosilikat yapılır. Flaming / Brown Mikropipet Çektirme model P-97 (Sutter Aletleri, pipetler çekinKBB) ve ~ 60 mm dış çapa sahip bir kesik uç elde etmek için bir Micro Öğütücü EG 400 (Narishige) olan konik. </li><li> Mikropipetler izole damar odası (CH-1 modeli, Oturma Sistemleri, Burlington, VT) monte edin. Pipetler (aynı boyutta açma) direnç uyumlu olmalıdır. </li><li> Dolgu odası (5 ml) ve albümin-fizyolojik tuz çözeltisi ile mikropipetler (APSS bkz. Tablo 1). Mikropipetler veya tüp hiçbir baloncuklar olmadığından emin olun. </li><li> Knot overhand oftalmik sütür ve her mikropipet bir yer hazırlayın. </li></ol> 3. Lenfatik İzolasyon Toplama <ol><li> (1 ml), BD şırınga ve iğne (BD intradermal konik 26G3 / 8), ketamin / xylazine bir intramüsküler enjeksiyon (sırasıyla 90 ve 9 mg / kg) ile hayvanların anestezisi. </li><li> Karın bölgesinde,% 70 alkol ile sterilize etmek için Sprey orta hat laparotomi yapmak ve ince barsak ve mezenter exteriorize ve özel tüketim. Ic içinde doku yerleştirin.e-soğuk APSS. Aşırı dozda ketamin / xylazine hayvanlar Euthanize ve göğüs (ötenazi Amerikan Veteriner Hekimler Derneği kurallar başına) açarak ölüm onaylayın. </li><li> Diseksiyonu odasında buz APSS ile dolu bir mezenter bir bölümü Pin. Dikkatlice bir stereomikroskopta yardımı ile yağ ve bağ dokusu çevresindeki lenfatik damar toplanması teşrih (80-200 mikron iç çapı ve uzunluğu 1-2 mm). (Güzel Bilim Araçları # 15.000-03) Dumont forseps-INOX 55 diseksiyon (Güzel Bilim Araçları # 11.255-20) ve yaylı makas diseksiyon kullanın. Deney süresince tüm segmentinde en uygun basınç kontrolü sağlamak için sadece bir vana ile izole damarlarda kullanın. </li><li> APSS 5 ml&#39;lik izole damar odasına izole lenfatik aktarın. Oftalmik sütür bağlama gemi direnç eşleştirilmiş iki cam mikropipetler üzerine monte edin. </li><li> Odasının ters bir floresan mikroskop Devret (bizim bir NikTE-2000U), xenon lambası (Sutter Aletleri Lambda LS2 300 W) 340/380 filtre tekerlek sistemi (Krom Teknoloji 340 ve 380 nm eksitasyon filtreler ile Sutter Lambda 10-3), 510 nm dikroik emitör (Krom Teknoloji D510 ile donatılmıştır / 80m), hassas CCD kamera (Photometrics HQ 2) ve satın alma için yazılım (Nikon Elements AR) (Şekil 1) . </li><li> Ya ayarlı rezervuarlar veya basınç ve debi değiştirmek için kullanılabilecek hem servo-feedback pompa sistemi (Living Sistemleri Enstrümantasyon, Burlington VT), mikropipetler kaynaklı boru takın. </li><li> Odasının ısıtma ünitesi (Living Systems) bağlayın ve 37 ° C&#39;ye kadar banyo seti </li><li> 10X objektif (Nikon Planı Fluor 10x/0.3, DIC L/N1, ∞ / 0.17, 16.0 WD) ile odanın tabanında doğrudan lamel lenfatik gör. Hızlı time-lapse görüntü setleri görüntü elde etme yazılımı (bizim sistemi Nikon Elements AR yazılımı) kullanarak elde edilebilir. </li></ol>2 +] i oranlı metrik Ölçme <ol><li> [Ca 2 +], izole lenfatik düz kas i + algılama boya Fura 2-acetoxymethyl ester (PM) (Moleküler Probları, Eugene, OR) Ca 2 ile ölçülür . </li><li> 37 30 dakika Fura 02:00 (2 mcM) ve pluronic asit (0.2% wt / vol) içeren bir çözüm APSS banyo alışverişi Fura-2 AM lenfatik damar Yük ° C </li><li> 30 dakika sonra çözüm APSS geri banyo değiştirmek. Fura-2 banyo çözüm yıkamak için 2 kez durulayın. 20 dakika önce en az bir dengeleme zamanı gemi bırakın [Ca 2 +] i ölçümler izin vermek için spontan kasılmaların yeniden kurulması. </li><li> Alternatif olarak her biri 50 ms süreler için 340 ve 380 nm dalga boylarında aydınlatan bir satın alma protokolü ile oranlı metrik Fura-2 ölçüm izole lenfatiklerde toplayın. Chroma Te dikroik ayna (400 nm floresan ışık geçer;chnology Corp 400DCLP) ve geniş bant emisyon filtresi (510 nm, 80 nm bant genişliği; Chroma Technology Corp D510/80m) ve Photometrics HQ 2 kamera ile elde edilir. Biz 2 cm H 2 O bir temel intraluminal basınç ve +2 adım artar, 4, 6, 8 sırasında 2 dakika veri toplamak ve 10 cm H 2 O </li><li> Ortalama çözümlemek için [Ca 2 +] i, tüm lenf gemi ve gemi tam gevşeme ve kasılma (Şekil 2) sırasında izlenen böylece çevredeki içeren bir ilgi bölgesi (ROI) çizin. Ya mikropipet görüş alanı ise bu alanlarda yatırım getirisi dahil edilmemelidir. Daha küçük ROI&#39;ler küçük ROI&#39;ler potansiyel bir sorun da ancak geminin daraltır ve rahatlatır damarı duvarlarının ROI boyuna biraz hareket etmiş olabileceğini, seçilebilir. Bir diğer potansiyel sorun, bazı damarların kasılması sırasında büküm olduğunu ve bu lenfatiklerde çalışma için kullanılmamalıdır. The büküm hareketleri genellikle izole lenfatik &lt;1 mm uzunluğu sınırlayarak kaçınılmalıdır. Buna ek olarak, bazen bir vana iki tarafta segmentleri sıkmak yok / senkronize rahatlayın. Bu durumda, çünkü bu kesimleri ayrı işlevsel lymphangions temsil, lenfatik vana sadece bir tarafında eğitim olmalıdır, ya da her lymphangion iki tarafında yerleştirilen bir yatırım getirisi ile ayrı ayrı incelenebilir. 10X objektif kullanırken, damar duvarları Ancak bu alanlarda yatırım getirisi dahil edilmemelidir kasılmalar sırasında odak duvarların herhangi bir parça vardır, fazik kasılmaları sırasında odak kalmalıdır. Arka plan ROI da kullanılır ve gemi (örneğin görüntünün köşesinde) uzak konulmalıdır. 340 / 380 oranında bir artış [Ca 2 +] i bir artış gösterir. Luminal çapı farklı zaman noktalarında (bkz. Bölüm 6) veya zamanla damar duvarları takip ederek yazılımın önlem işlevini kullanarak ölçülen olabilir./ Li&gt; </ol> 5. Basınç Kontrol Protokolü <ol><li> Bağımsız basınç uyguladığı akışı çalışma için boş servo geribildirim pompa ile aynı basınç her mikropipet uygulanabilir olmalıdır. Her mikropipet boru, pompa monte edilmiş ortak boru bir T-bağlayıcısı ile eklenir. Başlangıçta 45-60 dk. Lenfatik spontan kasılmaları gelişimine izin vermek için yeterli zamanı için 2 cm H 2 O intraluminal basınç ayarlayın. </li><li> Çalışma için dengeleme süre içinde aşağıdaki kriterlere uygun sadece damarları kullanın: (1) gemi, 2 cm H 2 O kendiliğinden gelişir ton (2) gemi, geminin uzunluğu boyunca makul üniform düzenli, spontan kasılmaları gelişir . Genellikle bir vana alanında downstream geminin geri kalanından daha fazla daraltır ve bu gemiler geminin kalan kontraktil faaliyet gösteren kanıt yoktur kullanılacaktır. </li><li>Basınç adım prosedürü sırasında hızlı time-lapse görüntüleri kaydedin. Her biri için, 30 saniye 2 cm H 2 O basınç başlayacak, sonra 6, 4, 2 ile bir adım, bir dakika için 8 veya 10 cm H 2 O yükseltilir ve geri indirdi 2 cm H 2 O, 30 s. </li><li> Basınç adım serisi tamamlandıktan sonra, yukarıdaki luminal baskıların her maksimal pasif çapı (D Max) ve Ca 2 + floresans ölçümleri ölçmek için banyo çözüm + ücretsiz APSS 37 Ca 2 ° C değiştirin. D Max, tonu hesaplamak ve farklı boyutlarda lenfatikler arasında veri normalleştirmek için kullanılır . </li></ol> 6. Lenfatik Kontraktil parametreler <ol><li> Zamanla damar çapı değişiklikler, çoğu görüntü analiz yazılımı paketleri nesne izleme araçları kullanılarak tespit edilebilir. Bu kanalların sadece biri (340 nm kanalı kullanılan ancak 380 kanal da olabilir) kullanılarak elde edilebilir. Bir kontrast eşik appdamar duvarları vurgulanır böylece görüntü yığın yalan ve sonra her bir duvarı kapsayan ROI (Şekil 3 A), zaman içinde onları izlemek için çizilir . Iç çapı Her duvarın kalınlığı eksi yarısı, her duvarın centroid ölçme ve iki kütle merkezleri arasındaki mesafe hesaplanırken tespit edilebilir. Luminal alanda güçlü bir sinyal nedeniyle her duvar izlemek için zor bir ikinci seçenek, dış çapı ölçümü ve damar duvarlarının iç çapı elde etmek için statik bir ölçüm dayalı bir düzeltme faktörü kullanmak için. Bu durumda, yatırım getirisi, tüm gemi kapsar ve dış çapı (Şekil 3 B) izlenir . Bu yöntem aynı zamanda lenfatik tüm görüntülenebilir kesit alanı (Şekil 3 C) belirlemek için kullanılabilir. Çünkü bir lymphangion tipik şekli, bu ikinci seçenek, her kasılma ile seçilen bir parçası çapı kullanmaktan daha pompalanır gerçek sıvısı hacminin daha iyi bir tahmin sağlar.Geminin. </li><li> Time-lapse çalışma lenfatik luminal çap ölçümleri 4,12,13 aşağıdaki parametreleri belirler: Daralma frekans (CF), dakikada fazik kasılmaları sayma sayısı tarafından belirlenir. Fazik bir daralma hemen önce çapı diyastolik çapı (EDD), End. Sistol sonu çapı (ESD), fazik bir daralma sonunda çapı. Daralma Genlik (AMP = EDD-ESD), atım hacmi basitleştirilmiş bir dizin. Lenfatik düz kas tarafından üretilen sesi belirlemek için kullanılabilir ve aynı zamanda değişik çap lenfatikler arasında veri normalleştirmek için kullanılır, ya da maksimal pasif her basınçta çapı (Ca 2 + ücretsiz koşulları belirlenir Max D) Aynı lenfatik farklı luminal basınçlarda okudu. EDD 1, basınç adımdan sonra ilk daralma ile ilişkili EDD. Bu bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılır.luminal basıncı 5 bir adım artışa yanıt olarak lenf damar miyojenik daralma belirleyici. D / Max basınç adımdan sonra izole bir lenfatik miyojenik daralma normalize değişim = 100 * (EDD 1 EDD) bir basınç adım artış aşağıdaki EDD tarafından temsil edilmektedir. Hesaplanmış olabilir, ancak başka ayrıntı 4 tartışılmıştır ek değişkenler şunlardır: Ton = 100 * (Max D - EDD) D / Max, normalize AMP = AMP / Max D Strok volüm indeksi (SVI) = π (EDD 2 - ESD 2) Ejeksiyon Fraksiyonu (EF) = SVI / (πEDD2) Debi Endeksi (VFI) = CF x SVI. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Her fazik daralma başında, [Ca 2 +] i (Şekil 4) geçici bir artış vardı. Buna ek olarak, luminal basınç adım artar sonra, frekans Ca 2 + transientler ve phasic kasılmaları senkronize arttı. Bu gözlemler, bir tel myograph 14 üzerine monte edilmiş ve salınım Ca 2 + sürümü fazik kasılma döngüsü 15 altında yatan mekanizma iç mağazalar için merkezi bir rol gösteren önceki verileri destek torasik kanalları kullanarak bir önceki bulmaya benzer . Biz de araştırıldı olmadığını [Ca 2 +] i diyastolde (Ca 2 ila + transientler ve fazik kasılmaları), lenfatik sesi ve basınç adım artar (Şekil 5) dayatılan streç neden miyojenik daralma ile ilişkilidir . Hemen basınç adım (Şekil 5B) evvelki göre giderek artan diyastolde 4 cm H 2 O ve üzeri, [Ca 2 +] i, basınç adım artar. Buna ek olarak, çapı, basınç (EDD 1) adım artışları nedeniyle ilk artıştan sonra, miyojenik daralma (Şekil vardıönceki raporlarda 5,12 EDD 1 EDD bir azalma olarak tanımlanır ure 5C). Farklı basınç adımları arasında EDD ortalama normalize değişim karşılaştırıldığında, önemli ölçüde daha fazla daralma 8 artış sonra ve 10 cm H 2 O 2 cm H 2 O (Şekil 6 A) . Istikrarlı bir yükseliş [Ca 2 +] i de Ca 2 de anlamlı olarak daha yüksek değişikliklere neden adım +6 artar, 8 ve 10 cm H 2 O, basınç ile ilgili + den 2 cm H 2 O ( Şekil 6 B). Ancak, basınç adım Ca 2 + ilişki de bu baskılara plato gibi görünüyor. Bu sonuçlar, Ca 2 +-bağımlı bir mekanizma streç yanıt lenfatik miyojenik daralma ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir. Ancak, plato basınç adım Ca 2 + ilişki + duyarlılık, aynı zamanda artan miyojenik constri katkıda bulunabilir Ca 2 arttıran bir mekanizma öneriyoryüksek basınç adım ction. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3438/3438fig1.jpg" /> Şekil 1 ölçümü için kullanılan mikroskop sistemi şematik [Ca 2 +] i izole bir lenfatik. Inverted mikroskop aşamasında izole lenfatik odasına yerleştirilir. Örnek, 340 ve 380 nm dalga boyunda alternatif aydınlatılmış ve lenfatik tarafından yayılan floresan sinyal bir CCD kamera ile toplanır ve kişisel bir bilgisayarda saklanır. Lenfatik intraluminal basınç boş bir servo-geribildirim sistemi tarafından kontrol edilir. Kullanıcı sistemi için basıncı ayarlar ve basınç dönüştürücüleri lenfatik in-line geri besleme sistemi, dinamik yükseltmek, ya da bir pompa aracılığı ile düşük basınç intraluminal basınç rölesini. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3438/3438fig2.jpg" /> Şekil 2. İlgi Bölgesi Örneği (ROBen izole lenf damarlarına Fura-2 oranlı metrik görüntüleme çalışmaları için) seçimi. Seçilen bölge, geminin tüm kurs için takip edilecek sağlamak için en gemi (mikropipetler dokunmadan alanlar hariç) ve çevresini içerir. Arka plan YG (sağ üst köşe) de çevresindeki hamamı nonspesifik sinyal ortadan kaldırmak için kullanılır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3438/3438fig3.jpg" /> Şekil 3 pompalama izleme lenfatik Yöntemleri. A. İç çapı ROI&#39;ler kullanarak zamanla tespit edilebilir, damar duvarları takip hareketi. B. kontrast eşiği tüm gemi olarak ayarlandığında, dış çapı tek bir yatırım getirisi ile takip edilebilir. İç çapı, duvar kalınlığı düzelterek bu ölçümler tahmin edilebilir. C . Başka bir seçenek ve duvar kalınlığı düzelterek ses düzeyini hesaplamak için kullanılabilir alan gemi kapsadığı izlemek içinlenfatik varsayarak silindirik geometri vardır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3438/3438fig4.jpg" /> Şekil 4 arasındaki ilişki [Ca 2 +] i ve lenfatik çapı. Izole bir lenfatik Fura-2 yoğunluğu (ısı haritası biçimi) bir time-lapse video Temsilcisi görüntüler. Her resimde oklar geminin dış çapı anahat. Resim 1 diyastolde lenfatik, nispeten düşük [Ca 2 +] i gösterir. Görüntü 2, damar duvarlarında 340/380 oranı arttıkça yoğunluğu, görüntüleri 3-5 oluşur fazik daralma hemen önce. Resmi 4 Ca 2 + geçici sona erdi ve görüntü 5, sistolik faz sona erdi ve damar dinlenme haline geri dönüyor. B. [Ca 2 +] i ve lenfatik luminal çapı bir arsa, geçici bir artış [Ca 2 +] i her biri için hemen önce gerçekleştiğini gösteriyorfazik daralma. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3438/3438fig5.jpg" /> Şekil 5 lenfatik değişiklikler [Ca 2 +] i ve lenfatik kontraktil yanıt döngüsü basınç artışları adım. Basınç adım protokolleri (A), [Ca 2 +] i (B) ve (C) üzerinde lenfatik çapı değişiklikleri temsil 340/380 oranı verileri, gösterilmiştir. A. Temel luminal basıncı 2 cm H 2 O ve lenfatik damar +2 artış, 4, 6, 8 adım maruz kaldı ve 10 cm H 2 O Her basınç adım kayıt arasındaki zaman aralığı 1-2 dakika idi. Her basınç adım, geçici artar hem de frekans bir artışa neden olmuştur [Ca 2 +] i (B) ve fazik kasılmaları (C) . Lenfatik çapı da her adım luminal basınç artışı ile artan ve 4-10 cm H 2 O basınç adımları, af oluştu EDD bir ilk düşüş olduter EDD1 (C), daha önce lenfatik miyojenik daralma olarak tarif. Bazal istikrarlı bir artış vardı [Ca 2 +] i transientler arasında hemen her adım basınç artışı (B). Miyojenik daralma büyük basınç adımları daha belirgindir Ancak bazal [Ca 2 +] artış i H 2 O basınç adımları (B) 4-10 cm için yaklaşık aynıydı. AMP önceden bildirilen bir telafi edici artış 6-10 cm H 2 O (C) basınç adımlardan sonra da belliydi . <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3438/3438fig6.jpg" /> Şekil 6 basınç adım artışları kısa bir süre sonra Lenfatik miyojenik daralma ve ücretsiz olarak kademeli bir artış [Ca 2 +] i diyastolde. EDD 1 ay sonra 30-50 sn arasında EDD ortalaması, her bir basınç adım için normalize EDD değişimi hesaplamak için kullanılır. B. 1 EDD sonra 340/380 oranı 30-50 s yoğunluğu başlangıca sırasında ortalama 340/380 oranı (2 cm H 2 O) tarafından ikiye bölündü. * P &lt;0.05 2 cm H 2 O basınç adım vs. N = 4 gemilerin okudu. Movie 1 Örnek çalışma için kullanılan bir izole lenf damarı fazik kasılmaları. Luminal 2 cm H 2 O basınç kuruldu Geçen süre ve bir ölçek çubuğu alt kısmında. Time-lapse görüntüleri 10X amacı ile iletilen ışık kullanılarak toplanmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3438/3438movie1.avi">film izlemek için buraya tıklayın.</a> Pompalama izole lenfatik Movie 2 oranlı metrik Fura-2 görüntüleme. Bir ısı haritası ölçeği sol üst kısmında gösterilir ve geçen zaman ve ölçek çubuğu alt kısmında gösterilir. Basıncı başlangıçta 2 cm H 2 O ve 0.5 dak ve returne başlayan 8 cm H 2 O büyüdüd 1.5 min 2 cm H 2 O <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3438/3438movie2.avi">film izlemek için tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+system:+a+vital+link+between+metabolic+syndrome+and+inflammation.">Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, 94-94 (2010).</li><li>Zawieja, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+biology+and+the+microcirculation:+past,+present+and+future.">Lymphatic biology and the microcirculation: past, present and future.</a> Microcirculation. 12, 141-141 (2005).</li><li>Benoit, J. N., Zawieja, D. C., Goodman, A. H., Granger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intact+mesenteric+lymphatic+pump+and+its+responsiveness+to+acute+edemagenic+stress.">Characterization of intact mesenteric lymphatic pump and its responsiveness to acute edemagenic stress.</a> Am. J. Physiol. 257, H2059-H2059 (1989).</li><li>Davis, M. J., Davis, A. M., Ku, C. W., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+constriction+and+dilation+of+isolated+lymphatic+vessels.">Myogenic constriction and dilation of isolated lymphatic vessels.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 296, H293-H293 (2009).</li><li>Dougherty, P. J., Davis, M. J., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sensitivity+and+cooperativity+of+permeabilized+rat+mesenteric+lymphatics.">Calcium sensitivity and cooperativity of permeabilized rat mesenteric lymphatics.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 294, R1524-R1524 (2008).</li><li>Fay, F. S., Shlevin, H. H., Granger, W. C., Taylor, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aequorin+luminescence+during+activation+of+single+isolated+smooth+muscle+cells.">Aequorin luminescence during activation of single isolated smooth muscle cells.</a> Nature. 280, 506-506 (1979).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+myosin+light+chain+phosphorylation+decreases+rat+mesenteric+lymphatic+contractile+activity.">Inhibition of myosin light chain phosphorylation decreases rat mesenteric lymphatic contractile activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 726-726 (2009).</li><li>Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+movements,+distribution,+and+functions+in+smooth+muscle.">Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle.</a> Pharmacol. Rev. 49, 157-157 (1997).</li><li>Ratz, P. H., Berg, K. M., Urban, N. H., Miner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+smooth+muscle+calcium+sensitivity:+KCl+as+a+calcium-sensitizing+stimulus.">Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KCl as a calcium-sensitizing stimulus.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 288, C769-C769 (2005).</li><li>Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sensitivity+of+smooth+muscle+and+nonmuscle+myosin+II:+modulated+by+G+proteins,+kinases,+and+myosin+phosphatase.">Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase.</a> Physiol. Rev. 83, 1325-1325 (2003).</li><li>Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Molina, P. E., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mesenteric+collecting+lymphatic+pump+function+following+acute+alcohol+intoxication.">Adaptation of mesenteric collecting lymphatic pump function following acute alcohol intoxication.</a> Microcirculation. 17, 514-514 (2010).</li><li>Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+alters+barrier+function+of+cultured+lymphatic+endothelial+cells+through+a+VEGFR-3-dependent+mechanism.">VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism.</a> Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).</li><li>Shirasawa, Y., Benoit, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+calcium+sensitization+of+rat+lymphatic+smooth+muscle.">Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).</li><li>Imtiaz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaking+through+Ca2++stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization.">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).</li><li>Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+coronary+endothelial+cell+Ca2++concentration+during+shear+stress-+and+agonist-induced+vasodilation.">Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation.</a> Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).</li><li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent.">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent.</a> 286, H2287-H2287 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Lenf damarları pompalama içsel çalışma yöntemleri yeni bir kombinasyonu kullanılmıştır. Aynı anda değişiklikleri ölçmek için yeteneği [Ca 2 +] i ve pompa lenfatikler çap Ca 2 göreceli katkıları +-bağımlı ve Ca 2 + lenfatik kasılma döngüsünü düzenleyen genel mekanizması duyarlılaştırıcı sinyalizasyon yolaklar çalışmaları için izin verecek Lenfatik kasılma döngüsü ton üzerinde üst üste fazik kasılmaları oluşur. Verileri her fazik bir kasılma Ca 2 + pacemaker mekanizması merkezi bir rol öneren, [Ca 2 +] geçici bir artış ile ilişkili olduğunu göstermektedir ve bu frekans Ca 2 + transientler Luminal basıncındaki değişikliklere duyarlı . Bizim verilerimiz basınç hızlı artışlar aynı zamanda bazal istikrarlı bir artış ortaya çıkarmak olduğunu göstermektedir [Ca 2 +] i transientler arasında. Bu artışa katkıda bulunabilirluminal basınç adım artışları aşağıdaki lenfatikler toplama gözlenen miyojenik daralma. Ancak, biz bu bazal artışların bir plato görülmektedir [Ca 2 +] i 6 miyojenik daralma değişik derecelerde +10 cm H 2 O, değişen basınç adımlarla. Bu veriler, başka bir mekanizma, muhtemelen Ca 2 + duyarlılaştırıcı mekanizma, ayrıca basınç miyojenik yanıt olarak dahil olduğunu göstermektedir. Bir varsayım, bu çalışmalar ile ölçülen Ca 2 + çoğunluğu düz kas bulunan olmasıdır. Ancak, Ca 2 +, lenfatiklerde mevcut olabilir endotelyal hücreler ve diğer hücre türleri [Ca 2 +] i, bu nedenle ölçülen değerler muhtemelen düz kas bir abartma [Ca 2 +] i de genel gözlenen katkıda lenfatikler. Herhangi bir Ca 2 + endotel ölçülen doğrudan katkı sağlaması bekleniyor .arteriol 16 önceki çalışmalara dayalı kas kasılması pürüzsüz. Bu sorun, lenfatikler endotel arındırılır, gelecek deneylerde ele alınacaktır. Değerlendirmek oranlı metrik boyalar kullanarak [Ca 2 +] i hücre veya dokular, numune hareket eserler neden olabilir. Lenfatikler sözleşme hareket eserler en aza indirmek için, biz 340/380 oranları belirlemek için mümkün olduğu kadar geminin içeren bir yatırım getirisi kullanılmıştır. Ayrıca, sadece kendi kasılma döngüsü sırasında odakta kalmasını damarları çalışma. Çünkü damar hareketinden ortaya ziyade belirleyebilir potansiyel eserler mutlak [Ca 2 +], belirli bir siteye, biz geminin büyük bir alan için ortalama edinin. Biz ortalama nispi değişiklikler odaklanmak [Ca 2 +] i zaman ve nasıl bu değişiklikler gemilerin fazik ve tonik kasılması ile ilgili. Özetle, determination izole toplama lenfatiklerde oranlı metrik görüntüleme [Ca 2 +] i güçlü bir araç deşifre Ca 2 +-bağımlı ve Ca 2 +-duyarlaştırıcı lenfatik kasılma döngüsü altında yatan mekanizmaları. temsil Bu yöntemde, çeşitli sinyal iletim yollarının seçici agonist veya inhibitörleri kullanan gelecekteki çalışmalar da lenfatik düz kas fazik karşı tonik kasılması altında yatan benzersiz bir moleküler mekanizmaları ayırt yardımcı olacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Zil 5x STOKUN </td></tr><tr><td Kimyasal </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Potasyum klorid </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1.75 g </td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1.47 g </td></tr><tr><td> Magnezyum Sülfat </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td> 4 otoklavlanmış mağaza şişe ve içine steril filtre ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2. MOPS tampon </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Şirket </td&gt; <td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125.6 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td> 4 otoklavlanmış mağaza şişe ve içine steril filtre ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3. Albumin Fizyolojik Tuz Çözeltisi (APSS) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> Zil stoku (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Mops Tampon </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Sodyum Fosfat </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0.168 g </td></tr><tr><td> Sodyum Piruvat </td><td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA sodyum salt </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albümin, Bovine </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td> 37 ° pH 7.4 &#39;e ayarlayın ° C, 4 otoklavlanmış şişe ve depoya sonra steril filtre ° C </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Özel Reaktifler. 4 Tüm Mağaza ° C

