Bu çalışma NEI ve NIMH tarafından finanse edildi.

1. VideoSwitcher 1.1. Bir bilgisayar VideoSwitcher bağlan VideoSwitcher (Şekil 1) analog video (VGA) girişi alır ve katot ışın tüpü (CRT) renkli monitörü çalıştırmak için kullanılır. VideoSwitcher kullanmadan önce, bilgisayar grafik kartı ya bir VGA bağlantı noktası (Şekil 2A) veya Digital Visual Interface (DVI-I) hem dijital hem de analog video sinyallerini ileten bağlantı noktası (Şekil 2B) olduğundan emin olun. Bir DVI-VGA adaptörü (Şekil 2C) VideoSwitcher için DVI-I kapısına bağlamak için gereklidir. Bilgisayarı kapatın ve bilgisayar grafik kartından monitöre izlemek ve kesin. Sağlanan VGA kablosu kullanarak VideoSwitcher bir giriş portuna VGA veya bilgisayarın ekran kartının DVI-I portu bağlayın. Bağlantıları sabitlemek için küçük bir tornavida kullanın. VideoSwitcher bir çıkış portuna Monitörün VGA kablosunund bağlantıları sabitleyin. Sağlanan güç adaptörünü kullanarak bir güç kaynağına VideoSwitcher bağlayın. Bilgisayarı ve monitörü açın. 1.2. Video switcher iki görüntü modları VideoSwitcher açma kapama tuşuna kullanıcı iki ekran modu geri ve ileri-geçiş yapmanızı sağlıyor. Renk modunda, VideoSwitcher bilgisayar grafik kartından video sinyal değiştirmez. Grayscale modunda, ekran biraz kırmızı kanaldan sinyal etkilenen grafik kartının mavi kanalı ve yeşil kanal hiçbir katkısı video sinyali çoğunlukla belirlenir onun parlaklığı ile, tek renkli hale gelir. VideoSwitcher içinde resister ağ hiç katkıda bulunmamış 128 ile ilgili bir faktör ve yeşil kanaldan sinyal ile kırmızı kanaldan sinyal zayıflar olmasıdır. Mavi katkıları oranında birVideoSwitcher çıkışına d kırmızı kanalları mavi-to-kırmızı oranı (BRratio) denir. BRratio görüntü ayar bağımsız bir Video Switcher, mülküdür. Her VideoSwitcher (1.3) için deneysel olarak tespit edilebilir. Ekran modu da Matlab bir işlev çağrısı kullanarak grafik kartının yeşil kanal üzerinden özel bir sinyal göndererek açılabilir: PsychVideoSwitcher (&#39;switchmode&#39;, whichScreen, ToGrayMode); Burada 1 veya 0 anlamına gelir ToGrayMode gri tonlama veya renk moduna geçmek için. Şekil 3, bir VideoSwitcher şematik gösterir. 1.3. BRratio ölçün BRratio bir kare dalga ızgara algılama görevini kullanarak her VideoSwitcher için ölçülebilir. Kare dalga iki düzey gibi (0, 0, 40) olarak RGB değerlerinin tahsis ve (x, 0, 39). Edilir Bir kare dalga ızgaranın kadar x değerini ayarlayabilirsinizbu noktada x değeri BRratio olduğu --- B-kanalında sinyalinin bir birim tarafından üretilen yoğunluğu yol açar R-kanal sinyalinin büyüklüğü, kaybolur. Bir elektronik BRratio ölçebilirsiniz rağmen, RGB değerleri (0, 0, 255) ve (255, 0, 0) bir VideoSwitcher gerilim çıkışları oranını ölçmek için, örneğin, burada açıklanan psikofiziksel yöntem çok basit ve doğru. 1.4. Kalibrasyon Göster Çoğu monitör için ekran parlaklık bilgisayar grafik kartı tarafından belirtilen piksel gri düzeyi ile doğrusal olarak artmaz. Ilişkisi gibi tarif edilebilir: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> Burada L max, L min ve γ ya fotometreleri kullanarak veya psikofiziksel usul ve fotometrik ölçümler 7,8 kombinasyonu ile, bir Gamma düzeltme prosedürü ile belirlenir. Gamma kalibrasyon importan olduğunuBir ekranda doğru zıtlıklar üretmek için t; her ekran cihaz için yapılmalıdır. Bir fotometre ile, tek bir basit farklı piksel graylevels (örneğin, 0 ile 255 arasında) büyük bir üniforma kare görüntüleyebilir, kare merkezinin parlaklık ölçmek ve γ elde etmek için Denklem 1 ile sonuçlar uyacak. Psikofiziksel prosedürü sıfır ve tam piksel yoğunluğu ve bitişik homojen alan piksel graylevel değer belirleme eşit miktarda olası bir karışımı (uzay ve zamanda () gibi üniforma olarak, izleme yüzeyinin bir alanda, oluşturulmasını içerir aldığı tüm pikseller karışık piksel kapladığı alanın parlaklığına bir psikofiziksel maç ürettiği) aynı yoğunluk var. İlk maç maksimum parlaklık 1/2 için graylevel değerini belirler. Parıltı yoğunluğu 1/2 ve 1 ile piksel ile bir karışımı, 3/4 değeri belirlemek için kullanılır, ve bu prosedür tekrarlandı kadar yedi değerleri fROM 1/8 7/8 tespit edilmiştir. Bu sonuç tekrarlanır ve kıvamı için çeşitli kontrol gibi doğrulama gibi, gerçekleştirilmesini 3/4 ve 1/4 sonuç 1/2 karışımı. Bu prosedürde, B ve homojen bir alanın R düzeylerini hem de ayarlanır ve U = B + R / BRratio. Γ sonuçları elde etmek için Denklem 1 ile uyum edilebilir. Biz L dk, L max ve γ değerleri edindikten sonra, biz L 0 = (L max + L dk) / 2, piksel kontrast c (U) ve piksel gri seviyesi U arasındaki ilişki, arka plan aydınlatma ayarlayabilirsiniz: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq2.jpg" alt="Denklem 2" /> Biz belirli bir kontrast için gerekli gri seviye için çözmek denklemi yazabilirsiniz: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq3.jpg" alt="Denklem 3" /> U normal tamsayı olmayan bir sayıdır. Pikselin RGB değeri: R = BRratio * [U-int (U)], G = 0, B =int () girişinin tamsayı değeri alır int (U),. 