Wir geben besonderen Dank an Lino Kim, Steve Guzman und Ujit Satyarthi für die technische Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode. Myron Hawthorne, Richard Spengel und Roberto Rojas bearbeitet die Kammern verwendet hier und dringend benötigte technische Unterstützung. Bemerkenswert ist, produziert Roberto Rojas Abbildung 4. Wir sind auch dankbar für wertvolle Ratschläge Scott Fraser vor der Entwicklung der oben genannten Chemotaxis Assay. Diese Arbeit wurde teilweise durch eine NIH-MBRS SCORE-5S06GM048680-13 bis MEDB und durch eine Auszeichnung von der CSU, Northridge Diplomarbeit Support Program CW unterstützt.

Ein. Tag 1: Isolierung von Stamm neuronalen Rohre für Übernacht-Kultur auf Deckgläsern <ol><li> Inkubieren chick Eier für 56 h bei 38 ° C. Entfernen Sie die Eier aus der Inkubation, leicht besprühen sie mit 70% Ethanol und dann trocknen lassen. Die Eier öffnen sich in einem UV-sterilisiert Glasschale. </li><li> Extrahieren Sie jede Embryo aus Dotter und legen Sie sie in chick Ringer. Tun Sie dies, indem zuerst um seine Blutinseln mit gebogenen Schere, dann mit stumpfen Pinzette, wählen Sie die Embryos von seinem extraembryonalen Membran und legen Sie sie in einem sterilen Petrischale mit chick Ringer-Lösung. </li><li> Isolieren den Kofferraum jedes Embryos durch Trimmen überschüssige extraembryonalen Membranen sowie Schädel-, vagalen und sakralen axialen Ebenen mit einem Wolfram-Nadel (Abb. 1). Wählen Sie zunächst ca. 9 Embryonen, die zwischen den Stufen HH15-17 11 sind. Für Bühnen HH15 oder höher, bilden die Vorderhirns und Rautenhirn Achsen einen spitzen Winkel und damit der Kopf scheint kaudal kippen. BeiBühne HH17, der Schwanz ist bud Gegenwart und kippt ventral aber noch nicht enthalten Somiten. Mit einer Wolfram-Nadel, schneiden Sie extraembryonalen Membranen bis etwa 2 mm aus dem Embryo und schneiden Sie embryonalen Geweben vorderen bis 10 Somiten. Entfernen Sie auch alle caudal embryonalen Geweben ab etwa dem fünften meisten neu gebildeten Somiten. </li><li> Legen Sie die isolierten embryonalen Stämme in Dispase (0,24 U / ml DMEM) und inkubieren sie für 1 h 15 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Sobald die Stämme der Inkubation beginnen, starten Herstellung von 6 Deckgläser (CS) für die Kultivierung NT Explantate (Schritte von 1,5 bis 1,8). </li><li> Spülen 6 CS in 70% Ethanol (verdünnt in sterile, Reinstwasser) und dann trocknen lassen. Mit einem Labor-Marker, einen Kreis in der Mitte jeder CS, die etwa 1 cm im Durchmesser (dieser Kreis wird später helfen, herauszufinden, wo ein Fibronektin Mantel angewendet wurde) ist. Auf der gleichen Seite jedes CS, schreibt das Wort &quot;be&quot; (oder eine andere asymmetrische Wort oder Form) außerhalb des gezeichneten Kreis (dies y helfenou ermitteln, ob die markierte Seite des CS nach oben oder unten). </li><li> Platzieren Sie jede CS in einem separaten 40 x 10 mm sterile Schale mit der markierten Fläche nach unten und lassen Sie das Gericht zu sitzen unter einem keimtötende UV-Lampe für 10 min geöffnet. </li><li> Anwenden 60 ul Fibronektin (FN; 10 ug / ml DMEM) mit dem unmarkierten Oberfläche des CS gleichzeitig dafür der gesamte Bereich innerhalb des Kreises 1 cm beschichtet wird. Die Schalen werden bei 37 ° C für 30 min inkubieren und dann sorgfältig absaugen Fibronektin aus jedem CS. </li><li> Eintragen von 250 ul &quot;Kultur&quot;-Medium [DMEM mit L-Glutamin (2 mM), Penicillin (100U/ml), Streptomycin (100 mcg / ml), 8% fetales Rinderserum (FBS)] zu dem FN-beschichtete Fläche die CS. Die Schalen werden mit jeder CS bei 37 ° C und 5% CO 2 wieder, bis die NTs isoliert wurden. </li><li> Übertragen Sie alle bebrüteten Embryo Stämme zu einem 5 cm Glas-Petrischale mit L15 Medium und starten Sezieren aus jeder NT mit feinen Pinzette und eine Wolfram-Nadel (Abb. 1). Ct ein sorgfältig entlang der Grenze des NT und Somiten scheibe mit einem scharfen Wolframnadel während es nicht auf die vorsichtige NT beschädigen. Es ist oft einfacher zu beginnen Isolieren jeder NT aus dem kaudalen fast Ende des Rumpfes. </li><li> Wählen Sie 6 der geradesten und längste NTs die Kultur über Nacht (NTs zwischen etwa 8 und 15 Somiten lange werden empfohlen). Verwendung einer Mikropipettenspitze mit Kulturmedium grundiert übertragen jeder der 6 NTs seinen eigenen zuvor hergestellten CS (ab Schritte 1.5 bis 1.8). Achten Sie darauf, dass das NT bleibt nicht an der Oberfläche schwimmen. Wenn das NT schwebt, tropft Medium auf ihn, bis er mit einer Mikropipette sinkt. </li><li> Platzieren Sie jede Schale bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht. Vorsichtig sein, um sicherzustellen, dass jedes NT ist innerhalb der FN-beschichteten Bereich seiner jeweiligen CS unmittelbar vor dem Platzieren der Schale in den Inkubator (mithilfe des Kreises im Schritt 1.5 als Referenz gezeichnet). Ein Mikropipette kann zur besseren Einstellung der Position jedes NT, wenn nötig. </li><li> Place atmindestens 2 ml Kultur-Medium (ohne Serum) in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen eingewogen und bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht. Lassen Sie die Kappe leicht abgeschraubt, um den pH-Wert des Mediums über Nacht anpassen können. Pre-Inkubieren des Mediums ist wichtig, um zu verhindern Blasenbildung in deine Kammer, die die Einrichtung eines molekularen Gradienten stören können. Solche &quot;vorinkubierten&quot; Medium sollte bei allen künftigen Maßnahmen verwendet werden. Wenn nicht verwendet wird, sollte dieses Medium bei 37 werden Inkubation ° C. </li></ol> 2. Tag 2: Laden des modifizierten Zigmond Kammer und Zeitraffer-Analyse der Zellmigration <ol><li> Von den 6 NTs kultiviert, wählen Sie die 3 Kulturen am besten für die Analyse geeignet. Im Allgemeinen sollte NCC Kulturen, die mindestens eine lange, gerade Kante haben, ausgewählt (2A) ist. Die 3 besten Kulturen zum Laden und Film 3 geändert Zigmond Kammern den ganzen Tag, jeder mit einer anderen Behandlung. Von den 3 Kulturen, wählen Sie ein für loading die erste Kammer und händigt die übrigen in den Inkubator für die spätere Verwendung. </li><li> Mit einem Wattestäbchen, eine dünne, gleichmäßige Schicht Vaseline rund um die Stauseen und Brücke ein modifiziertes Zigmond Kammer. </li><li> Mit einem Wolframnadel, entfernen die vom NT CS, während er die umgebenden NCCs an der Oberfläche des CS. Markieren Sie die Schale mit einem Stift, um die Ausrichtung der geradesten Rand des NCC Kultur erinnern. </li><li> Legen Sie ein paar Tropfen vorinkubierten Medium auf der Brücke. Nehmen Sie den CS mit feinen Pinzetten, dab die Kante der CS gegen einen Kimwipe die meisten der alten Kulturmedium zu entfernen, dann sofort den CS auf der modifizierten Zigmond Kammer, so dass die gerade Kante der Kultur gefilmt werden über zentriert ist die Länge der Brücke und etwa senkrecht zu der Brücke-Reservoir Rand (2A, B). </li><li> Mit einem inversen Mikroskop, bewegen Sie den geraden NCC Grenze auf der Seite der Brücke am nächsten th werdene Reservoir, das den mutmaßlichen chemotactant enthalten wird (Abb. 2B; für die Kontrollen wird dies auf den niedrigeren Reservoir geladen Sekunden entsprechen). Auch feiner auszurichten die gerade Kante der Kultur auf senkrecht zur Brücke-Reservoir Grenze sein. </li><li> Sorgfältig, aber sicheren drücken CS in die Vaseline auf dem Zigmond Kammer ein, dass sie vollständig auf die Kammer versiegelt, dann stellen zusätzliche Vaseline entlang der Kante des CS weiter sicherzustellen, dass es luftdicht sein. Feineinstellung des Winkels des NCC Grenze wieder für jede Bewegung beim Siegeln zu korrigieren. </li><li> Legen Sie den Behälter, die nicht enthalten, werden die vermuteten chemotactant ersten (Abb. 2B). Tun Sie dies, indem er ein 1-ml-Spritze (25 G x 1,5 in. Kanüle) mit rund 300 ul vorinkubierten mittel-und injizieren das Medium in den Behälter bis zur vollständigen (dabei darauf achten, dass keine Luftblasen in den Behälter zu erzeugen). Stecken des Reservoirs auf beiden Seiten mit einer ausr.iziente Menge Vaseline vor dem Laden des nächsten Behälter. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2,7, außer dieser Zeit mit vorinkubierten Medium mit den Kandidaten chemotactant. Es ist wichtig, bei der Erzeugung eines molekularen Gradienten über die Kultur immer laden das Reservoir enthält das Molekül nach dem Laden das Reservoir fehlt den getesteten Molekül getestet werden. </li><li> Setzen Sie den geladenen Zigmond Kammer bei 37 ° C für 1 h vor den Dreharbeiten zu inkubieren. Bild der geradeste Rand des NCC Kultur für 3 h bei 90 s-Intervallen während der Inkubation bei etwa 37 ° C (Abb. 2A, B). Vor dem Erstellen jeden Film ist, lesen Sie die Kamera so ausrichten, dass der Rand der Bilder zu erhalten und mit berühren den Rand der Brücke, die die letzte Reservoir geladenen grenzt (2B, obere Platte ausgerichtet sind; gestrichelten Kasten stellt ideale Position für imaging). Dies wird später Softwareanalyse durch Standardisieren die Direktionalität des molekularen angelegt, und th erleichterne Abstand von dem Reservoir in jedem Film gedreht hergestellt. </li><li> Für Steuerelemente, die Schritte 2,2-2,9 für jede der zwei anderen Kulturen NCC ausgewählte (Schritt 2.1), aber erfüllen jedes Reservoir mit einem geeigneten Medium. Für eine Regelungsart füllen beide Reservoire mit vorinkubierten Medium ohne das Molekül getestet werden. Für eine zweite Kontrolle der Behandlung, prime die Brücke mit ein paar Tropfen vorinkubierten Medium mit dem Verdacht auf chemotactant vor der Montage der CS. Dann laden beide Reservoire mit dem gleichen Medium, enthaltend den mutmaßlichen chemotactant. </li><li> Verwenden ImageJ (NIH) Manuelle Spur <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">(rsb.info.nih.gov / ij / plugins / Track / track.html)</a> und Chemotaxis und Migration Tool v1.01 <a href="http://www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html">(www.ibidi.de / applications / ap_chemo.html)</a> plugins zu verfolgen die Migration von peripheren NCCs entlang der geraden Rand der Kultur just abgebildet und auf verschiedene Parameter der wandernden Trajektorien erhalten (2B-C) zu analysieren. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Eine Probe von Zellen aus einem Film Trajektorien wo viele Stamm NCCs waren auf ein Kandidaten-chemoattraktive Verwendung des oben gezeigten Technik wird (2D). Die meisten Zellen in diesem Beispiel einer positiven Antwort erscheint eine Netto-Bewegung bis der Lockstoff-Gradienten (in Rot dargestellt). Trajektoriendaten verwendet, um andere Eigenschaften der Zellwanderung und analysieren. Um visuell auswerten einer angelegten Gradienten in einer modifizierten Zigmond Kammer, eine Alexa Fluor 488 IgM-Konjugat (MW ~ 900 kDa) wurde in das zweite Reservoir eines modifizierten Zigmond Kammer (bei ​​etwa 40 pg / ml H 2 O) geladen. Ein Gradient wurde durch 1 h festgelegt und noch etwas vorliegenden nach 26 h, aber stark von 50 h vermindert (Abb. 3). Wenn das Molekül zu testenden kleiner ist, dann wird die angewandte Gradienten will schneller abbauen als das, was angezeigt wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig1.jpg" /> Abbildung 1. Explantation der Stamm-Ebene NTs über Nacht Kultivierung auf Fibronektin-beschichteten Deckgläschen. Weil Stamm NCCs delaminieren aus dem dorsalen NT befindet sich neben Somiten 8-28 wird dieses Segment des NT durch Mikrodissektion und über Nacht auf einem fibronektinbeschichtete CS für Auswanderung von NCCs aus dem NT Explantat ermöglichen isoliert. Isolated NTs, die zwischen 8-15 Somiten langen und relativ gerade sind am besten über Nacht Kultivierung geeignet, da sie an NCC Kulturen mit längeren geraden Grenzen ergeben neigen. Regionen des Neuralrohrs, die zu anderen Neuralleiste axialen Ebenen geben in einer kleineren Schrift dargestellt. s, Somiten. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig2.jpg" /> Abbildung 2. Verfahren zur Auswertung der Migration von explantierten Trunk NCCsmit einem modifizierten Zigmond Kammer. (A) langgestreckten Rumpfes NCC Kulturen werden über Nacht kultiviert und von NTs resultierende NCC Kulturen mit wenigstens einem langen geraden Rand hergestellt werden für das Experiment ausgewählt. Die längste gerade Rand eines ausgewählten Kultur wird dann senkrecht zu der Brücke-Reservoir Rand positioniert ist, und somit parallel zum Vektor der Zukunft angewendet Gradienten. (B) Nach Feineinstellung der Position des NCC Kultur auf der Kammer und Abdichten Zigmond das Deckglas auf der Kammer, wird die Kammer geladen. Beim Testen Chemotaxis, das Reservoir, der nicht enthalten, werden die verdächtige chemotactant (-) geladen ersten und versiegelt. Dann wird das Reservoir mit dem anderen mutmaßlichen chemotactant (+) und versiegelten geladen. Peripheral NCCs entlang der zuvor ausgewählten Grenze kann dann abgebildet und verfolgt werden mit der manuellen Tracking-Plugin für ImageJ (unten). (C) Zahlreiche Zugvögel Eigenschaften als Reaktionum die aufgebrachte Gradient kann basierend auf Tracking-Daten beurteilt werden. Zum Beispiel kann ein Chemotaxis-Index durch Teilen einer Zelle Verschiebung entlang der x-Achse um die Gesamtdistanz es gewandert ableiten. (D) Ein Beispiel eines attraktiven Reaktion durch eine