Bu çalışmada açıklanan araştırma WAF için bir Ulusal Bilim Vakfı hibe (DEB-0.805.818) tarafından desteklenen, AWS ve kimlik Bu çalışma aynı zamanda AWS ve ID ve IOS-0.920.720 için AWS, IOS-0.919.855 hibe IOS-0.845.847 tarafından desteklenmiştir. WAF

<html> 1. Vücut büyüklüğü ve kanat boyutu varyasyon üretmek için Yetiştirme ve diyet manipülasyonu Akılcı ve Genel Bakış. Ölçekleme sonuçta nihai organ ve vücut büyüklüğüne varyasyon üreten gelişim düzenleyici süreçleri ilişkileri menteşe ifadesi. Bu süreçler iyi, bu tür D. böceklerin tam metamorfik (yani, holometabolous) çalışma açıklanan organlar gibi grub larva 11,15-17 içinde büyümek olarak farklılaşmamış &#39;hayali diskler melanogaster. Drosophila, larva aşamalarında son organ ve vücut büyüklüğü, büyüme ile düzenlenir; üçüncü larva instar 18 başlangıcında doğru eclosion için en az bir canlı ağırlığı (MVW E) ulaşana kadar larvaları birinci ve ikinci larva instar yoluyla büyümek . Açlık MVW E ulaşma önce yetişkin eclosion önler. Ancak, MVW E hasret larvalar çok küçük bir boyutta da olsa, canlı yetişkin oluşturmak . Bunun nedeni, geliştirme sırasında beslenme azalır sadece sinekler değil, hemen hemen tüm hayvanların 19-21, son vücut ve organ boyutu azaltır . MVW E sonra gıda kullanılabilirliğini işleyerek elde, ancak pupa devresi oluşmadan önce, büyük ölçüde varyasyon diğer kaynaklardan (örneğin, bireysel genetik varyasyon) ağır basar vücut büyüklüğü aşırı fenotipik plastisite ikna etmek mümkündür. <ol><li> Yumurta phenotyped nüfusu 50 çok bölünmüş, toplanan ve standart sinek gıda 10ml içeren flakon yerleştirilir. Yöntemlerinin koloni sürekli oluşur Çünkü, yumurta, üç yaş gruplarına üreten üç gün boyunca her 24 saat toplanır. </li><li> Eski kohort dolaşıp sahne ulaştığında ya da sadece pupa başladı, bir diyet manipülasyon uygulanır. Bu noktada, eski kohort MVW E ötesinde, genç kohort MVW E çok yakındır ve bu iki uç arasında kalan kohort yere. Dolayısıyla, bu noktada gıda kaldırılması, eski kohort çok küçük kalan kohort genç kohort ve orta ölçekli yetişkin yetişkin çok büyük yetişkin üretecek. % 40 sukroz solüsyonu yaklaşık 5ml şişeleri larvaları, kaldırmak için tüm şişeleri eklenir. Larvaların serbest bırakmak için, yiyecek, bir ara hıza ayarlanmış bir çalkalayıcı masaya 15-20 dakika çalkalanır. </li><li> Yüzer larvaları (00) ince bir fırça ile sakaroz çözeltisini, ıslak pamuk fiş içeren flakon yerleştirilir ve pupa izin kaldırıldı. Alternatif olarak, larva gibi metil selüloz 22 gibi sindirilemeyen gıda katkı maddesi yer olabilir . </li></ol> 2. Vücut büyüklüğü tahmini Rasyonel ve Genel Bakış. Önceki çalışmalar, toraks uzunluğu, genel vücut büyüklüğü 22 için ideal proxy daha az olduğunu göstermektedir. Bunun yerine, vücut büyüklüğünün bir ölçüsü olarak pupa boyutunu kullanmak. Maksimum vücut büyüklüğü pupa devresi önce beslenmenin kesilmesi sabittir. Sonuç olarak, pupa boyutu ve yetişkin vücut büyüklüğü 23 arasında sıkı bir ilişki vardır. <ol><li> Pupa ventral yan cam mikroskop slaytlar düzenlenmiş ve diseksiyon mikroskobu bağlı bir dijital kamera kullanarak görüntülü. Her görüntü, esir, benzersiz bir tanımlayıcı kod atanır ve dijital kamera bilgisayara bağlayan bir canlı yayın aracılığıyla bilgisayar ortamına aktarılır. </li><li> Görüntülenmistir pupa o birey için benzersiz bir kod ile etiketlenmiş sinek gıda 1ml içeren bireysel 2 ml epitubes, taşındı ve gaz alışverişine imkan airholes ile delinmiş. </li><li> Pupa boyutu pupa siluet piksel sayısı olarak tahmin edilmektedir. Diğer boyut ölçümlerini de kullanılıyor olabilir. </li></ol> 3. Sürekli (kanat) boyutu tahmini Rasyonel ve Genel Bakış. Görüntü kanat için, bir &#39;kanat kapmak&#39; 24, çeker ve vücudu canlı, anestezi sinek dik kanat tutan kullanın. Iki adet cam arasında sıkıştırılmış, bu kanat iki boyutlu bir nesne olarak yansıması sağlar. <ol><li> Sinekler CO 2 ile hafifçe anestezi ve bir bilgisayara bağlı olan bir dijital kamera ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu kanat kapmak konumda yerleştirilir. </li><li> Kanat, o kişi için benzersiz kodu altında görüntülü ve kaydedilir. </li><li> Kanat boyutu kanat siluet piksel sayısı olarak ya da marjinal sabit simge çerçevesi oluşturulmuş minimum konveks çokgen kullanarak tahmin edilebilir. </li></ol> 4. Ölçekleme ilişki tahmini <ol><li> Veri kohortlarında arasında toplanmış ancak cinsiyete göre ayrılmış ve log-transforme. </li><li> Ölçekleme ilişkiler Tip II (yani, İndirgenmiş Binbaşı Eksen) regresyon (12 inceleme) ve her grup için tahmin edilen parametreler kullanılarak boyutunu verilere uyacak. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: çadır &quot;&gt; diyet manipülasyon vücut boyutları (Şekil 1) ve sürekli boyutları (Şekil 2), geniş bir ürün yelpazesiyle, birbirlerine karşı günlük dönüştürülmüş özellikleri Çizilmesi belirli bir biyolojik grup içinde covariation, kendi modelini ortaya koyan ve ölçeklendirme ilişki oturan izin verir grubu (Şekil 3) tarif ölçeklendirme ilişki parametreleri. çıkarımı nasıl vücut büyüklüğü ile şekil ölçekler gruplarında boyutu ile nasıl şekil covaries karşılaştırılmasına olanak sağlar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig1.jpg" /> Şekil 1. Pupa aşırı diyet manipülasyon yoluyla üretilen boyut dağılımı bireyler MVW E ulaşmak sonra. Gerçek pupa görüntüler, solda ve sağda pupa boyutu ölçümü için bunlara karşılık gelen siluetleri ile gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 1mm. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig2.jpg" /> Şekil 2. Wings bireylerin MVW E ulaşmak sonra aşırı diyet manipülasyon yoluyla üretilen gövde büyüklüğü dağılımı alınmıştır. Gerçek kanat ile sol, sağ gösterilen kanat büyüklüğü ölçümü için bunlara karşılık gelen siluetleri görüntüleri gösterilir. Ölçek çubuğu 1mm. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig3.jpg" /> Şekil 3 cinsiyete göre Drosophila melanogaster Wing-vücut ölçekleme. Larvaları (siyah daireler) ya da iki gün (açık daireler) açlıktan tam beslenen (koyu halkaları), her cinsiyetten kişiler için log-dönüştürülmüş verileri. Tip II regresyon çizgisi, her bir seks için gösterilir. Her yaş grubu arasında, ortalama kanat alanı düşüşler ~ 0.1mm (~% 7) ve ~ 0.2mm (~% 8) gözlenen fenotipleri toplam artan oluşur. Regresyonlar erkeklerde biraz hyperallometric (eğim 1.06) iken kadınlarda bu ölçekleme ilişki için (0.96 eğimi) biraz hypoallometric olduğunu ortaya koymaktadır.