measurement of cytosolic ca2+ in isolated contractile lymphatics

Lenf damarları, merkezi dolaşıma lipidler teslim sıvı homeostazı korur ve potansiyel olarak zararlı antijenler için bir gözetim sistemi gibi davranır, mukozal bağışıklık ve adaptif immün yanıtları 1 optimize çok fonksiyonlu bir ulaşım sistemi oluşturmaktadır. Lenf kör uçlu ilk lenfatikler girer ve daha sonra büyük toplama lenfatiklerde bir basınç gradiyenti karşı taşınır interstisyel sıvı oluşur. Her toplama lenfatik akışı önlemek Biküspit valfleri ile ayrılmış, lymphangions adı verilen parçalar bir dizi oluşur. Her lymphangion 2 merkez dolaşımını doğru bir basınç gradiyenti karşı lenf propels bir kasılma döngüsü sahiptir. Bu fazik kontraktil desen, sistolik ve diyastolik aşamaları kalp döngüsü benzer ve daha düşük bir daralma frekansı 4 . Buna ek olarak, lenfatik düz kas tonu üretir ve miyojenik daralma ve dilatasyon görüntüler In sırasıyla luminal basınç artar ve azalır, 5 yanıt. Böylece lenfatiklerin fazik ve tonik kontraktilite destekleyen bir melez moleküler mekanizmaları önerilmiştir. Düz kas daralma genellikle sitozolik Ca 2 tarafından düzenlenir + konsantrasyonu ([Ca 2 +] i) Ca 2 artı hassasiyet + 6 hücre çevresindeki ortam değişikliklerine yanıt olarak kontraktil elemanları. [Ca 2 +] i Ca 2 + plazma zarı ligand veya voltaj kapılı Ca 2 + kanalları ve Ca 2 + iç mağazalardan salınımı ve alımı yoluyla hareketin kombinasyonu ile belirlenir. Sitosolik Ca 2 + kalmodulin bağlanır ve miyozin hafif zincir gibi enzimleri harekete geçirir (MLC) da MLC aktin-miyozin aracılı kasılma 8 önde gelen fosforile kinaz (MLCK). Ancak, bu yolun Ca duyarlılığını <sup&gt; 2 + MLC fosfataz (MLKP) 9 ile düzenlenir. MLKP faaliyet Rho kinaz (ROCK) ve miyozin fosfataz inhibitörü protein TÜFE-17 tarafından düzenlenir. Burada, Ca 2 +-bağımlı ve Ca 2 + lenfatik düz kas kasılması-duyarlılaştırıcı mekanizmaları araştırmak için izole perfüze lenfatikler zamanla [+ Ca 2] i değişiklikleri değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Izole sıçan mezenterik toplama lenfatikler kullanarak [+ Ca 2] i ve kontraktil aktivite streç bağlı değişiklikleri okudu. Izole lenfatik modeli, basınç, debi, ve banyo çözüm kimyasal bileşimi sıkı bir şekilde kontrol edilebilir avantaj sunuyor. [Ca 2 +] i oranlı metrik, Ca 2 + bağlayıcı boya Fura-2 lenfatikler yükleyerek tespit edildi. Bu çalışmalar daha geniş fazik düzenleyen farklı moleküler mekanizmaları eğitim sorunu için yeni bir yaklaşım sağlayacaktır.tonik daralma karşı lenfatik düz kas kasılmaları.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics at JoVE.com

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Biz sitozolik Ca değerlendirmek için bir yaklaşım tanıtmak<sup&gt; 2 +</sup&gt; Ca çalışmada izole lenfatiklerde konsantrasyon<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Bağımlı ve Ca<sup&gt; 2 +</supLenfatik düz kas kasılması&gt; duyarlılaştırıcı mekanizmaları.

Sitosolik Ca ölçümü 2 + İzole Kontraktil Lenfatikler

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

measurement-of-cytosolic-ca2-in-isolated-contractile-lymphatics

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

13.5K Görüntüleme.  Louisiana State University Health Sciences Center. Biz sitozolik Ca değerlendirmek için bir yaklaşım tanıtmak 2 + Ca çalışmada izole lenfatiklerde konsantrasyon 2 +-Bağımlı ve Ca 2 + duyarlılaştırıcı mekanizmaları.

Video: Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

Farelerde γHV68 Enfeksiyon ölçümü

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1. Although genetic disposition and exposition to toxic substances are known causes for this disease in about one third of the patients, the origin of DCM remains largely unclear. In a substantial number of these patients, autoantibodies against cardiac epitopes have been detected and are suspected to play a pivotal role in the onset and progression of the disease2,3. The importance of cardiac autoantibodies is underlined by a hemodynamic improvement observed in DCM patients after elimination of autoantibodies by immunoadsorption3-5. A variety of specific antigens have already been identified2,3 and antibodies against these targets may be detected by immunoassays. However, these assays cannot discriminate between stimulating (and therefore functionally effective) and blocking autoantibodies. There is increasing evidence that this distinction is crucial6,7. It can also be assumed that the targets for a number of cardiotropic antibodies are still unidentified and therefore cannot be detected by immunoassays. Therefore, we established a method for the detection of functionally active cardiotropic antibodies, independent of their respective antigen. The background for the method is the high homology usually observed for functional regions of cardiac proteins in between mammals8,9. This suggests that cardiac antibodies directed against human antigens will cross-react with non-human target cells, which allows testing of IgG from DCM patients on adult rat cardiomyocytes. Our method consists of 3 steps: first, IgG is isolated from patient plasma using sepharose coupled anti-IgG antibodies obtained from immunoadsorption columns (PlasmaSelect, Teterow, Germany). Second, adult cardiomyocytes are isolated by collagenase perfusion in a Langendorff perfusion apparatus using a protocol modified from previous works10,11. The obtained cardiomyocytes are attached to laminin-coated chambered coverglasses and stained with Fura-2, a calcium-selective fluorescent dye which can be easily brought into the cell to observe intracellular calcium (Ca2+) contents12. In the last step, the effect of patient IgG on the cell shortening and Ca2+ transients of field stimulated cardiomyocytes is monitored online using a commercial myocyte calcium and contractility monitoring system (IonOptix, Milton, MA, USA) connected to a standard inverse fluorescent microscope.

The presented method offers a way to detect functional effective cardiotropic autoantibodies in the plasma of patients with dilated cardiomyopathy, irrespective of the specific antigen, by analysing the impact of isolated patient immunoglobulin on cellular shortening and intracellular calcium transients in isolated rat cardiomyocytes.

İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently shown that UPEC have an important role in the initiation of chronic pelvic pain2, a feature of Chronic prostatitis/Chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS)3,4. Infection of the prostate by clinically relevant UPEC can initiate and establish chronic pain through mechanisms that may involve tissue damage and the initiation of mechanisms of autoimmunity5.
A challenge to understanding the pathogenesis of UPEC in the prostate is the relative inaccessibility of the prostate gland to manipulation. We utilized a previously described intraurethral infection method6 to deliver a clinical strain of UPEC into male mice thereby establishing an ascending infection of the prostate. Here, we describe our protocols for standardizing the bacterial inoculum7 as well as the procedure for catheterizing anesthetized male mice for instillation of bacteria.
CP/CPPS is primarily characterized by the presence of tactile allodynia4. Behavior testing was based on the concept of cutaneous hyperalgesia resulting from referred visceral pain8-10. An irritable focus in visceral tissues reduces cutaneous pain thresholds allowing for an exaggerated response to normally non-painful stimuli (allodynia). Application of normal force to the skin result in abnormal responses that tend to increase with the intensity of the underlying visceral pain. We describe methodology in NOD/ShiLtJ mice that utilize von Frey fibers to quantify tactile allodynia over time in response to a single infection with UPEC bacteria.

Infection of the prostate may be a contributing factor in mediating pelvic pain in chronic prostatitis. We describe the procedure for preparation of standardized bacterial inoculum, instillation of bacteria into the urethra of male mice and methodology for measuring tactile allodynia in mice over time.

Bakteriyel Prostatit bir fare modelinde Dokunsal allodini Ölçümü

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Ölçümü<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

Size Matters: Cryptococcus neoformans kapsül çap ölçümü

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

Tükürük bezi işlevi farelerde ölçülmesi için bir yöntem

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.