Zelle Trajektorie Plot ursprünglich von der Chemotaxis und Migration erzeugt wird gezeigt Tool Plugin für ImageJ. Der Ausgangspunkt jeder Trajektorie mit dem Ursprung (0,0) eingestellt. Man beachte, wie viel mehr Zellen in Richtung der Quelle anschließen chemoattraktive Massezentrum aller Zellen auf ihre endgültige Position zu migrieren (blaues Kreuz; alle Zellen gleich gewichtet) ebenfalls näher zu dem Chemoattractant Quelle. NCCs, Neuralleistenzellen; Red Spuren, Zellen, die zum Vorratsbehälter geladen mit migriert ein vermuteter chemoattraktive; Schwarz Spuren, Zellen, die auswärts migriert, (+), höhere chemotactant Konzentration; (-), niederes chemotactant Konzentration. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig3.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 3. Intensitätsprofile über die Brücke eines modifizierten Zigmond Kammer zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe eines Alexa Fluor 488 IgM Konjugat ist. Die Kammer wurde in ähnlicher Weise wie in dem Protokoll mit den wichtigsten Ausnahmen beschrieben geladen daß vorinkubierten Wasser (statt vorinkubierten Medium) benutzt, um den Antikörper zu 40 pg / ml zu verdünnen, und kleine Lufteinschlüsse waren an den Enden der Brücke (weg von der Scheibe, wo die oben Intensitätsprofile wo angenommen) vorhanden ist. Anfangs war kein Gefälle vorhanden in den meisten der Brücke. Mit 1 ha Gradient wurde gegründet und blieb bis 26 h vorhanden. Von 50 h die Anwesenheit des Gradienten inkonsistent zu unterschiedlichen Bereichen der Brücke war, und wenn vorhanden, wurde die Steilheit des Gradienten stark vermindert. Sämtliche Profile wurden von einer identischen scheibe über die Brücke (von einem brückenartigen Reservoir Rand zum anderen) mit AxioVision 4,6 Software generiert. Beachten Sie, dass auch während der LuftTaschen vorhanden waren, wurde die Steigung nicht gestört. Hohe, hohe Intensität, niedrig, niedriger Intensität, x-Achse, Abstand über die gesamte Breite der Brücke (2 mm), (+), mit dem Reservoir Alexa Fluor 488 IgM-Konjugat beladen; (-), Behälter nicht mit dem Konjugat beladen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig4.jpg" /> Abbildung 4. Modifizierte Zigmond Kammer Spezifikationen. Dargestellt ist ein Diagramm des modifizierten Zigmond Kammer welche hier zusammen mit seiner Maßangaben (± 0,2 mm). Die Messungen können moderat angepasst werden, um den individuellen Wünschen entsprechen. Supplemental Protokoll: Herstellung eines Modified Zigmond Kammer Bitte beachten Sie 4 als Referenz für das Protokoll in der folgenden Abbildung: <ol><li> Erwerben Sie ein Blatt 3/16 &quot;dick poliert Acryl (4,45 mm tatsächliche Dicke). </li><li> Mit einer Tischkreissäge, schneiden Kammer Rohlinge überdimensioniert, um diegroben Abmessungen von 33,25 mm x 64,57 mm. Dies ermöglicht 3,175 mm zusätzliches Material für die Bearbeitung. </li><li> Die Kammer leer in einem Schraubstock. Mit einer Fräsmaschine und einer 6,35 mm (1/4 &quot;) end mill bit, Fertigbearbeitung die Seiten der Kammer, um ihre genauen Abmessungen: 30,07 mm x 61,39 mm. </li><li> Positionieren Sie die Kammer leer auf der Fräsmaschine und suchen Sie die Mitte des Rohlings entlang der x-und y-Achse mit einem Kantentaster, dann Null das Stadtzentrum. </li><li> Erwerben die Kammer Höhe (z-Achse) durch Berühren des Schaftfräsers Bit auf der oberen Fläche und die Höhe Null. </li><li> Verwendung einer 3,91 mm (0,154 &quot;) Schaftfräser Bit, das Bit-Offset 3,03 mm entlang der x-Achse (positive Richtung) für das erste Reservoir. Beginnen Bearbeitung in die Kammer bis zu einer Tiefe von 2,84 mm während der Bewegung entlang der y-Achse (positive Richtung) bis 7,62 mm (0,300 &quot;) und dann zu durchqueren, um 7,62 mm (0,300&quot;) in der entgegengesetzten (negativen) Richtung bis zu einem vollständigen Reservoir Länge von 15,24 mm (0,600 &quot;). Offsetdruckdas Bit auf 3,03 mm (0,119 &quot;) entlang der x-Achse (negative Richtung) und Wiederholen des gleichen Verfahrens für die zweite Reservoir. </li><li> Positionieren der die Kammer an ihrem Rand und ein Loch mit einem 1,09 mm (0,043 Zoll) Bohrmeißel am Ende eines jeden Behälters (4 total), das das Ende des Reservoirs verbindet zu der Seite der Kammer für das Laden Medium während Experimentieren. </li><li> Weichen Sie die Kammer auch in warmem Seifenwasser zu helfen, entfernen Sie keine chemischen Verunreinigungen. </li><li> Spülen Sie die Kammer auch in doppelt destilliertem Wasser keine Seife entfernen. Die Kammern sind jetzt einsatzbereit wie oben beschrieben. </li></ol>

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice.">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dirigieren Chemotaxis Forschung am Stamm NCCs erwiesen Herausforderung für eine Reihe von Gründen. Trunk NCCs sind eine heterogene Stammzellen Bevölkerung unterscheiden, ob kultivierten langfristigen wird, daher trunk NCCs aus primären Explantation des Stamm-Ebene NT eingeholt werden muss. Herkömmliche Verfahren, die chemotaktische Reaktion von homogen verteilt Zellpopulationen in vitro zu untersuchen sind schwierig auf Trunk NCCs testen, da sie zuerst erforderlich, dass Zellen getrennt und homogen wiederplattierte im Chemotaxis Kammer (z. B. ein Boyden-Kammer 12) sind. Isolieren genug NCCs kann langwierig sein als die Explantation von Dutzenden von NTs erforderlich sein, um eine homogene Verteilung der Stamm NCCs genügt auch ein Experiment zu erzeugen. Zusätzlich werden NCCs nicht gehoben, gemischt und homogen in ihrem natürlichen Kontext umverteilt. Daher kann NCCs, die in Ordnung replattiert sind bestimmte konventionelle Chemotaxis-Assays durchführen verhaltenganz anders als in vivo-Bedingungen in Bezug auf das Zugverhalten. Hier beschreiben wir eine modifizierte Technik zur Auswertung trunk NCC Chemotaxis in einem natürlichen Kontext. Eine große Herausforderung bei der Auswertung der chemotaktischen Reaktion der Stamm NCCs ohne homogene Verteilung ist die starke inhärente Polarität NCCs innerhalb der ursprünglichen Explantatkultur zusätzlich zu den angeborenen heterogenen Identität. Zum Beispiel neigen Trunk NCCs weitgehend senkrecht zu migrieren (weg) vom NT wenn in Kultur 13. Die verschiedenen Faktoren, die Einfluss auf trunk NCC Polarität innerhalb der Explantatkultur kann so stark sein, dass es schwierig ist, eindeutig zu identifizieren Veränderungen in Zellpolarität durch eine chemotactant Gradienten induziert. Mit unserem neuen modifizierten Zigmond Assay ist es möglich, zwischen natürlichen Zellpolarität inhärenten Kulturen und Änderungen durch eine chemotactant Gradienten induzierten Explantation zu unterscheiden, aber auch die Überwachung anderer wandernder Parameter<html> Parameter wie Ausdauer und Geschwindigkeit. Wir haben beobachtet, dass der Winkel jedes Grenze eines explantierten trunk NCC Kultur steht bestimmt weitgehend die inhärente Ausrichtung der Spitzentechnologie trunk NCCs in dieser Grenze. Zum Beispiel, wenn ein Rand von einer NCC Kultur nach Norden ausgerichtet, dann die mittlere Direktionalität NCCs von dieser Grenze wäre nördlicher. Unsere modifizierte Assay minimiert Variabilität durch die inhärente Ausrichtung von Spitzentechnologie NCCs durch die Standardisierung der Winkel des NCC Grenze von denen sie wandern relativ zum angelegten chemotactant Gradienten (Abb. 2A) verursacht. Durch Auswahl Spitzentechnologien NCCs auf einem relativ geraden Rand des Rumpfes NCC Kultur, daß immer Positionieren geraden NCC Rand senkrecht zum angelegten Gradienten, und dann nur Verfolgen der Wanderung der Spitzen-Zellen auf dieser Grenze, ist man in der Lage zu detektieren Verschiebungen in der Zwischenzeit Direktionalität der Stamm NCCs hin zu oder weg von einer Quelle chemotactant die sonst würde unerkannt. ent &quot;&gt; Hier ist eine Zusammenfassung der zahlreichen Vorteile aus dem obigen Protokoll abgeleitet: <ol><li> Es bietet die Möglichkeit, Live-Zellmigration verfolgen. </li><li> Der modifizierte Zigmond Kammer kann eine relativ definierten Gradienten, die mit einem fluoreszierenden Molekül (Abb. 3) werden visualisiert. </li><li> Zigmond Kammern vermeiden, bestimmte Einschränkungen der Standard Boyden Assay zuvor von anderen 10,14 beschrieben. </li><li> Unsere modifizierte Zigmond Kammern können auf einem sehr niedrigen Kosten (Materialien werden bei weniger als 1 USD pro wiederverwendbare Kammer geschätzt) hausgemachte werden. </li><li> Weil neuronalen Rohre auf Deckgläsern gezüchtet werden und später mit Vaseline abgedichtet, kann man ohne weiteres entscheiden die Orientierung der Kultur bezogen auf die Zukunft angewendet Gradienten. </li><li> Trypsinisierung oder Zellabschabung ist nicht erforderlich. </li><li> Nur eine kleine Menge an NT Isolationen erforderlich. </li><li> Die NCC Kultur ähnlicher ist die Verteilung der Stamm NCCs in vivo gefunden als bei Zellenabgehoben und erneut ausplattiert mit einer homogenen Verteilung. </li></ol> Diese Vorteile würde wahrscheinlich auch analog primären Explantatkulturen anderer Zelltypen anwendbar, und daher kann dieser Ansatz eine breitere wünschenswert zur Verwendung in der Auswertung der natürlichen Zugverhalten von anderen explantierten Stammzellen. Obwohl die Vorteile des modifizierten Zigmond Kammer Assay viele sind, hat es einige Einschränkungen. Einige Nachteile der Standard Zigmond Kammer bereits von früheren Forschern 14 diskutiert worden. Eine Einschränkung der modifizierten Zigmond Assay ist die Verwendung von Vaseline zur Montage des CS und Verstopfen jedes Reservoir Loch. Vaseline ermöglicht die Flexibilität ein, genau orientieren ein NCC Kultur relativ zum chemotactant Gradienten, aber führt zu Schwankungen in der Entfernung zwischen dem CS und der Brücke, die Variabilität in der aufgebrachten Gradienten 14 verursachen könnte. Zusätzlich Montage derCS und Abdichten der Kammer mit Vaseline oft Traps kleine Taschen von Luft in der Kammer zu komprimieren, die die zu geringe Mengen der Strömung über die Brücke 14 könnte. Solche Strömung könnte stören die molekularen Gradienten während einigen Experimenten und führen zu erhöhten Variabilität in der eigenen Ergebnisse. Dies ist zwar möglich, wurde eine schwere Gradienten Störung nicht beobachtet, wenn visualisiert unter Verwendung einer Alexa Fluor 488 IgM-Konjugat (Abb. 3), selbst während Lufteinschlüsse vorhanden waren gegen die Enden der Brücke (weg von dem Bereich, wo Fluoreszenzintensität wurde gemessen) . Daher kann, selbst unter Bedingungen, die möglicherweise gestört haben die Alexa Fluor 488 IgM Gradienten konnte, wurde der Gradient nicht mehr im Bereich der Brücke gemessen (näher an der Mitte der Brücke) beeinträchtigt wird. Wenn man eine langfristige Gradienten, die sowohl sehr stabil und vorhersehbar erfordert, dann dieser Test wird wahrscheinlich nicht aus. Jedoch ist eine solche Präzision häufig nicht erforderlich und im Vergleich zu einigen anderengemeinsame Chemotaxis-Assays (wie Boyden-Assays oder bestimmte Tests unter Verwendung chemotactant-getränkten Kügelchen), ist die Steigung wahrscheinlich mehr stabil und vorhersehbar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Omega Scientific </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin-Lösung </td><td> Omega Scientific </td><td> PS-20 </td><td> 100X Lager Konzentration </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Omega Scientific </td><td> GS-60 </td><td> 100X Lager Konzentration </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Omega Scientific </td><td> FB-11 </td><td> Lot # 105247 (oder eine andere, die vergleichbar ist) </td></tr><tr><td> Modified Zigmond Kammer </td><td> Hausgemachte </td><td> N / A </td><td> Behältervolumen: ~ 160 ul ea, für zusätzliche Spezifikationen, siehe Abb. 4 und die ergänzende Herstellung Protokoll </td></tr><tr><td> Zellkulturschale </td><td&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 x 10 mm </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> 10X Lager vorbereitet durch Verdünnen von 1 mg FN in 1 ml H 2 O und 9 ml DMEM </td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Fischer </td><td> 12-548-B </td><td> Vorgereinigt; 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> L15 Medium </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> Petroleum Jelly </td><td> Comforts </td><td> 011110794642 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Zentrifugenröhrchen </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Cell Systems </td><td> 4Z0-850 </td><td> 10X Lager Konzentration </td></tr><tr><td> Spritze </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Nadel </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G x 1,5 Zoll </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488-IgM </td><td> Ichnvitrogen </td><td> A21042 </td><td> Stock ist 2 mg / ml; 7 Mol Farbstoff / Mol IgM </td></tr><tr><td> Dissektionszangen </td><td> FST </td><td> Misc. </td><td> Dumont # 5 oder 55; geraden gekippt; Edelstahl oder Titan </td></tr><tr><td> Tungsten Needle </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Hausgemachte; platziert in einem Stifthalter </td></tr><tr><td> Blunt Forceps </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> Wird für die Übertragung Embryonen Ringer aus Eigelb </td></tr></tbody></table> Supplemental Protokoll: Herstellung eines Modified Zigmond Kammer Bitte beachten Sie 4 als Referenz für das Protokoll in der folgenden Abbildung: <ol><li> Erwerben Sie ein Blatt 3/16 &quot;dick poliert Acryl (4,45 mm tatsächliche Dicke). </li><li> Mit einer Tischkreissäge, schneiden Kammer Rohlinge überdimensioniert, um den groben Abmessungen von 33,25 mm x 64,57 mm. Dies ermöglicht 3,175 mm zusätzliches Material für die Bearbeitung. </li><li> Die Kammer leer auf einer vise. Mit einer Fräsmaschine und einer 6,35 mm (1/4 &quot;) end mill bit, Fertigbearbeitung die Seiten der Kammer, um ihre genauen Abmessungen: 30,07 mm x 61,39 mm. </li><li> Positionieren Sie die Kammer leer auf der Fräsmaschine und suchen Sie die Mitte des Rohlings entlang der x-und y-Achse mit einem Kantentaster, dann Null das Stadtzentrum. </li><li> Erwerben die Kammer Höhe (z-Achse) durch Berühren des Schaftfräsers Bit auf der oberen Fläche und die Höhe Null. </li><li> Verwendung einer 3,91 mm (0,154 &quot;) Schaftfräser Bit, das Bit-Offset 3,03 mm entlang der x-Achse (positive Richtung) für das erste Reservoir. Begin Bearbeitung in die Kammer bis zu einer Tiefe von 2,84 mm während der Bewegung entlang der y-Achse ( positive Richtung) bis 7,62 mm (0,300) &quot;) und dann zu 7,62 mm (0,300 durchqueren&quot; in der entgegengesetzten (negativen) Richtung bis zu einem vollständigen Reservoir Länge von 15,24 mm (0,600 &quot;). Offset das Bit auf 3,03 mm (0,119 &quot;) entlang der x-Achse (negative Richtung) und wiederholen Sie den Vorgang für das zweite Reservoir. </li><li> Positionieren Sie die Kammer an ihrem Randund Bohren eines Loches mit einem 1,09 mm (0,043 Zoll) Bohrmeißel am Ende eines jeden Behälters (4 total), das das Ende des Reservoirs verbindet zu der Seite der Kammer für das Laden Medium während Experimentieren. </li><li> Weichen Sie die Kammer auch in warmem Seifenwasser zu helfen, entfernen Sie keine chemischen Verunreinigungen. </li><li> Spülen Sie die Kammer auch in doppelt destilliertem Wasser keine Seife entfernen. Die Kammern sind jetzt einsatzbereit wie oben beschrieben. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

Neuralleistenzellen (NCC) ist eine transiente Population von Zellen, die in Entwicklung von Wirbeltieren, dass aus dem dorsalen Neuralrohr (NT) auswandern nach Durchlaufen eines epithelial-mesenchymale Transition 1,2. Nach EMT, migrieren NCCs große Entfernungen entlang stereotypes Wege, bis sie ihre Ziele zu erreichen. NCCs differenzieren sich in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia, Melanozyten und Chromaffinzellen 1-3. Die Fähigkeit von NCCs zu erreichen und erkennen ihre richtigen Zielregionen für die entsprechende Ausbildung aller Strukturen mit trunk NCC-abgeleiteten Komponenten 3 grundlegend. Aufklärung der Mechanismen von Leitlinien für Trunk NCC Migration hat deshalb eine Angelegenheit von großer Bedeutung. Zahlreiche Moleküle nachgewiesen, dass NCC Migration 4 führen. Beispielsweise werden Trunk NCCs bekanntermaßen von negativen Führung Zeitgeber wie Semaphorin, Ephrin und Slit Liganden 5-8 abgestoßen werden. Allerdings sind nichtbis vor kurzem keine Lockstoffe des Rumpfes NCCs identifiziert worden 9. Herkömmliche Ansätze zur in vitro Untersuchung der chemotaktischen Verhalten von adhärenten Zellen funktionieren am besten mit immortalisierten, homogen verteilt Zellen, sind jedoch schwieriger zu bestimmten primären Stammzellkulturen die zunächst fehlt eine homogene Verteilung und rasch zu unterscheiden (wie NCCs) anzuwenden. Ein Ansatz, um die Verteilung der Stamm NCCs für Chemotaxisstudien homogenisieren ist die Trunk NCCs aus primären NT Explantatkulturen isolieren, dann heben und replate ihnen zu fast 100% konfluent. Dies erfordert jedoch plating Ansatz erhebliche Mengen an Zeit und Mühe, um genügend Zellen Explantation, ist hart und vertreibt trunk NCCs in einem ungleichen Weise wie in in vivo-Bedingungen gefunden. Hier berichten wir über eine in vitro Ansatz, der in der Lage, Chemotaxis und andere wandernde Reaktionen des Rumpfes NCCs ohne requirin bewerten istga homogene Zellverteilung. Diese Technik nutzt Zeitraffer-Aufnahmen von primären, unbeirrt trunk NCCs in einem modifizierten Zigmond Kammer (ein Standard Zigmond Kammer wird an anderer Stelle 10 beschrieben). Durch Belichten Trunk NCCs am Umfang der Kultur auf eine chemotactant Gradienten, die senkrecht zu ihrer vorhergesagten natürliche Richtung, können Veränderungen in wandernden Polarität durch die angelegte chemotactant Gradienten induzierte detektiert werden. Diese Technik ist kostengünstig, erfordert das Züchten von nur zwei NT je Wiederholung Explantate Behandlung vermeidet rauen Zelle Anheben (wie Trypsinisierung) verlässt Trunk NCCs in eine ähnliche Verteilung in vivo-Bedingungen, verkürzt sich die Zeitspanne zwischen Explantation und Experimente (was wahrscheinlich verringert das Risiko der Differenzierung), und ermöglicht Zeitraffer Auswertung zahlreicher wandernden Merkmale.