<ol>
	<li>Schmidt-Nielsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Scaling: Why is animal size so important. , (1984).</li><li>Calder, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Size, function and life history. , (1984).</li><li>Huxley, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Problems of relative growth. , (1932).</li><li>Gould, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allometry+and+size+in+ontogeny+and+phylogeny.">Allometry and size in ontogeny and phylogeny.</a> Biol. Rev. 41, 587-640 (1966).</li><li>Alberch, P., Gould, S. J., Oster, G. F., Wake, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+in+ontogeny+and+phylogeny.">Size and shape in ontogeny and phylogeny.</a> Paleobiology. 5, 296-317 (1979).</li><li>Thompson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> On growth and form. , (1917).</li><li>Klingenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochrony+and+allometry:+The+analysis+of+evolutionary+change+in+ontogeny.">Heterochrony and allometry: The analysis of evolutionary change in ontogeny.</a> Biol. Rev. 73, 79-123 (1998).</li><li>Dubois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sur+le+rapport+de+l'enc&#233;phale+avec+la+grandeur+du+corps+chez+les+Mammiferes.">Sur le rapport de l'enc&#233;phale avec la grandeur du corps chez les Mammiferes.</a> Bull. Soc. Anthropol. 8, 337-374 .</li><li>Huxley, J. S., Teissier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology+of+relative+growth.">Terminology of relative growth.</a> Nature. 137, 780-781 (1936).</li><li>Huxley, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constant+differential+growth-ratios+and+their+significance.">Constant differential growth-ratios and their significance.</a> Nature. 114, 895-896 (1924).</li><li>Shingleton, A. W., Frankino, W. A., Flatt, T., Nijhout, H. F., Emlen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape:+The+developmental+regulation+of+static+allometry+in+insects.">Size and shape: The developmental regulation of static allometry in insects.</a> BioEssays. 29, 536-548 (2007).</li><li>Frankino, W. A., Emlen, D., Shingleton, A. W., Garland, T., Rose, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+approaches+to+studying+the+evolution+of+morphological+allometries:+The+shape+of+things+to+come.">Experimental approaches to studying the evolution of morphological allometries: The shape of things to come.</a> Experimental evolution: Concepts, methods, and applications. , (2009).</li><li>Emlen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+selection+on+horn+length-body+size+allometry+in+the+horned+beetle+Onthophagus+acuminatus.">Artificial selection on horn length-body size allometry in the horned beetle Onthophagus acuminatus.</a> Evolution. 50, (1996).</li><li>Emlen, D. J., Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+evolution+of+exaggerated+morphologies+in+insects.">The development and evolution of exaggerated morphologies in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 45, 661-708 (2000).</li><li>Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body-size+regulation:+Combining+genetics+and+physiology.">Body-size regulation: Combining genetics and physiology.</a> Curr. Biol. 15, 825-827 (2005).</li><li>Nijhout, H. F., Davidowitz, G., Roff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+the+mechanism+that+controls+body+size+in+Manduca+sexta.">A quantitative analysis of the mechanism that controls body size in Manduca sexta.</a> J. Biol. 5, 16.11-16.15 (2006).</li><li>Davidowitz, G., Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+basis+of+reaction+norms:+The+interaction+among+growth+rate,+the+duration+of+growth+and+body+size.">The physiological basis of reaction norms: The interaction among growth rate, the duration of growth and body size.</a> Integr. Comp. Biol. 44, 443-449 (2004).</li><li>Stieper, B. C., Kupershtok, M., Driscoll, M. V., Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+discs+regulate+developmental+timing+in+Drosophila+melanogaster.">Imaginal discs regulate developmental timing in Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 321, 18-26 (2008).</li><li>Colombani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nutrient+sensor+mechanism+controls+Drosophila+growth.">A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth.</a> Cell. 114, 739-749 (2003).</li><li>Mirth, C. K., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+assessment+and+growth+control:+How+adult+size+is+determined+in+insects.">Size assessment and growth control: How adult size is determined in insects.</a> BioEssays. 29, 344-355 (2007).</li><li>Thissen, J. P., Ketelslegers, J. M., Underwood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+regulation+of+the+insulin-like+growth+factors.">Nutritional regulation of the insulin-like growth factors.</a> Endocr. Rev. 15, 80-101 (1994).</li><li>Boots, M., Begon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+limitation+and+the+lethal+and+sublethal+effects+of+a+viral+pathogen+in+the+Indian+meal+moth,+Plodia+interpunctella.">Resource limitation and the lethal and sublethal effects of a viral pathogen in the Indian meal moth, Plodia interpunctella.</a> Ecol. Entomol. 19, 319-326 (1994).</li><li>Shingleton, A. W., Mirth, C. K., Bates, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+model+of+static+allometry+in+holometabolous+insects.">Developmental model of static allometry in holometabolous insects.</a> Proc. R. Soc. B. 275, 1875-1885 (2008).</li><li>Stern, D. L., Emlen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+basis+of+allometry+in+insects.">The developmental basis of allometry in insects.</a> Development. 126, 1091-1101 (1999).</li><li>Emlen, D. J., Allen, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+to+phenotype:+Physiological+control+of+trait+size+and+scaling+in+insects.">Genotype to phenotype: Physiological control of trait size and scaling in insects.</a> Integr. Comp. Biol. 43, 617-634 (2003).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Morfolojik ölçeklendirme, evrimsel biyoloji, yaklaşık bir yüzyıl için yoğun bir çalışma konusu olmuştur. Daha yakın zamanda, büyüme ve ölçekleme yönetmelik-ğer olarak geliştirme, fizyoloji ve genetik (örneğin, içinde 12,15,23-25 ​​yorumları görmek) giderek daha önemli hale gelmiştir. Bizim metodolojisi, tüm özellikleri ve vücut boyutları aralığında morfolojik ölçekleme ilişkileri tahmini izin verir. Bu özelliği büyüklüğü vücut büyüklüğü (örneğin, 13,14) ile doğrusal ölçekli olarak önemli olabilir. Ancak, eğer hayvanlar sadece ideal bir laboratuvar koşulları altında yetiştirilen bu bariz olmayabilir olabilir. Bizim protokol Drosophila kanat-gövde ölçekleme ilişkisi tahmini izin açıkça geliştirilmiş olmasına rağmen, bu özelliğe özel değişiklik ile sinek herhangi bir morfolojik özellik için ölçeklendirme ilişkiyi tahmin etmek için kullanılır. Benzer şekilde, diyet manipülasyon muhtemelen diğer tam metamorfik böceklerin özelliği ve vücut boyutları tam üretmek için kullanılan olabilir, bu tür uygulamalar sadece MVW D elde edilir bilerek ve ontogeny bu noktada manipülasyon uygulayarak gerektirir .

experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in drosophila

Vücut parçalarının hayvan morfolojisi 1-7 ölçeklendirme merkezi bir özelliğidir. Türü içinde, morfolojik özellikleri doğru çalışması için organizma için vücut orantılı olması gerekir; daha büyük bireyler genellikle büyük gövde parçaları ve küçük kişiler genelde daha küçük vücut parçaları var, genel vücut şekli, bir yetişkin vücut boyutları aralığında korunur. Doğru oranlarda için gereklilik, türün içindeki bireylerin genellikle göreli özelliği boyutu düşük varyasyon sergilemek anlamına gelir. Buna karşın, göreceli özelliği büyüklüğü türler arasında dramatik bir şekilde değişir ve morfolojik çeşitliliğin olduğu bir temel mekanizmadır. Karşılaştırmalı bir çalışma yüzyıl boyunca bu içi ve arası desen 3,4 kurmuştur. Belki de bu değişimi anlatmak için en yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım, ölçeklendirme allometrik denklemi kullanarak iki morfolojik özelliklerin boyutu arasında bir ilişki hesaplamak için y = bxα, x ve y gibi organ ve vücut boyutu 8 olarak iki özellikleri , boyutu , 9. Bu denklem, her iki boyutu değişir gibi iki özelliği arasındaki grup içi (örneğin, tür, populasyon) ölçekleme ilişkiyi açıklar. Bu denklemde Log-dönüşüm basit bir lineer denklem üretir, log (y) = log (b) + αlog (x) ve aynı türün bireyleri arasında farklı özelliklerin boyut log-log araziler genellikle bir yolunu kesmek doğrusal ölçekleme ortaya log (b) ve α bir yamaç, &#39;allometrik katsayısı 9,10 olarak adlandırılır. Gruplar arasında morfolojik farklılıklar belirli bir özelliği çifti için ölçekleme ilişki yakaladığını veya yamaçlarında farklılıklarla açıklanmıştır. Sonuç olarak, allometrik denklem (b) ve (α) parametreleri varyasyon zarif içinde ve biyolojik gruplar arasında (11,12), organ ve vücut büyüklüğü arasındaki ilişki yakalanan şekil değişimi açıklar. Tüm özelliklerin birbirleri ile veya Bu nedenle vücut büyüklüğü (örneğin, 13,14) doğrusal ölçekli değil, morfolojik ölçekleme ilişkileri özelliği boyutları tam kapsamlı veri alındığında, en bilgilendirici. Burada diyet basit deneysel manipülasyon böceklerin vücut büyüklüğü tam üretmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Bu, büyüklüğü ve biyolojik gruplar arasında ölçekleme ilişki parametreleri sağlam bir karşılaştırma ile şekli covaries nasıl tam olarak bir açıklama sağlayan özelliklerin herhangi bir çift için tam ölçekleme ilişkinin bir tahmin izin verir. Drosophila üzerinde odaklanmak rağmen, metodoloji hemen hemen her tam metamorfik böcek uygulanabilir olmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila at JoVE.com

Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

Morfolojik ölçekleme ilişkileri yakalama ve organizma şeklini tarif. Biz tam metamorfik böceklerin vücut boyutları doğal aralığında morfolojik ölçekleme ilişkileri ölçmek için bir yöntem mevcut. Şekil ve boyut birlikte değişir nasıl doğru bir açıklama izin, dağıtım özelliği boyutta basit bir diyet manipülasyonu kullanarak artırmak.

Morfolojik Ölçekleme İlişkiler tahmin Vücut ölçüleri Deneysel Manipülasyon Drosophila</em

The scaling of body parts is a central feature of animal morphology1-7. Within species, morphological traits need to be correctly proportioned to the body ...

experimental-manipulation-body-size-to-estimate-morphological-scaling

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

13.7K Görüntüleme.  University of Houston. Morfolojik ölçekleme ilişkileri yakalama ve organizma şeklini tarif. Biz tam metamorfik böceklerin vücut boyutları doğal aralığında morfolojik ölçekleme ilişkileri ölçmek için bir yöntem mevcut. Şekil ve boyut birlikte değişir nasıl doğru bir açıklama izin, dağıtım özelliği boyutta basit bir diyet manipülasyonu kullanarak artırmak.

Video: Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Doku Mühendisliği Deneysel Yaklaşımlar

Biyoloji

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

Drosophila toksisite laboratuvarda test etmek için bir omurgasız Model sistemi olarak kullanmak için deneysel protokol

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Lezyon boyutu endometriozis, kapaklı fare modeli noninvaziv izlenmesi

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of assisted reproduction techniques such as oocyte in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and cloning of domestic animals by nuclear transfer from somatic cell. IVM is the method particularly of significance. It is the platform technology for the supply of mature, good quality oocytes for applications such as reduction of the generation interval in commercially important or endangered species, research concerning in vitro human reproduction, and production of transgenic animals for cell therapies. The term oocyte quality includes its competence to complete maturation, be fertilized, thereby resulting in healthy offspring. This means that oocytes of good quality are paramount for successful fertilization including IVF procedures. This poses many difficulties to develop a reliable culture method that would support growth not only of human oocytes but also of other large mammalian species. The first step in IVM is the in vitro culture of oocytes. This work describes two protocols for the 3D culture of porcine oocytes. In the first, 3D model cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in a fibrin-alginate bead interpenetrating network, in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. In the second one, COCs are suspended in a drop of medium and encapsulated with fluorinated ethylene propylene (FEP; a copolymer of hexafluoropropylene and tetrafluoroethylene) powder particles to form microbioreactors defined as Liquid Marbles (LM). Both 3D systems maintain the gaseous in vitro culture environment. They also maintain COCs 3D organization by preventing their flattening and consequent disruption of gap junctions, thereby preserving the functional relationship between the oocyte, and surrounding follicular cells.

Presented here are two protocols for the encapsulation of porcine oocytes in 3D culture conditions. In the first, cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in fibrin-alginate beads. In the second, they are enclosed with fluorinated ethylene propylene powder particles (microbioreactors). Both systems ensure optimal conditions to maintain their 3D organization.

Proteolytically Bozulmuş Aljinat Hidrojeller ve Porcine Oosit Kapsülleme için Hidrofobik Mikrobiyoreaktörler

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the executor for most of the liver functions, primary hepatocytes have limited proliferating capacity. This requires the establishment of ex vivo hepatocyte expansion models for liver physiological and pathological research. Here, we isolated murine hepatocytes by two steps of collagenase perfusion and established a 3D organoid culture as the 'mini-liver' to recapitulate cell-cell interactions and physical functions. The organoids consist of heterogeneous cell populations including progenitors and mature hepatocytes. We introduce the process in detailed to isolate and culture the murine hepatocytes or fetal hepatocyte to form organoids within 2-3 weeks and show how to passage them by mechanically pipetting up and down. In addition, we will also introduce how to digest the organoids into single cells for lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering. The organoids can be used for drug screens, disease modelling, and basic liver research by modeling liver biology and pathobiology.

A long-term ex vitro 3D organoid culture system was established from mouse hepatocytes. These organoids can be passaged and genetically manipulated by lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering.