Biz bu yöntemin geliştirilmesi sırasında teknik yardım için Lino Kim, Steve Guzman ve Ujit Satyarthi özel şükretmezler. Myron Hawthorne, Richard Spengel ve Roberto Rojas burada kullanılan odaları işlenmiş ve çok ihtiyaç duyulan teknik yardım sağlamıştır. Özellikle, Roberto Rojas Şekil 4 üretti. Biz de yukarıda kemotaksis assay gelişimi öncesinde Scott Fraser değerli tavsiyeler için müteşekkiriz. Bu çalışma kısmen bir NIH-MBR SKOR-5S06GM048680-13 Medb ait ve CW CSU, Northridge Lisans Tez Destekleme Programı bir ödül tarafından desteklenmiştir.

1. 1. Gün: lamelleri gecede kültür gövde nöral tüp İzolasyonu <ol><li> 38 az 56 saat süreyle civciv yumurta inkübe ° C inkübasyon yumurta çıkarın, hafif% 70 Etanol ile onları sprey, ve sonra onları kurutun. UV-steril cam tepsi içine açık yumurtaları kırın. </li><li> Sarisi her embriyo ayıklayın ve civciv Ringer yerleştirin. Kavisli makas ile kan adaların etrafında ilk kesim tarafından bu yapın; ardından, künt forseps ile, onun extraembryonic zarla embriyo pick up ve civciv Ringer çözeltisi içeren bir steril plastik Petri kabı yerleştirin. </li><li> Aşırı extraembryonic membranlar kapalı kırparak yanı sıra bir tungsten iğne (Şekil 1) kullanarak, kranial vagal ve sakral eksenel düzeyleri her embriyo gövde ayırın. İlk aşamalarında HH15-17 11 arasındadır yaklaşık 9 embriyolar seçin. Yukarı aşamaları ve HH15 için, ön beyin ve arka beyin eksenleri akut bir açı oluşturur ve bu nedenle, kafa kaudal eğmek için görüntülenir. Atsahne HH17, kuyruk tomurcuk mevcut olup tenteliler ventral ancak henüz Somitlerin içermez. Bir tungsten iğne ile embriyo yaklaşık 2 mm extraembryonic membranlar keserek ve 10 somite anterior herhangi bir embriyonik dokular kesilir. Ayrıca beşinci en yeni kurulan somite çevresinde başlayarak tüm kaudal embriyonik dokularda çıkarın. </li><li> Dispase olarak izole edilmiş embriyonik gövdeleri (0.24 U / ml DMEM) yerleştirin ve 37 için 1 saat 15 dakika boyunca bu inkübe ° C ve% 5 CO2. Sandıklar inkübasyon başladığında, kültür NT eksplantlar için 6 lamelleri (CS) (adım 1.5-1.8) hazırlamaya başlamalıdır. </li><li> % 70 etanol içinde 6 CS (steril, saf su ile seyreltilerek) yıkayın ve sonra onları kurutun. Bir laboratuar işaretleyici kullanarak, çapı 1 cm (a fibronektin katın uygulandığı yerlerde bu dairenin daha sonra tanımlamanıza yardımcı olacaktır) hakkında her CS merkezinde bir daire çizin. Her CS aynı yüzünde, sözcük (bu y yardımcı olacaktır çizilmiş çemberin dışında (veya diğer bazı asimetrik kelime veya şekil) &quot;olarak&quot; yazmakou CS işaretli tarafı aşağı yukarı bakacak şekilde ya da olup olmadığını belirlemek). </li><li> Ayrı 40 her CS yerleştirin işaretli yüzeyi aşağı bakacak ve yemek 10 dakika antiseptik bir UV lamba altında açık oturmasına izin ile x 10 mm steril çanak. </li><li> 60 ul fibronektin (FN, 10 ug / ml DMEM) uygulanır 1 cm bir daire içinde yer alan tüm emin iken CS işaretsiz yüzeyine kaplanır. 30 dk için 37 ° C sıcaklıkta inkübe edilir ve daha sonra dikkatli bir şekilde her bir CS fibronektin aspire bulaşık yerleştirin. </li><li> Ve FN-kaplı bölge için 250 ul &quot;kültürü&quot; orta [L-glutamin ile DMEM (2 mM), penisilin (100U/ml), streptomisin (100 mcg / ml) ve% 8 fetal bovin serumu (FBS)] ekleme CS. 37 her CS içeren bulaşık yerleştirin ° C ve% 5 CO2 tekrar nts izole edilene kadar. </li><li> L15 orta içeren bir 5 cm cam Petri çanak tüm İnkübe embriyo gövdeleri aktarın ve ince forseps ve tungsten iğne (Şekil 1) kullanarak her NT dışarı Anatomi başlar. CNT zarar vermemek için temkinli olurken arefully keskin bir tungsten iğne ile NT ve Somitlerin sınırı boyunca dilimleyin. Bu gövde kaudal-en uca her NT izole başlaması genellikle daha kolaydır. </li><li> (Kabaca 8 ve 15 Somitlerin arasındaki NTS uzun önerilir) bir gecede kültürü düz ve uzun NTS 6 seçin. Kültür ortamı ile astarlanmalıdır bir mikropipet ucu kullanarak, (1,8 adımlarda 1,5) kendi önceden hazırlanmış CS 6 NTS her aktarın. NT yüzeyinde yüzen kalır olmadığından emin olun. NT yüzen ise bir mikropipet kullanarak lavabolar kadar, bunun üzerine orta damla. </li><li> 37 ° C ve% 5 CO2 gece boyunca her bir çanak yerleştirin. Her NT hemen önce inkübatör tabak (bir referans olarak adım 1.5 çizilen daire kullanarak) yerleştirerek, ilgili CS FN kaplı alanı içinde olduğundan emin olmak için dikkatli olun. Bir mikropipet gerekirse daha iyisi her bir NT konumunu ayarlamak için kullanılabilir. </li><li> Placeen az 2 bir steril 15 ml santrifüj tüpüne kültür ortamı ml (serum yok) ve 37 ° C ve% 5 CO2 de bir gece inkübe edilir. Kapak bırakın hafifçe gece boyunca ayarlamak için ortamın pH sağlamak için vida. Ön kuluçka orta moleküler bir degrade oluşturulması bozabilir sizin odasında kabarcık oluşumu önlemek için önemlidir. Böyle &quot;preinkübe&quot; orta gelecekteki tüm adımları kullanılmalıdır. Kullanılmadığı zaman, bu orta inkübe 37 ° C olmalıdır </li></ol> 2. 2. Gün: modifiye Zigmond odası ve hücre göçü time-lapse analizi yükleniyor <ol><li> Kültürlü 6 NTS Out, iyi analiz için uygundur 3 kültürleri seçin. Genel olarak, en az bir uzun, düz kenar NCC kültürler (Şekil 2A) seçilmelidir. 3 en iyi kültürleri farklı bir tedavi ile her gün boyunca, 3 modifiye Zigmond odaları yüklemek ve film için kullanılacaktır. 3 kültürlerin Out, loadin için birini seçing birinci bölme ve daha sonra kullanılmak üzere inkübatöre diğerleri dönün. </li><li> Bir pamuklu çubukla kullanarak, rezervuarlar ve tek modifiye Zigmond kamara köprü çevreleyen vazelin ince, düz bir tabaka uygulayın. </li><li> CS yüzeyine bağlı çevreleyen NCCS bırakarak bir tungsten iğne ile, yavaşça, CS NT çıkarın. KKK kültür düz kenarının yönünü hatırlamak için bir kalem ile çanak işaretleyin. </li><li> Köprüye preinkübe orta birkaç damla koyun. Eski kültür ortamı çoğu kaldırmak için bir Kimwipe karşı ince forseps ile CS, dab CS kenarına Pick up, sonra hemen filme gereken kültür düz kenar üzerinde ortalanmış şekilde modifiye Zigmond odasının üzerine CS yerleştirin Köprünün uzunluğu ve yaklaşık dik köprü-rezervuar sınırına (Şekil 2A, B). </li><li> Bir inverted mikroskop kullanarak, inci en yakın köprü tarafta olmak için düz KKK sınırına taşımak(; kontroller için bu ikinci yüklenen hangisi rezervuar karşılık gelecektir Şekil 2B) şüpheli chemotactant içerecektir e rezervuar. Ayrıca, daha ince köprü-rezervuar sınırına dik olmasını kültür düz kenarını hizalamak. </li><li> Dikkatle, ama güvenli tamamen daha da hava geçirmez olmalarını sağlamak için CS kenarı boyunca ek vazelin koyun, sonra odasına üzerinde mühürlü emin Zigmond odası mevcut vazelin içine CS basın. Mühürleme işlemi sırasında herhangi bir hareketi düzeltmek için tekrar KKK sınır açısı İnce ayarlayın. </li><li> Şüpheli chemotactant ilk (Şekil 2B) içermez rezervuar yükleyin. Yaklaşık 300 ul preinkübe orta ve (rezervuar herhangi kabarcıklar oluşturmak için dikkatli olurken) dolana kadar rezervuar içine orta enjekte ile 1 ml şırınga (ekli iğne inç 25 G x 1.5) yükleyerek bunu. Bir suff ile her iki tarafından rezervuar takınönceki sonraki rezervuar yükleme için vazelin icient miktarı. </li><li> Aday chemotactant içeren preinkübe orta kullanarak bu sefer hariç, adım 2.7 tekrarlayın. Daima, test edilen molekül eksik rezervuar yüklemeden sonra, test edilecek molekülü içeren rezervuar yüklemek için kültürler arasında bir moleküler gradyanı üreten zaman çok önemlidir. </li><li> ° C önce filme 1 saat boyunca inkübe 37 yüklü Zigmond odasına yerleştirin. Resim 90 s aralıklarla 3 saat boyunca NCC kültür düz sınır yaklaşık 37 ° C de (Şekil 2A, B) inkübe iken. Ideali temsil kesik kutu; önce herhangi bir film yaratmak için, elde edilecek görüntülerin kenar ve son rezervuar yüklenen sınırları köprü (Şekil 2B, üst panelin kenarına temas hizalanacak şekilde kamerayı hizalamak için emin olun görüntüleme için pozisyon). Bu moleküler uygulanan degrade ve inci yön standartlaştırarak sonraki yazılım analizi kolaylaştıracaktırher bir film filme rezervuar e mesafe üretti. </li><li> Kontroller için tekrar (adım 2.1) seçilen diğer iki KKK kültürlerin her biri için 2,2-2,9 adımları, ama uygun bir ortamda her rezervuar doldurmak. Tek tür kontrol süreyle ön kuluçkaya tabi orta test edilecek molekül içermeyen ile her ikisi de rezervuar doldurun. Ikinci bir kontrol tedavisi için, başbakan CS montaj öncesinde şüpheli chemotactant içeren preinkübe orta birkaç damla ile köprü. Ardından, şüpheli chemotactant içeren aynı ortamda hem rezervuar yükleyin. </li><li> ImageJ (NIH) Manuel İzleme kullanın <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">(rsb.info.nih.gov / ij / plugins / parça / track.html)</a> ve Kemotaksis ve Göç Aracı v1.01 <a href="http://www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html">(/ www.ibidi.de / uygulamaları ap_chemo.html)</a> izlemek için eklentileri kültür j düz periferik kenar boyunca NCCS göçüust görüntülü ve elde göçmen yörüngeler (Şekil 2B-C) farklı parametreleri analiz etmek. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Birçok gövde NCCS Yukarıdaki tekniği kullanarak bir aday kemoatraktan yanıt veren bir film hücre yörüngeleri bir örnek (Şekil 2B) gösterilir. Olumlu bir yanıt bu örnekte Hücrelerin çoğu kemoatraktan degrade kadar net hareketi (gibi kırmızı renkte gösterilir) görüntülenir. Yörünge verilerin yanı sıra hücre göçü diğer özellikleri analiz etmek için de kullanılabilir. Görsel olarak modifiye Zigmond odası, bir Alexa Fluor 488 IgM konjugat (MW ~ 900 kDa) ile uygulanan bir degrade değerlendirmek amacıyla modifiye Zigmond odasının ikinci rezervuarı (yaklaşık 40 ug / ml H 2 O da) konuldu. Degrade (Şekil 3) 1 h tarafından kurulan ve 26 saat sonra hala biraz mevcut, ama büyük ölçüde 50 h tarafından azaldı. Test edilecek daha küçük bir molekül ise, o zaman uygulanan eğim wine gösterileceğini daha hızlı düşmesine ll. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig1.jpg" /> Şekil 1. Fibronektin kaplı lamelleri gecede yetiştiricilik için gövde düzeyinde NTS eksplantasyonunun. Dorsal NT gövde NCCS delamine Somitlerin 8-28 bitişik bulunan, çünkü bu kademeli NT mikrodisseksiyon ve NT eksplant dan NCCS göç etmesi için izin vermek için bir fibronektin kaplı CS gece boyunca kültive ile izole edilir. Onlar uzun düz kenarlar KKK kültürleri verim eğilimi olarak 8-15 Somitlerin uzun ve nispeten düz arasındadır İzole NTS iyi gecede yetiştiricilik için uygundur. Diğer sinirsel tepe eksenel seviyelerine neden nöral tüpün bölgeler daha küçük bir yazı &#39;de gösterilmiştir. s, somite. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3330/3330fig2.jpg" /> Şekil 2. Eksplante gövde NCCS göç değerlendirmek için yöntemmodifiye Zigmond odalarını kullanarak. (A) Uzatılmış gövde NCC kültürler, en az bir uzun, düz kenarlı nts ve sonuç NCC kültürlerinin bir gecede kültürlenmesi ile hazırlanan deney için seçilir. Seçilen kültür en uzun düz kenar sonra köprü-rezervuar sınır dik olarak yerleştirilmiş ve gelecek uygulanan gradyan vektörünü bu nedenle paralel edilir. Zigmond haznesi ve mühürleme NCC kültür pozisyon hassas olarak ayarlanması (B) sonra odasına lamel, odasının yüklenir. Kemotaksisi sınarken, şüpheli chemotactant içermez rezervuar (-) ilk ve mühürlü yüklenir. Daha sonra, diğer rezervuarın şüpheli chemotactant (+) ve mühürlü ile yüklenir. Önceden seçilen sınır boyunca Periferik NCCS ardından görüntülü ve ImageJ (alt panel) Manuel İzleme eklentisi kullanarak izlenebilir. Yanıt (C) Çok sayıda göçmen özellikleriiçin uygulanan degrade izleme verilerine dayanarak tespit edilebilir. Örneğin, bir kemotaksis indeksi göç etmiş toplam mesafe ile x-ekseni boyunca bir hücre yerinden bölünmesi ile elde edilebilir. (D) &#39;cazip bir tepki için bir örnek başlangıçta kemotaksis ve Geçiş tarafından oluşturulan bir hücre yörünge arsa ile gösterilir ImageJ için Aracı eklentisi. Her yörünge başlangıç ​​noktası başlangıç ​​noktasına (0,0) olarak ayarlanır. Ayrıca kemoatraktan kaynağına yakın olduğunu; (eşit ağırlıklı tüm hücreleri mavi çapraz) nihai pozisyonda bütün hücrelerin kütlesi kemoatraktan source.The merkezine doğru göç daha kaç hücre unutmayın. NCCS, nöral krest hücreleri; Kırmızı parçaları, yüklü rezervuar doğru göç hücreleri şüpheli kemoatraktan; Siyah parça uzakta, göç hücreleri; (+), yüksek chemotactant konsantrasyon; (-), alt chemotactant konsantrasyonu. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig3.jpg" /> <stronBir Alexa Fluor 488 IgM konjugat ilave izleyen farklı zamanlarda bir modifiye Zigmond odasının köprü üzerinden g&gt; Şekil 3. yoğunluğu profili. oda ana istisnalar ile protokol &#39;de tarif edilene benzer bir şekilde yerleştirilmiş olduğu ön inkübasyona tabi su (yerine preinkübe orta) 40 mcg / ml antikor sulandırmak için kullanılır ve küçük hava cepleri köprünün uçları (uzakta yukarıda yoğunluğu profilleri alınan dilimden) mevcut idi. Başlangıçta, hiçbir degrade köprünün en genelinde mevcut idi. Tarafından 1 hektar degrade kurulan ve 26 saat kadar mevcut kalmıştır. 50 h tarafından degrade varlığı köprünün farklı alanlarda tutarsız ve ne zaman mevcut, degrade eğimi büyük ölçüde azalmış oldu. Tüm profiller AxioVision 4.6 yazılımını kullanarak köprü üzerinden özdeş bir dilim (bir köprü-rezervuar sınır diğerine) elde edildi. Unutmayın bile havacepleri mevcuttu, degrade kesintiye değildi. Yüksek, yüksek yoğunluklu, düşük, düşük yoğunluklu, köprünün tüm genişliği (2 mm) çapında x-ekseni, mesafe; (+), Alexa Fluor 488 IgM konjugat ile yüklenen rezervuarı; (-), rezervuar konjugat ile yüklü değil. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3330/3330fig4.jpg" /> Şekil 4. Modifiye Zigmond odasının özellikleri. Gösterildi onun boyutlu spesifikasyonlar (± 0,2 mm) ile birlikte burada kullanılan modifiye Zigmond odasının bir diyagram. Ölçümler orta bireysel tercihlerini eşleştirmek için ayarlanabilir. Ek Protokol: Modifiye Zigmond Odası Fabrikasyon Aşağıdaki protokol için bir referans olarak Şekil 4&#39;e bakınız: <ol><li> 3/16 &quot;kalınlığında akrilik cilalı (4.45 mm gerçek kalınlığı) bir levha satın alın. </li><li> Bir tablo kullanarak gördüm, büyük boyutlu odası boşlukları kesmek33.25 mm x 64,57 mm kaba ölçüler. Bu işleme için 3.175 mm ekstra malzeme sağlar. </li><li> Bir mengene üzerinde haznesi boş ayarlayın. 30.07 mm x 61.39 mm: Bir freze makinesi ve 6,35 mm (1/4 &quot;) freze ucu, finiş onların tam boyutlarına odasının tarafı ile. </li><li> Freze makinesi üzerindeki odacık blank konumlandırın ve x ve bir kenar bulucu ile y ekseni hem boyunca boş merkezinin yerini, sonra merkezi konumu sıfır. </li><li> Üst yüzeyine sonuna değirmen biraz dokunarak odası yüksekliği (z-ekseni) Edinme ve yüksekliği sıfır. </li><li> Bir 3.91 mm (0,154 &quot;) freze ucu kullanarak, ilk rezervuar için x-ekseni (pozitif yönde) boyunca bit 3.03 mm ofset. 2.84 mm derinliğe kadar odasına işleme başlayın tam rezervuar ters (negatif) yönde &quot;(7,62 mm 0,300) için seçeceğimiz sonra ve 7.62 mm (0.300)&quot; için y-ekseni (pozitif yönde) boyunca hareket ederken 15.24 mm (0.600 &quot;) uzunluğu. Dengelemekx-ekseni (negatif yönde) boyunca 3,03 mm (0,119 &quot;) bit ve ikinci rezervuar için aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Onun kenarında odasına yerleştirin ve deney sırasında orta yükleme odasının yan rezervuarın sonunda her bağlandığında rezervuar (toplam 4) ucunda bir 1.09 mm (0.043) matkap ucu kullanarak bir delik açın. </li><li> Herhangi bir kimyasal kirleticiler kaldırmak için ılık sabunlu su ile iyice odası bekletin. </li><li> Herhangi bir sabun kaldırmak için çift distile su ile iyice odası bekletin ve durulayın. Odası hemen yukarıda tarif edildiği gibi kullanıma hazırdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice.">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Gövde NCCS üzerine kemotaksis araştırmaların yapılması nedenlerle bir dizi için zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, gövde NCCS gövde düzeyinde NT birincil eksplantasyonunun alınmalıdır; Trunk NCCS kültürlü uzun vadede ise farklılaştıracak bir heterojen kök hücre popülasyonu oluşturur. In vitro homojen dağıldığı hücre popülasyonlarının kemotaktik yanıtı incelemek için konvansiyonel yöntemler onlar ilk hücreler izole ve kemotaksis odası (örneğin, bir Boyden çemberinin 12) replated homojen olmasını gerektiren bu yana gövde NCCS üzerinde test etmek zordur. NTS onlarca eksplantasyonunun hatta bir deney için yeterli gövde NCCS homojen bir dağıtım oluşturmak için gerekli olabilecek yeterli NCCS Yalıtımlı sıkıcı olabilir. Ayrıca, NCCS, kaldırdı karışık ve homojen doğal bağlamında yeniden dağıtılabilir asla. Bu nedenle, bazı geleneksel kemotaksis deneyleri gerçekleştirmek için replated edilmektedir NCCS davranabiliroldukça farklı göç davranışları açısından in vivo koşullarda gelen. Burada, biz daha doğal bir bağlamda gövde KKK kemotaksis değerlendirmek için modifiye tekniği tarif. Homojen olmayan dağılım gövde NCCS ve kemotaktik yanıtı değerlendirmek büyük bir zorluk, doğuştan kimliğinin heterojen ek olarak orijinal eksplant kültürünü içinde NCCS en güçlü doğal polarite olup. Örneğin, gövde NCCS NT&#39;den (uzak) büyük ölçüde dik göç eğilimi zaman kültür 13. Çeşitli faktörlerin eksplant kültür içinde nüfuz gövde KKK polarite bu kesin bir chemotactant degrade tarafından indüklenen hücre polarite değişiklikleri tespit etmek zordur o kadar güçlü olabilir ki. Ayrıca göç eden diğer parametreleri izlerken bizim yeni modifiye Zigmond tahlil kullanılması, kültür ve bir chemotactant degrade tarafından indüklenen değişiklikleri eksplantasyona özgü doğa hücre polarite ayırt etmek mümkündür<html> Böyle kalıcılığı ve hız gibi ters. Biz bir Eksplante gövde KKK kültürünün her bir sınır yüzleri açısı büyük ölçüde o sınırda öncü gövde NCCS doğasında yönünü belirler olduğunu gözlemledim. Bir NCC kültürünün bir sınır kuzeye Örneğin, eğer, o sınır NCCS arasında ortalama yönü kuzey olurdu. Modifiye tahlil da uygulanabilir chemotactant gradyanı (Şekil 2A) göre göç hangi NCC sınır açı ile standardize öncü NCCS doğasında yön yol açtığı değişkenlik en aza indirir. Her zaman uygulanan degrade o düz KKK sınırında dik konumlandırma ve sonra yalnızca o sınır öncü hücrelerin göç izleme, gövde KKK kültürünün nispeten düz sınırında öncü NCCS seçerek, tek bir vardiya tespit edebiliyor aksi takdirde fark edilmeden gidip bir chemotactant kaynağından doğru veya uzakta gövde NCCS arasında ortalama yön içinde. Aşağıda ent &quot;&gt; Yukarıdaki protokol türetilen sayısız yararları bir özetidir: <ol><li> Bu canlı hücre göçü izlemek için yeteneği sunar. </li><li> Modifiye Zigmond haznesi bir floresan molekül (Şekil 3) ile görselleştirilebilir edilebilir bir görece tanımlanan gradyan üretebilir. </li><li> Zigmond odaları önce başkaları 10,14 tarafından tanımlanan standart Boyden testin bazı sınırlamalar kaçının. </li><li> Bizim değiştirilmiş Zigmond odaları çok düşük bir maliyet (malzeme yeniden kamara başına en az 1 USD olarak tahmin edilmektedir) da ev yapılabilir. </li><li> Nöral tüp lamelleri kültüre ve daha sonra vazelin ile kapatılmış olduğundan, biri kolayca gelecekte uygulanacak degrade göre kültür yönünü seçebilirsiniz. </li><li> Tripsinizasyonla ya da hücre kazıyıcı gerekli değildir. </li><li> NT izolasyonlar sadece çok küçük bir miktar gerekli değildir. </li><li> KKK kültürü zaman hücreler daha vivo bulunan gövde NCCS dağılımı daha benzerkaldırdı ve homojen bir dağılım ile replated edilir. </li></ol> Bu avantaj, muhtemelen, diğer hücre tipleri arasında benzer birincil eksplant kültürleri için de geçerli olacaktır ve bu nedenle, bu yaklaşım, eksplante diğer kök hücreler doğal göç davranışları değerlendirmede kullanılmak üzere geniş bir cazibe sahip olabilir. Modifiye Zigmond oda tahlil avantajları çok olmasına rağmen, bazı sınırlamalar yoktur. Standart Zigmond odasının bazı dezavantajları zaten geçmişte araştırmacılar 14 tarafından tartışılmıştır. Modifiye Zigmond testinin bir sınırlama CS montaj ve her rezervuar deliği tıkamak için vazelin kullanılmasıdır. Saf vazelin bir esneklik sağlar yönlendirmek için tam bir NCC chemotactant gradyan göre kültürü, ancak CS ve uygulanan eğim 14 içinde değişkenlik neden olabilir köprü arasındaki mesafe değişkenliği yol açar. Ayrıca, montajCS ve vazelin ile odasına sızdırmazlık genellikle tuzakları köprü 14 boyunca akış küçük miktarlarda giden sıkıştırmak olabilir odasındaki küçük hava cepleri. Böyle akışı potansiyel bazı deneyler sırasında moleküler degrade bozabilir ve kişinin sonuçlarının artmış değişkenlik yol açabilir. Bu mümkün olsa da hava cepleri köprünün uçları (uzağa floresan yoğunluğu ölçüldü bölgesinden) karşı mevcut iken bile, bir Alexa Fluor 488 IgM konjugatı (Şekil 3) kullanılarak görselleştirilir zaman, şiddetli bir gradyan bozulma gözlenmemiştir . Bu nedenle, hatta potansiyel Alexa Fluor 488 IgM degrade kesintiye olabilir koşullar altında, degrade (yakın köprünün ortasına) ölçülen köprü alanında tehlikeye değildi. Biri son derece kararlı ve öngörülebilir hem de uzun vadeli bir degrade gerektiriyorsa, o zaman bu testte olasılıkla yeterli olmayacaktır. Bununla birlikte, bu tür hassas genellikle gerekli ve diğer bazı göre değilOrtak kemotaksisi testler (örneğin chemotactant batırılmış boncuklar kullanarak Boyden testleri veya belirli deneyleri gibi), degrade daha istikrarlı ve öngörülebilir olması muhtemeldir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Omega Bilimsel </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin Streptomisin Çözüm </td><td> Omega Bilimsel </td><td> PS-20 </td><td> 100X Stok Konsantrasyon </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Omega Bilimsel </td><td> GS-60 </td><td> 100X Stok Konsantrasyon </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Omega Bilimsel </td><td> FB-11 </td><td> Lot # 105247 (veya karşılaştırılabilir başka) </td></tr><tr><td> Modifiye Zigmond odası </td><td> Home made </td><td> N / A </td><td> Rezervuar hacmi: ~ 160 ul adet, ek özellikler için, bkz. 4 ve ek imalat protokolü </td></tr><tr><td> Hücre kültürü çanak </td><td&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 x 10 mm </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> 10X Hazır 1 ml H2O ve 9 ml DMEM içinde 1 mg FN seyreltilmesi ile prepped </td></tr><tr><td> Lameller </td><td> Balıkçı </td><td> 12-548-B </td><td> Precleaned; 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> L15 orta </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> Vazelin </td><td> Comforts </td><td> 011110794642 </td><td> % 100 </td></tr><tr><td> Santrifüj tüpü </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Hücre Sistemleri </td><td> 4Z0-850 </td><td> 10X Stok Konsantrasyon </td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Iğne </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G x 1,5 inç </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488-IgM </td><td> Bennvitrogen </td><td> A21042 </td><td> Hazır 2 mg / ml &#39;dir; 7 mol boya / mol IgM </td></tr><tr><td> Diseksiyon Forseps </td><td> FST </td><td> Misc. </td><td> Dumont # 5 veya 55; düz uçlu, paslanmaz çelik ya da titanyum </td></tr><tr><td> Tungsten İğne </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Ev yapımı; pim tutucu yerleştirilir </td></tr><tr><td> Blunt Forseps </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> Yumurta sarısı Ringer embriyo transferi için kullanılır </td></tr></tbody></table> Ek Protokol: Modifiye Zigmond Odası Fabrikasyon Aşağıdaki protokol için bir referans olarak Şekil 4&#39;e bakınız: <ol><li> 3/16 &quot;kalınlığında akrilik cilalı (4.45 mm gerçek kalınlığı) bir levha satın alın. </li><li> Bir tablo kullanarak 33,25 mm x 64,57 mm kaba boyutları normalden büyük kamara boşlukları kesip, gördüm. Bu işleme için 3.175 mm ekstra malzeme sağlar. </li><li> Bir vi odacık blank ayarlayınse. 30.07 mm x 61.39 mm: Bir freze makinesi ve 6,35 mm (1/4 &quot;) freze ucu, finiş onların tam boyutlarına odasının tarafı ile. </li><li> Freze makinesi üzerindeki odacık blank konumlandırın ve x ve bir kenar bulucu ile y ekseni hem boyunca boş merkezinin yerini, sonra merkezi konumu sıfır. </li><li> Üst yüzeyine sonuna değirmen biraz dokunarak odası yüksekliği (z-ekseni) Edinme ve yüksekliği sıfır. </li><li> Bir 3.91 mm (0,154 &quot;) freze ucu kullanarak, ilk rezervuar için x-ekseni (pozitif yönde) boyunca bit 3.03 mm ofset. Y-ekseni boyunca hareket ederken (2.84 mm derinliğe kadar odasına işleme başlayın 7.62 mm (0.300 ile) yönünde pozitif 15.24 mm (0.600 &quot;) tam bir rezervuar uzunluğa karşı (negatif) yönünde)&quot; O) ve 7.62 mm (0.300 ile çapraz &quot;. X-ekseni (negatif yönünde) 3.03 mm (0.119 &quot;) için bit Ofset ve ikinci hazne için aynı işlem tekrarlayın. </li><li> Onun kenarında odasına yerleştirinve deney sırasında orta yükleme odasının yan rezervuarın sonunda her bağlandığında rezervuar (toplam 4) ucunda bir 1.09 mm (0.043) matkap ucu kullanarak bir delik açın. </li><li> Herhangi bir kimyasal kirleticiler kaldırmak için ılık sabunlu su ile iyice odası bekletin. </li><li> Herhangi bir sabun kaldırmak için çift distile su ile iyice odası bekletin ve durulayın. Odası hemen yukarıda tarif edildiği gibi kullanıma hazırdır. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

Nöral krest hücrelerinden (NCCS) epitelyal-mezenkimal geçiş 1,2 geçirildikten sonra dorsal nöral tüp (NT) göç omurgalı gelişimi mevcut hücrelerin geçici bir nüfusu vardır. Onların hedeflerine ulaşana kadar EMT ardından NCCS stereotipik yollar boyunca büyük mesafeler göç. NCCS nöronlar, glia, melanosit ve 1-3 kromaffin hücreleri de içeren farklı hücre tipleri geniş bir dizi farklılaşırlar. Onların doğru hedef konumlarına ulaşmak ve tanımak NCCS yeteneği gövde bileşenleri 3 NCC-türetilmiş içeren tüm yapıların uygun oluşumu için temel olduğunu. Gövde KKK göç için rehberlik mekanizmalarının aydınlatılmasına dolayısıyla büyük önem taşıyan bir konu olmuştur. Sayısız molekülleri KKK göç 4 yol gösterilmiştir. Örneğin, gövde NCCS bu tür Semaphorin, efrin ve yarık ligandları olarak 5-8 negatif kılavuz işaretler tarafından uzaklaştırılacaktır bilinmektedir. Ancak,Son zamanlarda gövde NCCS 9 belirlenmiştir herhangi chemoattractants kadar. Yapışık hücrelerin kemotaktik davranışlarını incelemek üzere in vitro yaklaşımlar Konvansiyonel ölümsüzleştirdiği, homojen dağıldığı hücreler en iyi şekilde çalışır, ancak başlangıçta homojen bir dağılım eksikliği ve hızla (örneğin NCCS gibi) ayırt bazı primer kök hücre kültürleri uygulamak daha zor. Kemotaksisi çalışmaları için gövde NCCS dağılımı homojenize Bir yaklaşım birincil NT eksplant kültürlerden gelen gövde NCCS izole etmektir, sonra kaldırın ve onları neredeyse% 100 konfluent olmak replate. Ancak, bu kaplama yaklaşım, zaman ve yeterli hücre eksplantasyona çaba önemli miktarda gerektirir sert olduğunu, ve in vivo koşullarda bulunan bir farklı şekilde gövde NCCS dağıtır. Burada, requirin olmadan gövde NCCS arasında kemotaksis ve diğer göçmen yanıtları değerlendirmek mümkün bir in vitro yaklaşımı raporhomojen hücre dağılımı ga. Bu teknik, primer time-lapse görüntüleme kullanan bir modifiye Zigmond odası (standart Zigmond odası başka bir yerde 10 açıklanan) iç gövde NCCS soğukkanlı. Bunların tahmin edilen doğal yön dik bir chemotactant gradyanı ile kültür çevresinde yer alan gövde NCCS açığa olarak, uygulanan chemotactant gradyanı ile oluşturulan göç polarite değişiklikler tespit edilebilir. Bu teknik, ucuz çoğaltma tedavi başına sadece iki NT eksplant kültür gerektirir, sert hücre kaldırma (örneğin tripsinizasyonla gibi) önler vivo koşullarda bir daha benzer dağılımda gövde NCCS bırakır eksplantasyonunun ve deneme arasındaki süreyi aşağı kesim (hangi büyük olasılıkla farklılaşma riskini azaltır), ve çok sayıda göçmen özellikleri time-lapse değerlendirilmesine olanak tanımaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Eksplante hücreleri (gövde nöral krest hücreleri) göçü analiz etmek bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, pahalı yumuşak, ve bu gibi ana gövde tepe nöral hücre kültürü içinde hücre-hücre etkileşimleri türetilmiş olanlar gibi, göç polarite hem chemokinesis ve diğer etkilerden kemotaksisi ayrım yapabilmektedir.

Bir Modifiye Zigmond Odası Testi kullanılarak Trunk Sinir Crest Hücre Göç Analizi

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

analysis-trunk-neural-crest-cell-migration-using-modified-zigmond

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.4K Görüntüleme.  California State University, Northridge. Eksplante hücreleri (gövde nöral krest hücreleri) göçü analiz etmek bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, pahalı yumuşak, ve bu gibi ana gövde tepe nöral hücre kültürü içinde hücre-hücre etkileşimleri türetilmiş olanlar gibi, göç polarite hem chemokinesis ve diğer etkilerden kemotaksisi ayrım yapabilmektedir.

Video: Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Nörobilim

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Hücre Testi Şekillendirme Sinir-Koloni: Sinir Progenitör Hücreler Bona Fide Sinir Kök Hücreler Ayırım Bir Testi

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Neuroblast Test: Akım Sitometri Kullanımı Farklılaşan Nöral Kök Hücre Döl nöronal Progenitör Hücrelerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi için bir Testi

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when studying the brain, as the functional role that a brain area fulfills may be largely defined by its connections to other brain areas. In this report, we describe a novel, non-invasive approach for relating brain structure and function using magnetic resonance imaging (MRI). This approach, a combination of structural imaging of long-range fiber connections and functional imaging data, is illustrated in two distinct cognitive domains, visual attention and face perception. Structural imaging is performed with diffusion-weighted imaging (DWI) and fiber tractography, which track the diffusion of water molecules along white-matter fiber tracts in the brain (Figure 1). By visualizing these fiber tracts, we are able to investigate the long-range connective architecture of the brain. The results compare favorably with one of the most widely-used techniques in DWI, diffusion tensor imaging (DTI). DTI is unable to resolve complex configurations of fiber tracts, limiting its utility for constructing detailed, anatomically-informed models of brain function. In contrast, our analyses reproduce known neuroanatomy with precision and accuracy. This advantage is partly due to data acquisition procedures: while many DTI protocols measure diffusion in a small number of directions (e.g., 6 or 12), we employ a diffusion spectrum imaging (DSI)1, 2 protocol which assesses diffusion in 257 directions and at a range of magnetic gradient strengths. Moreover, DSI data allow us to use more sophisticated methods for reconstructing acquired data. In two experiments (visual attention and face perception), tractography reveals that co-active areas of the human brain are anatomically connected, supporting extant hypotheses that they form functional networks. DWI allows us to create a "circuit diagram" and reproduce it on an individual-subject basis, for the purpose of monitoring task-relevant brain activity in networks of interest.

We describe a novel approach for simultaneous analysis of brain function and structure using magnetic resonance imaging (MRI). We assess brain structure with high-resolution diffusion-weighted imaging and white-matter fiber tractography. Unlike standard structural MRI, these techniques allow us to directly relate anatomical connectivity to functional properties of brain networks.

FMRI ve difüzyon ağırlıklı görüntüleme ile Beyin Yapısı ve Fonksiyonu Co-analizi

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

Dıştan Uygulanan Doğru Akım Elektrik Alanında Nöral Prekürsör Hücre Göç Kinetik Analizi için galvanotaksis Assay

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...