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Ein Ansatz, um die Migration von explantierten Zellen (Stamm Neuralleistenzellen) analysieren beschrieben. Dieses Verfahren ist kostengünstig, leicht, und in der Lage zu unterscheiden Chemotaxis sowohl Chemokinese und andere Einflüsse auf wandernde Polarität wie die von Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb des primären Stamm Neuralleiste Zellkultur abgeleitet.

Analyse der Trunk Neural Crest Cell Migration mit Hilfe eines modifizierten Zigmond Chamber Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

analysis-trunk-neural-crest-cell-migration-using-modified-zigmond

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.4K Aufrufe.  California State University, Northridge. Ein Ansatz, um die Migration von explantierten Zellen (Stamm Neuralleistenzellen) analysieren beschrieben. Dieses Verfahren ist kostengünstig, leicht, und in der Lage zu unterscheiden Chemotaxis sowohl Chemokinese und andere Einflüsse auf wandernde Polarität wie die von Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb des primären Stamm Neuralleiste Zellkultur abgeleitet.

Serie: Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Forschung

Neurowissenschaften

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

Die Analyse der Neuralleiste Migration und Differenzierung von Cross-Spezies Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when studying the brain, as the functional role that a brain area fulfills may be largely defined by its connections to other brain areas. In this report, we describe a novel, non-invasive approach for relating brain structure and function using magnetic resonance imaging (MRI). This approach, a combination of structural imaging of long-range fiber connections and functional imaging data, is illustrated in two distinct cognitive domains, visual attention and face perception. Structural imaging is performed with diffusion-weighted imaging (DWI) and fiber tractography, which track the diffusion of water molecules along white-matter fiber tracts in the brain (Figure 1). By visualizing these fiber tracts, we are able to investigate the long-range connective architecture of the brain. The results compare favorably with one of the most widely-used techniques in DWI, diffusion tensor imaging (DTI). DTI is unable to resolve complex configurations of fiber tracts, limiting its utility for constructing detailed, anatomically-informed models of brain function. In contrast, our analyses reproduce known neuroanatomy with precision and accuracy. This advantage is partly due to data acquisition procedures: while many DTI protocols measure diffusion in a small number of directions (e.g., 6 or 12), we employ a diffusion spectrum imaging (DSI)1, 2 protocol which assesses diffusion in 257 directions and at a range of magnetic gradient strengths. Moreover, DSI data allow us to use more sophisticated methods for reconstructing acquired data. In two experiments (visual attention and face perception), tractography reveals that co-active areas of the human brain are anatomically connected, supporting extant hypotheses that they form functional networks. DWI allows us to create a "circuit diagram" and reproduce it on an individual-subject basis, for the purpose of monitoring task-relevant brain activity in networks of interest.

We describe a novel approach for simultaneous analysis of brain function and structure using magnetic resonance imaging (MRI). We assess brain structure with high-resolution diffusion-weighted imaging and white-matter fiber tractography. Unlike standard structural MRI, these techniques allow us to directly relate anatomical connectivity to functional properties of brain networks.

Co-Analyse von Hirnstruktur und-funktion mittels fMRT und Diffusionsgewichtete Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...