1.5. Bir sinüs dalgası ızgaranın Demo Artan gri kararın etkisi iki sinüs dalgası ızgaralar karşılaştırılarak gösterilebilir. Soldaki ızgaranın uygun R ve B değerleri ile belirtilen her bir piksel ile birlikte yoğunluğu VideoSwitcher tam kapasitesine kullanır. Sağda ızgaranın sadece yuvarlatılmış U bir 8-bit görüntüleme cihazı çıkış taklit, her bir piksel B değeri olarak kullanılan başka bir sol aynıdır. 2. RTbox 2.1. Bir bilgisayar RTbox bağlan Sağlanan kablo ile bilgisayarın USB portuna RTbox (Şekil 4) bağlayın. Gerekirse, ikinci cihazın sürücüsü indirmek <a href="http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm">http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm</a> . Internet sitesindeki talimatları izleyerek sürücüyü yükleyin. 2.2. RT kullanıntepki süresi ölçmek için kutu RTbox iki farklı şekilde kullanılabilir. Kullanıcının programı, Ekran tarafından döndürülen zaman güvenilir uyaranın başlangıcından kez dönebilirsiniz Eğer Psychtoolbox içinde (&#39;Flip&#39;) ve PsychPortAudio [8], RTbox sadece bir klavye gibi kullanılabiliyor. Uyaranın başlangıcından süreleri ve RTbox düğmesine kez ana bilgisayar ve RTbox saatlerini tabanlı olduğundan, sırasıyla, biz iki eşitleneceği gerekir. Bu tampon istenmeyen olayları temizlemek için her uyaranın başlangıcından önce bir işlev çağrısı RTBox (clear) ile yapılır. Tepki süresi basit olarak ölçülebilir t resp = t - t tonset kullanıcı programı dönen uyaran başlangıç, ve t işlev çağrısı [t, düğme] tarafından döndürülen düğmesine zamanı = RTBox (zaman aşımı). RTBox sürücü otomatik olarak bilgisayar zaman barındırmak için RTbox zaman zaman düğmeye dönüştürür olmasıdır. Kullanıcı programı yapamaz isegüvenilir uyaranın başlangıcından kez dönmek, uyaran başlangıçları belirten tetikleme sinyalleri RTbox sağlanmalıdır. Bir çözüm uyaranın başlangıcı veya uyarana senkronize bir ışık yama algılamak için bir ışık sensörü kullanmaktır. Işık sensörün çıktısı RTbox ışığında port bağlanmıştır. Bir ikinci çözelti VideoSwitcher bir tetik çıkış kullanmaktır. Tetikleyici doğrudan RTbox arasında puls porta bağlanabilir. Üçüncü bir çözeltisi RTbox bir ses noktasına ana bilgisayarın ses sinyalini etmektir. VideoSwitcher bir uyaranın başlangıcından tetikleyici oluşturmak için, biz görsel uyaranın ilk çerçevenin merkezi kısmında piksel yeşil kanal &quot;açmak&quot;. Bu direnç ağını katkı yapmadığından, yeşil kanalda sinyal konuya görünmez. Bir işlev çağrısı [t, düğme] &#39;darbe&#39; yi hesaplamak için RTbox talimatını burada = RTBox (&#39;darbe&#39;, zaman aşımı), tepki süresi döndürür<html> O tetiği zaman göreceli yanıt. Aynı fonksiyon çağrı ses tetikleyici için kullanılır. Işık sensörü tetikleyiciler için, işlev çağrısı [t, düğme] ise = RTBox (zaman aşımı, &#39;hafif&#39;). 3. VideoSwitcher ve RTbox entegre Biz ekran, doğru yanıt süresi toplamak için RTbox ve bir ERP sistemine olay kodu ve yanıtları göndermek için RTbox kontrol etmek VideoSwitcher kullanan bir gösteri programı programlanmış var. Programı indirebilirsiniz <a href="http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m">http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m</a> . 4. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Bir video switcher resmi. Bu VGA giriş ve çıkış noktaları (iki kadın), iki ekran modları arasında geçiş yapmak için bir düğme ve bir tetikleyici çıkış portu vardır. ontent &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> VGA (A) ve DVI-I (B) portu ve bir DVI-I VGA adaptörü (C). Şekil 2. Resimleri <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Bir video switcher şematik. Çoklayıcı bir gerilim seviyesi ile kontrol iki giriş modları vardır. Bu şemada gösterilen modunda iken, bir monitörün RGB kanalları aynı sinyali almak, görüntü modu Gri tonlamalı yani. Anahtarlama gerilimi G-kanal ve anahtar düğmesi sinyalleri tarafından kontrol edilen bir CPLD çip, tarafından üretilir. Tetikleyici ayrıca G-kanal giriş tarafından kontrol edilmektedir. <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Bir RTbox resmi. Bu bir USB-B bağlantı noktası, bir ışık girişi bağlantı noktası, bir darbe / ses girişi bağlantı noktası, harici bir düğmeye giriş portu ve bir TTL çıkış portu vardır.

<ol>
	<li>Li, X., Lu, Z. -. L., Xu, P., Jin, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+high+gray-level+resolution+monochrome+displays+with+conventional+computer+graphics+cards+and+color+monitors.">Generating high gray-level resolution monochrome displays with conventional computer graphics cards and color monitors.</a> Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 9-18 (2003).</li><li>Pelli, D. G., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+control+of+contrast+on+microcomputer+displays.">Accurate control of contrast on microcomputer displays.</a> Vision Research. 31, 1337-1350 (1991).</li><li>Li, X., Liang, Z., Kleiner, M., Lu, Z. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTbox:+A+device+for+highly+accurate+response+time+measurements.">RTbox: A device for highly accurate response time measurements.</a> Behavior Research Methods. 42 (1), 212-225 (2010).</li><li>Lu, Z. L., Sperling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-order+reversed+phi.">Second-order reversed phi.</a> Perception Psychophysics. 61, 1075-1088 (1999).</li><li>Colombo, E., Derrington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+calibration+of+CRT+monitors.">Visual calibration of CRT monitors.</a> Displays. 22, 87-95 (2001).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Video switcher yüksek parlaklık çözünürlüklü geleneksel bilgisayar grafik kartları ve analog renkli monitör kullanıyorsanız görüntüler oluşturmak için kompakt, ucuz ve kolay kullanımlı bir yöntem sağlar. Bu grafik kartı ve monitör analog çıkış arasına bağlanır. Ayrıca ek bir kolaylık sağlayan, monokromatik ve kromatik ekran modları arasında geçiş yapabilirsiniz. Onun tetiği kanal araştırmacılar görsel görüntüler için diğer ekipman senkronize etmenize olanak verir. RTbox bir kompakt, ucuz ve kolay kullanımı doğru tepki süresi ölçümü için donanım / yazılım çözümü. Uyaran başlangıçları ile senkronize dış tetikleyiciler varsa, RT ölçümler ana bilgisayarın tamamen bağımsızdır. Görsel uyaranlar için, fotodiyotlar tarafından üretilen almak için yerleşik bir ışık noktası tetikleyiciler tasarlanmıştır. Dış tetikleyiciler de kullanıcı programı tarafından döndürülen uyaranın başlangıcından zaman kalibre etmek için kullanılabilir. Kullanıcı programı sağlayabilirAna bilgisayar ve RTbox arasında kesin uyarı başlama zamanı, doğru senkronizasyon RTbox sürücüsü tarafından elde edilebilir, RTbox herhangi bir dış tetikleyici olmadan doğru RT ölçümler elde etmek için kullanılabilir böylece. Ayrıca tüm giriş sinyalleri ve olay işaretleri böyle bir EEG sistemi gibi diğer aygıtlar için böyle bir MR uyumlu düğmesi kutusundan çıkışları gibi dış düğmesi sinyalleri alabilir ve iletebilir. Bu eş zamanlı EEG / MRG kayıt sistemleri için bir arayüz olarak hizmet verebilir.

enabling high grayscale resolution displays and accurate response time measurements on conventional computers

Geleneksel bilgisayar grafik kartları dayalı görüntü sistemleri 8-bit gri seviye çözünürlükte görüntü üretme yeteneğine sahiptir. Ancak, vizyonu araştırma en deneyleri parlaklık çözünürlüğü fazla 12 bitlik görüntüler gerektirir. Çeşitli çözümler mevcuttur. Bit + + 1 ve DataPixx 2 analog görüntüleme cihazları sürmek için (14 veya 16-bit) dijital-analog çeviriciler grafik kartları ve yüksek çözünürlüklü gelen Digital Visual Interface (DVI) çıkışı kullanın. VideoSwitcher 3 pasif bir resister ağı 4 ve renkli monitör üç kanal aynı video sinyalleri sunmak için aktif bir devre kullanarak farklı ağırlıklara sahip ekran kartları, kırmızı ve mavi kanalları analog video sinyallerini birleştirir Burada anlatılan. Yöntemi geleneksel grafik kartları ve analog monitör kullanarak yüksek çözünürlüklü monokrom ekranlar etkinleştirmek için ucuz bir yol sağlar. Ayrıca işaretlenmesi için kullanılan edilebilir tetikleyici sinyalleri sağlayabiliruyaran başlangıçları, kolay fizyolojik kayıtları veya tepki süresi ölçümleri ile görsel görüntüler senkronize hale. Bilgisayar klavye ve fareler sıklıkla tepki süreleri (RT) ölçüm kullanılmasına rağmen, bu ölçümlerin doğruluğu oldukça düşüktür. RTbox doğru RT ölçümleri için özel bir donanım ve yazılım çözümüdür. USB bağlantısı üzerinden ana bilgisayara bağlandı, RTbox, sürücünün tüm geleneksel işletim sistemleri ile uyumludur. Bu ana bilgisayar bunları alır kadar arabelleğe düğmesi olaylar, kimlikler ve zamanlama kaydetmek için bir mikroişlemci ve yüksek çözünürlüklü saati kullanır. Kaydedilen düğmesi olaylar potansiyel zamanlama belirsizlikler veya ana bilgisayar veri iletim ve işleme ile ilişkili tercihlerinden etkilenmez. Asenkron depolama büyük ölçüde kullanıcı programlarının tasarımı basitleştirir. Çeşitli yöntemler ile RTbox saatler ve ana Comput eşitlemek için kullanılabilener. RTbox ayrıca, dış tetikleyiciler alabilir ve dış olaylar ile ilgili RT ölçmek için kullanılabilir. VideoSwitcher ve RTbox hem kullanıcılar hem de satın almak için kullanılabilir. Ilgili bilgileri ve birçok gösteri programlarında bulunabilir <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers at JoVE.com

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Geleneksel bilgisayar donanımı yeterli doğrulukta çözünürlük ve ölçü tepki süreleri gri yeterince yüksek görsel uyaranlara üretemez. Biz yüksek çözünürlüklü monokrom ekranlar üretme VideoSwitcher ve geleneksel bilgisayar donanımı yüksek doğruluk ile yanıt süreleri ölçmek için RTbox nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

Etkinleştirilmesi Yüksek Çözünürlük görüntüler ve Konvansiyonel Bilgisayarlara Doğru Tepki Süresi Ölçümleri Grayscale

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

enabling-high-grayscale-resolution-displays-accurate-response-time

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Electrical Engineering

Neuroscience

Unit 1

Transient and Steady-state Response Analysis

SCIENTISTS IN ACTION

9.3K Görüntüleme.  The Ohio State University. Geleneksel bilgisayar donanımı yeterli doğrulukta çözünürlük ve ölçü tepki süreleri gri yeterince yüksek görsel uyaranlara üretemez. Biz yüksek çözünürlüklü monokrom ekranlar üretme VideoSwitcher ve geleneksel bilgisayar donanımı yüksek doğruluk ile yanıt süreleri ölçmek için RTbox nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

Video: Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Nörobilim

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

İnsan orta beyin için yüksek çözünürlüklü Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Yöntemleri

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

Fare Siyatik Sinir Vivo elektrofizyolojik ölçümlerde

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

İnsan Subcortex yüksek çözünürlüklü yapısal Manyetik Rezonans Görüntüleme<I&gt; İn Vivo</I&gt; Ve Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Etkinleştirilmesi Yüksek Çözünürlük görüntüler ve Konvansiyonel Bilgisayarlara Doğru Tepki Süresi Ölçümleri Grayscale

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler