Bu yayın bir hibe Department of Education tarafından desteklenmiştir (PR Ödülü #P031C160025-17, proje başlığı: 84.031 C) etkin kök inşa nişan (C-BASE) için Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) topluluklarına. Geçerli zooloji teşekkür ederiz ve bize bu protokolü yayımlamak için bir fırsat sağlamak için Jüpiter editörleri yanı sıra önceki kağıtları temsilcisi sonuçları kullanma hakkı sağlamak için Elsevier yayınladı. Ayrıca C-Bankası programı, Dr Brian Vanden Heuvel (C-taban ve Biyoloji bölümü, CSU-Pueblo), CSU-Pueblo biyoloji bölüm, Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (Biyoloji bölümü, Skidmore üniversite) ve Dr. Claire Varian Ramos teşekkür etmek istiyorum (Biyoloji bölümü, Colorado State University-Pueblo) onların destek ve yardım için.

Bir toksin ağız sindirim uygun olduğunda kirli ortamda Drosophila cins içinde tür arka için kullanılan deneysel bir iletişim kuralı aşağıdaki protokoldür; maruz kalma diğer formları Drosophila modeli11,15,16,26kullanarak mümkündür. Daha önce Hirsch ve ark. tarafından açıklanan bu protokol için açıklanan yöntemleri 19 ve Peterson vd. 23 , 24 , 25.
1. Araştırma Laboratuvarı Drosophila hisse senedi olasılığını ayarla
<ol><li>Çevre kontrollü inkübatör (veya küçük oda) Drosophila ev hisse senedi nüfus için İnkübatörler ayarlayarak sabit sıcaklık, ışık: karanlık döngüsü ve nem, test türler tercihleri bağlı olarak ayarlayın. Not: Tercih edilen çevre koşulları çalışma için seçilen türlerin yerel ekoloji bağlı olarak değişir. Örneğin, D. melanogaster Sahra Afrika27 ile yerel ve 25 ° C, 1212: açık: koyu döngüsü ve yaklaşık % 60 nem16,18,19,20 genellikle korunur , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. öte yandan, Kanada ve midwest ABD'de bir soğuk kadar bölge; en boyunca D. montana aralığı genişletir Bu nedenle, D. montana genellikle koşulları sırasında çiftleşme sezonu31benzetimini yapmak için 19-20 ° C ve bazen 24 h ışık rejimi tutulur. Drosophilaçeşitli türlerin coğrafi aralıkları daha ayrıntılı açıklaması için bkz: Drosophila türleşme desenler Web sitesi32.</li>
	<li>
Bir tercih edilen Drosophila türler ve/veya doğuştan çizgi ya da bir hisse senedi Merkezi'nden (bkz. tablo reçetesi) alanından isteği veya toplamak çıldırdı, genetik olarak değişken nüfus üzerine başka bir araştırma laboratuvarı. Not: Aşağıdaki adımlarda araştırma laboratuvarı korumak için Drosophila vahşi, genetik olarak değişken nüfus toplamak için yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yöntemler Markow ve O'Grady33 ve Werner ve Jaenike34 geniş çeşitlilik türlerin bir kerede bir yem kaynağı ile hedef belirli türler yerine toplamak için değiştirilmiş.<ol>
<li>Buzlukta yarım düzine olgun muz gecede donma ve yem tuzakları ayarlamadan önce defrost.</li>
		<li>Birden fazla 1-2 L plastik şişe şişe sinekler yem şişe ve kaçış yakalanması izin vermek için önünde u şeklinde bir yarık keserek hazırlayın. Sinekler kapakları kaçamaz Yani plastik şişe onların şişe kapakları ile kap.</li>
		<li>Böylece şişelerin dibinde yaklaşık bir inç muz içerir fetişlerin muz şişeleri altýna ekleyin. Ripe domates bir dilim şişeye koyun. Böylece Maya Bulamaç emmek muz alır bir Maya Bulamaç (artık Maya bira verme süreci üzerinden) şişenin dibinde muz ekleyin.</li>
		<li>Maya bulamaç ve muz uzak üzerinde yürümek için temiz bir substrat sinekler var ve bu yüzden (içinde dikey dik) ahşap sopa için şişe ekleyin. Bu yöntemlerden nihai ürün Şekil 1 gösterir.</li>
		<li>Ağaçlar şişelerde bir gecede ve her 24 h ağız aspiratı şişe dışında uçar kontrol yem asmak ve şişeleri ISO-erkek satırları oluşturmak için orta ile tek tek kadın yer. Not: Eğer sadece her tür dişilerini açıkça belirlenebilir çok kadın satırlar, ancak, oluşturulabilir. Buna ek olarak, sinekler Drosophila cins içinde farklı ekolojik niş işgal ve bu niş (Werner ve Jaenike34); bağlı olarak farklı beslenme ihtiyaçları olacak Werner ve Jaenike34 diyet önerileri ve yemek tarifleri için bkz.</li>
		<li>Toplanan Drosophila türler tanımlamak için belgili tanımlık yetişkin F1 çoluk çocuk diseksiyon mikroskop altında incelemek (Markow ve O'Grady33 ve Werner ve Jaenike34 çeşitli türler belirleme konusunda yardım için bkz: ).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig1.jpg"> Resim 1 : Tuzaklar ve yem Drosophila alanında vahşi nüfus toplamak için kullanılan resimsel gösterimi. (A) sinek küme Colorado'da bir yerel alan sitede yakalar. (B) daha yakın görünümünü anında küme bu alan sitede yakalar. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="3"><li>ISO-erkek ya da bir çevre kontrollü inkübatöre veya oda sabit sıcaklık, ışık: karanlık döngüsü ve nem ile çok kadın satırlarında sürdürür. Bunu yapmak için ev şişeleri uçan veya şişelerde orta tercih ve ortamda yumurtlamak gravid kadın izin. Şişeleri larva ve pupa varlığı için izleyin. Not: Sinekler Drosophila cins içinde farklı ekolojik niş işgal ve farklı diyet gereksinimleri ve bu nişler33,34bağlı olarak çevre abiyotik Tercihler olacaktır. Çevresel tercihleri ve diyet önerileri (ve daha fazla sinek yetiştirme eğitimi)-ebilmek bulunmak Elgin ve Miller28, Shaffer ve ark. 29, stocker ve Gallant30, Markow ve O'Grady33ve Werner ve Jaenike34. Belgili tanımlık tür-ebilmek var olmak identified kadar yerel çevre koşulları vahşi yakalanan türleri kullanıyorsanız, İnkübatörler benzetimi yapılabilir.</li>
	<li>Hisse senetleri, sık sık taze orta aktarımı, sağlıklı satırları korumak için eski şişeleri, atma ve akarları enfeksiyondan kaçının. Not: Aktarım sıklığını türlerin yaşam döngüsü bağlı olacaktır. Örneğin, Drosophila melanogaster 2 haftada taze ortamına aktarın. Daha fazla bilgi üzerinde laboratuvarda, satırları korumak için Rand ve arkgörmek. 16, Elgin ve Miller28, Shaffer ve ark. Veritabanı36 29, stocker ve Gallant30, Greenspan35ve Fen eğitimi.</li>
</ol>2. arka Drosophila kirlenmiş orta
Not: İlk kez veya yeni bir contaminant(s) ile laboratuvar olarak Drosophila sınama olumlu sonuçlanırsa, öldürücü doz tanımlamak (bkz: Castaneda vd. 37 ve Massie vd. 38 yöntemleri için) ve LD50 (Castaneda ve arkbkz. 37 ve Akins ve ark. 39 yöntemleri için) ilk. Daha sonra istediğiniz fenotipik çıktı için biyolojik ilgili konsantrasyonları tanımlamak için bir doz-yanıt eğrisi çalıştırın; Hirsch ve arkgörmek. 19 ve Zhou ve ark. 40 yöntemleri için.
<ol><li>Kirlenmiş orta kirletici Kimya bağlı olarak istenen concentration(s), hisse senedi çözümleri hazırlayın. Not: Örneğin PbAc hisse senedi çözümler hazırlamak için: geçen madde su ulaşır istenen konsantrasyon ile yapılan orta kadar distile su (dH20) geçen madde ekleyerek Kurşun asetat (PbAc) orta hisse senedi çözümleri hazırlayın. Örneğin, 1000 µM hisse senedi bir çözüm PbAc, hazır 1000 µM ulaşıncaya kadar dH2için 0 PbAc ekleyerek PbAc. Ayrıca, stok çözüm (Örneğin 1000 µM PbAc çözüm) için istenen konsantrasyon seyreltik (500 µM gibi PbAc) ve bu çözümler de hisse senedi korumak.</li>
	<li>Orta, denetim aracı olarak hizmet vermek amacıyla aşağıdaki üreticisinin yönergeleri hazırlamak. Ek orta, aşağıdaki üreticisinin yönergeleri hazırlamak; Ancak, hazırlanan kirletici çözüm dH20 için ek. Not: Örneğin, bir anda Drosophila orta kullanıyorsanız, yaklaşık bir çay kaşığı anlık orta için plastik bir şişe ekleyin. Yaklaşık 5-5,5 mL dH20 orta olarak ekleyin. Bir kaç canlı baker kontrol ortamı hazırlamak için mayası taneleri serpin. Deneysel orta hazırlamak için hisse senedi çözüm ek (500 µM gibi PbAc) dH20.</li>
	<li>
Çoğalma uygun Olgun kadın ve erkek hisse senedi örneğin alınma olasılığını denetimi ve deneysel orta aktarın. Not: Saat sonrası eclosion üreme vade arasında Drosophila türler41farklıdır.<ol>
<li>Nazikçe hisse senedi sinekler şişe aşağı dominant el ile dokunun. Sinekler otomatik olarak şişe altına taşımak emin olun. Diğer el ile şişe dokunarak süre şişe kapağını çıkarın ve denetim veya kontamine orta taze bir şişe şişeyi sinekler ile üstüne yerleştirin. Şişeleri bir arada tutmak ve sinekler otomatik olarak denetim veya kontamine orta taze şişe aktarılır böylece onları hafifçe dokunarak, ters çevirin. Hala şişeyi sinekler ile dokunarak süre, şişeyi kap.</li>
		<li>Her şişe sinekli sayısı standartlaştırmak emin olmak daha fazla şişeleri ile yineleyin. Not: Yetişkinlerin tek transfer yoluyla aktarılan toplam ya da anestezi aşırı kalabalık önlemek için kullanılan şişeleri boyutuna bağlıdır.</li>
		<li>Yetişkin bir standart çevre koşulu (yani bir kuluçka)'nda kuluçkaya ve yetişkinler dostum ve orta 24-96 h için yumurtalarını bırakmak için izin verir.</li>
		<li>24-96 h sonra yetişkin bir morg (mineral yağ ile dolu ve dar huni ile şapkalı bir şişesi) atmak geride bırakarak test etmek için olgun için (daha sonra deneysel konular olacak) yumurta döllenmiş. Tüpleri yumurta geliştirmek izin vermek için kuluçka makinesine koyun.</li>
		<li>Göçebe-biçim larva için şişeleri ortamından çıkan larvalar bakarak izlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. toplamak deneysel konularda çeşitli gelişim aşamalarında
Not: Deneysel konularda kör kodlanmış 15 mL konik tüpler içinde yerleştirilir ve birikimi için test herhangi bir aşamada gelişimsel toplanan olabilir. Kirletici madde birikimi sınama yöntemleri okudu kirletici bağlı olacaktır. Örneğin, PbAc birikimi Inductively-Coupled plazma kütle spektrometresi (ICP-MS)42kullanarak test edilebilir. Buna ek olarak, gelişimsel herhangi bir aşamada fenotipik kirletici etkileri çeşitli için test edilecek deneysel konularda toplanan olabilir. Şekil 2 Drosophila yaşam döngüsü43göstermektedir. Şekil 3 pozlama için deneysel protokol ve koleksiyon için farklı gelişim aşamalarında gösterilmektedir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig2.jpg"> Resim 2 : D. melanogaster (en sık kullanılan Drosophila modeli sistemi) yaşam döngüsünün kavramsal genel bakış. Drosophila yaşam döngüsünün aşamaları vardır: 1) yumurta, 2) ilk biçim larva, 3) ikinci biçim larva, 4) üçüncü INSTAR larva, 5) üçüncü-biçim larva, göçebe 6) white-eye pupa, 7) kırmızı göz pupa, 8) yeni-eclosed yetişkin ve 9) olgun yetişkin. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig3.jpg"> Şekil 3 : Sözlü olarak kontamine orta ebeveyn (F0) ve sonraki nesillere Drosophila teşhir için yöntemler kavramsal genel bakış (F1 ve aynı zamanda). (A) yöntemleri maruz üretimi geliştirme sırasında sözlü maruz kalma. (B) yöntemleri kirletici maddeleri transfer çoluk çocuk (F-1 istenen üretimi) için test etmek için. Bu rakam Peterson ve ark. değiştirildi 24 <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol><li>
Göçebe-üçüncü INSTAR larva toplamak
	<ol>
<li>Larva ortamından ortaya ve kuluçka makinesine ışıkları açın sonra şişenin içinde bir h tarafında yukarı taşımak gibi ışıklar da kuluçka makinesine açtığınızda şişeleri izleme başlatın. İçinde bu h, göçebe-üçüncü INSTAR larva dikkatle bir tahta sopa veya cımbız kullanarak şişe taraftan kaldırmak. Not: "2.3.4" koydu yumurta sayısı larva koleksiyonu için kullanılabilir sayısını bağlıdır.</li>
		<li>Aşırı orta larvaları kaldırmak için dH2O. Pour dH2O kabı dışında küçük bir ölçek larvalar yerleştirin ve larvalar hassas görev silecek yerleştirin. Hassas görev silecek kullanarak, larvaları aşırı dH2O yavaşça çıkarın.</li>
		<li>Çevre kontrollü bir kuluçka deneysel nüfusu korumak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yeni eclosed yetişkin toplamak
	<ol>
<li>Şişeleri için eclosion şişeleri kenarlarında pupa coloration gözlemleyerek izlemek. Not: Pupa geliştirme sırasında koyulaştırır. Gelişimsel zaman, özellikle ön eclosion, test türler üzerinde bağlıdır.</li>
		<li>İlk yetişkin eclose için başladığınızda, terk ve bu yetişkinlerin madeni yağ içeren bir morg atın.</li>
		<li>Ertesi sabah da kuluçka makinesine ışıkları açmak zaman, terk ve gecede veya morningbefore ışıkları sırasında eclosed sahip olabilir herhangi bir yetişkin bilinmeyen yaş (veya bekaret) atın.</li>
		<li>Yaklaşık 4 saat sonra anestezi CO2 topu şişeleri bulunan yeni eclosed yetişkin olarak ortaya çıkan herhangi bir yetişkin. Yetişkin bir diseksiyon mikroskop altında bir CO2 tabak yerleştirin. Yetişkin erkek ve kadın ovipositors ön ayakları üzerinde seks tarak yaşar seks. Not: D. melanogaster çiftleşme önlemek için eclosion içinde 6 h toplanan gerekir, ancak diğer türler artık gelişimsel kez olabilir (ve bu nedenle, bu zaman dilimi içinde toplanmasına gerek yoktur).</li>
		<li>Tahta bir sopa kullanarak CO2 plaka üzerinde ayrı yetişkin. Yavaşça orta eşleşen önceden varolan geçmiş için tahta bir sopa ile seks özel grupları yetişkinlerde aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Olgun yetişkin sonrası eclosion toplamak
	<ol>
<li>Yetişkin orta eşleşen öncesi eclosion maruz yumurta aşamasından bir çevre kontrollü kuluçka istenilen yaş sonrası eclosion üzerinde kalmasını sağlar.</li>
		<li>Degişmeyen tek yetişkin yetişkin kapalı bedenlerini aşırı kirlenmiş orta damat izin vermek için test önce 24 saat denetim orta aktarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. arka deneysel konularda Multigenerational etkileri ve Transgenerational pozlama Test etmek.
<ol><li>Ebeveyn üretimi (aka P0 veya F0 nesiller) arka için yetişkin "2.1" anlatılan adımları izleyerek deneysel orta ve denetlemek üzere hisse senedi nüfus "2.3" ve "3.1" "3.3" için transfer.</li>
	<li>Ne zaman yetişkin çoğalma Olgun (Pitnick ve arkbkz. 41), tek başına, denetim ya da deneysel orta taze bir şişe için erkek (2.3.1 belirtildiği gibi) transferi bir şişe. Tek başına bir şişe kadın erkek şimdi içeren taze şişe aktarın. Yetişkin dostum ve lay yumurta ortamda 24-96 h. dökümü için izin ve yetişkin madeni yağ içeren bir morga atın ve şişeleri yavru geliştirmek izin vermek için yeniden kuluçkaya.</li>
	<li>4.1 4.2 nesiller istenen sayısına bağlı olarak aracılığıyla adımları yineleyin.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Drosophila melanogaster genler ve13,14 D. melanogaster ve insanlar arasında yollar geniş korunması nedeniyle biyolojik süreçlerin bir dizi için güçlü bir model olarak kurulmuştur. Tıp bilimi için güçlü bir model olduğunu aynı nedenlerle Drosophila toksikolojik bitiş noktaları bir dizi antropojenik kirlilik etkisi çalışma için uygun modeli sistem olarak ortaya çıkmıştır. Birkaç laboratuar başarıyla D. melanogaster bir modeli sistem olarak bileşikleri, ağır metaller11,16,18-25,37 de dahil olmak üzere bir dizi çalışma için kullandığınız ,38,39,40,44,45, etanol46, nano tanecikleri26,47, tarım ilaçları48 ve solventler49. Drosophila toksikoloji modeli olarak yararlanmak için son çabalarına rağmen sayısız toksikolojik soruları cevaplamak için bir model sistemi olarak kullanılmasını henüz emekleme aşamasında olduğunu. Ancak, geniş kullanımı tıbbi ilgili bitiş noktaları için bir model olarak, hem de ekolojik50 ve evrimsel çalışmaları17onun kullanım göz önüne alındığında, toksikolojik modeli sistemi olarak potansiyel çok büyük.
Burada, çeşitli türler için çeşitli toksikolojik bitiş noktalarını sınamak için kirli ortamda Drosophila cins içinde yetiştirme yöntemleri mevcut. Maruz kalma diğer formları mümkün olmakla birlikte (Örneğin inhalasyon ve dermal pozlama), bir model olarak Drosophila kullanarak bu iletişim kuralı doğal olarak alınan (olurdu kirleticiler için gerekli olan sözlü tüketimi kirleticilerin odaklanır gibi besin zinciri yoluyla). Bu yöntemler birden çok Drosophila türler ve kirletici madde kullanımı uygundur. Drosophila vahşi, genetik olarak değişken olasılığını da alanında toplanan ve araştırma laboratuvarı içinde saklanır. Tuzaklar ve tür gıda tercihleri bağlı olarak kullanılabilir yem birçok seçenek vardır; alan koleksiyon üzerinde alan kılavuzları için bkz: Markow ve O'Grady33 ve Werner ve Jaenike34. Buna ek olarak, yöntemleri çeşitli kritik gelişim dönemleri gelişimsel pozlama etkisini belirlemek için değiştirilmiş ve uzun vadeli multigenerational geçen madde pozlama test etmek için izin verir.
Bu yöntemlerin kritik adımlar şunlardır: (1) bakımı sinek sinek nüfus aşırı kalabalık, (3) onun kimyasal özelliklerine göre test kirletici sulandrarak ve (4) seçimi koşulları, çevre kontrollü (2) hisselerinde testi geçen madde biyolojik ilgili konsantrasyonları. Stokları İnkübatörler çevre düzenlenir (veya küçük bir oda) bakımı çevre koşullarında daha fazla varyasyon sonuçları yıkmak değil sağlar. Ayrıca, davranış mevsimsel değişimler daha önce51 bulunmuştur ve çeşitli Drosophila türler üzerinde kış52diapause girin. İkinci, larva aşırı kalabalık geliştirme30, yetişkin vücut boyutu30ve uzun ömürlü53için uzun süreli etkileri olabilir. Buna ek olarak, kirletici seyreltme kirletici biyolojik kirletici birikmesine Drosophila için kullanılabilir olmasını sağlamak için gerekli bir adımdır. Örneğin, diğer kimyasal tuzlu su veya etanol içinde çözünmüş gerekebilir, ancak PbAc dH2O23,24,25, feshedilmiştir. Biyolojik ilgili geçen madde konsantrasyonları seçimi sonuçları yönünü etkileyebilir; Örneğin, yüksek dozda19çiftleşme dişilerin demek numarasında önemli düşüşler göstermek, ancak düşük doz PbAc (içinde 20 dakika), Erkek çiftleşme ortalama sayı kadın artırın. Biyolojik ilgili test kirletici konsantrasyonları tanımlamak için okuyucu öldürücü doz ve LD50 bir doz-yanıt eğrisi gerçekleştirmek için uygun dozlarda belirlemek için belirlemek için ön çalışmalar çalıştıran düşünmelisiniz. Bir doz-yanıt eğrisi konsantrasyonları belirli bir noktadaki bir dizi test gerçekleştirerek, okuyucuların daha fazla test için "yararlı" ya da "tehlikeli" bireyler veya nüfus doz tam yerini.
Bu iletişim kuralı belirlemek için bir cadde sağlar: 1) kuruluş fitness ve toksikolojik bitiş noktaları; birden çok biyolojik düzeyi etkileşimi 2) gelişimsel ve acil faktörlerin rolü; 3) ekolojik-önemli bitiş noktaları; 4) tıbbi-önemli bitiş noktaları; 5) birden çok stres sonuçlar üretmek için etkileşim; ve 6) nesiller aşan uzun süreli pozlama etkisini. Bu iletişim kuralı etkinliğini göstermek için kanıt geliştirme maruz kalan bireylerin Pb (Tablo 1)23,24birikir gösteren sağlandı. Buna ek olarak, bu protokolü pozlama ekolojik önemli bitiş noktaları üzerinde etkilerini test etmek için kullanılabilir temsilcisi sonuçları göster (Örn., gelişimsel Pb pozlama dostum seçim24üzerinde etkisi). Buna ek olarak, diğer birçok biyolojik organizasyon düzeyini kirletici etkileri test ettik (fizyolojik18,21, dahil olmak üzere genetik20,22 ve fenotipik düzeyleri19 , 23 , 24 , 25), tıbbi olarak önemli bitiş noktaları18,20,21,22,23ve uzun vadeli multigenerational etkileri23,24 ,25,54. Buna ek olarak, ilk veri gelişimsel Pb pozlama verimlilik D. melanogaster54yılında transgenerational epigenetik etkisi indükler gösterir. Bu protokol önemli bir sınırlama Drosophila ile bu Protokolü'nün kullanılmasına emekleme döneminde olduğunu. Bu nedenle, sınırlı yayın18,19,20,21,22,23,24,25 vardır Adres için rolü geliştirme ve acil faktörler, ek ekolojik önemli bitiş noktaları, birden fazla stres ve maruz kalma evrimsel etkileri gibi ek toksikolojik soruları cevaplamak için protokol potansiyelini.
Bu iletişim kuralını kullanan, okuyucuların biyolojik olarak uygun yöntemlerle doğal olarak yutulur kirletici test edebilirsiniz. Sürekli sıvı besleme, Soares ve arktarafından geliştirilmiştir. 55 pestisit pozlama için özellikle oral alımından için alternatif bir yaklaşımdır. Ancak, sürekli sıvı besleme bireyler maruz öncesi eclosion nerede olabilir sıvı kirletici yetişkin yenmesi için uygun ve kirletici maddeleri için geçerli değildir. Bu poz için geliştirmede kritik dönemler için potansiyeli göz önüne alındığında özellikle önemlidir. Önceki çalışmalarda kritik bir dönem Türkçe pozlama23göstermiştir. Bu nedenle, Drosophila kirletici potansiyel etkin eleme önlemek için geliştirme Drosophila tarafından kritik dönemleri tespit edilebilecek kadar test önce maruz.
Özetle, biz Drosophila kirleticiler için sözlü olarak ortaya çıkarmak için bir protokol sağladı. Bu iletişim kuralı ve model sistem kullanarak, toksikolog etik ve non-invaziv yaklaşımlar aynı anda kirletici madde8etkisini anlamak için daha bütünsel bir yaklaşım müşterilerin hayvan test için geçiş yapabilirsiniz.

Her yıl yaklaşık 1000 yeni kimyasallar kimya endüstrisi1,2tarafından tanıtıldı; Ancak, sadece küçük bir yüzdesi bu kimyasalların çevreye etkilerinin dağıtım2,3önce test edilir. Büyük ölçekli felaketler nadir olmakla birlikte, kirleticiler, büyük bir çeşitlilik sublethal ve kronik maruz insanlar ve yaban hayatı4,5yaygın. Ölümcül, tek kimyasal pozlama, akut maruz kalma ve pozlama, fizyolojik etkileri kirleticiler hayatta kalma6, etkisini ölçme aracı olarak test etmek için ecotoxicology ve Çevresel Toksikoloji tarihsel odak oldu 7 , 8 , 9 , 10. hayvan testi için etik ve non-invaziv yaklaşımlar doğru bir kayma olsa da, geçerli yaklaşımlar rolden dolayı bu geliştirme, acil özellikleri ve dış faktörler sınırlama var (nüfus düzeyi gibi ve ekosistem düzeyi etkileşimleri) ekolojik önemli bitiş noktaları8arabuluculuk oynamak. Bu nedenle, yaban hayatı ve/veya laboratuarda omurgalılar ödün vermeden daha bütünsel bir yaklaşım dahil yöntemleri için bir ihtiyaç vardır.
Omurgasız modeli, Drosophila melanogastergibi toksisite test daha bütünsel bir yaklaşım ihtiyacını gidermek için cazip bir alternatif sistemlerdir. D. melanogaster, orijinal bir omurgasız modeli sistemi hakkında bir asır önce genetik araştırma insan ile ilgili olarak gelişmiş11. D. melanogaster şimdi göze çarpacak şekilde kullanılır omurgalı modeli alternatif bir yöntem olarak çeşitli nedenlerle: 1) koruma genler ve yolları arasında D. melanogaster ve insanlar; 2) kısa oluşturma süresi omurgalı modellerle karşılaştırıldığında; 3) ucuz maliyet, bakım; 4) örneklerin boyutu büyük oluşturmak için kolay; ve 5) fenotipik ve ekolojik-ilgili bitiş noktaları11,12,13,14,15,16,17 test etmek için kullanılabilir bolluk .
Birkaç laboratuar11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 artık kullanıyor D. melanogaster omurgalı modeli alternatif bir yöntem olarak toksisite testleri için kirliliği insanlar üzerinde etkileri anlamak için. Drosophila yerel yabani türlerin kullanılan, de ve yaban hayatı (insanlar) ekolojik cevap vermek için toksisite model olarak-, davranışsal-ve kuruluşun birden çok biyolojik düzeyde örümceklerle ilgili sorular. Türler Drosophila cins içinde bir model olarak kullanarak, çeşitli ölçülebilir bitiş noktaları vardır olası11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. İn addition, Drosophila modeli kullanarak, toksikolog yapabilirsiniz: 1) etik etkileri kuruluşun; birden çok biyolojik düzeyde bağlantı 2) acil faktörler ve geliştirme rolü dahil; 3) çalışma ekolojik önemli bitiş noktaları (yanı sıra tıbbi olarak önemli bitiş noktası); 4) aynı anda birden fazla stres test; 5) ve test uzun vadeli multigenerational (Örneğin evrimsel ve transgenerational) stresler etkileri. Bu nedenle, Drosophila modeli sistemi olarak kullanmak yaklaşımlar mekanik yaklaşımlar doğuştan D. melanogaster laboratuar suşları ile eğitim için sınırlı değildir, çok sayıda sağlar.
Bu yazıda, biz yetiştirme ve çeşitli toksikolojik soruları cevaplamak için Drosophila toplamak için yöntemler mevcut. Daha ayrıntılı olarak, 1 için metodoloji tarif) ile bir veya daha fazla kirletici; bağcıklı orta Drosophila yetiştirme 2) toplama Drosophila geliştirme (üçüncü-biçim larva, pupa örnekleri, yeni eclosed yetişkin ve olgun yetişkin dolaşıpÖrneğin ); ve 3) test Kuşaklararası ve transgenerational iletim yanı sıra uzun vadeli yaydıkları maruz kalma evrimsel etkileri kirli ortamda Drosophila yetiştirme. Bu iletişim kuralı, önceki yazarlar18,19,20,21,22,23,24kullanarak,25 bildirdin farklı, genetik, fizyolojik ve davranışsal etkileri gelişimsel kurşun (Pb2 +) maruz kalma. Bu protokolü nasıl kirleticiler için insanlar ve yaban hayatı hiç giderek kirli ortamda risk faktörleri vardır anlamak için gerekli daha bütünsel bir toksikolojik yaklaşımı kullanmaya toksikolog sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>173204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td>Used to store flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>49-102</td>
			<td>Used to store flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard trays, trays only, narrow</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>32-124</td>
			<td>Used to organize populations of flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard trays, dividers only, narrow</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>32-126</td>
			<td>Used to organize populations of flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>03-312D</td>
			<td>Useful for storage of contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>03-409-17C</td>
			<td>Useful for storage of contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-287-150</td>
			<td>Used to prepare medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>13-683-708</td>
			<td>Used to prepare medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm)</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td>Used to anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystuff foot valve</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-121</td>
			<td>Used to anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, green (1 continguous foot/unit)</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-124G</td>
			<td>Used to anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-130</td>
			<td>Used to make a morgue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Used to make a morgue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BGSET5 Glass Beaker Set Of 5</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inbred or wildtype line of Drosophila</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University</td>
			<td></td>
			<td>https://bdsc.indiana.edu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild popultions of Drosophila</td>
			<td>UC San Diego Drosophila Stock Center</td>
			<td></td>
			<td>https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental protocol for using drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory

Onlar nadiren toksikolojik çalışmalarda kabul edilir rağmen acil özellikleri ve dış faktörler (nüfus ve ekosistem düzeyi etkileşimleri, özellikle) ekolojik önemli bitiş noktaları, arabuluculuk içinde önemli rol oynarlar. D. melanogaster birkaç isim toxicants, davranış, nörolojik ve genetik etkileri için toksikoloji modeli olarak ortaya çıkıyor. Daha da önemlisi, Drosophila cins içinde tür acil özellikleri dahil ve toksikoloji araştırma ekolojik ilgili soruları cevaplamak bir bütünleştirici çerçeve yaklaşım için bir model sistem olarak yararlı olabilir. Bu kağıt amacı fenotipik çıkışlarını ve ekolojik ilgili sorular bir dizi için bir model sistem olarak kullanılacak kirleticiler için Drosophila cins içinde tür maruz kalmaları için bir protokol sağlamaktır. Daha ayrıntılı olarak, bu protokolü 1 olarak kullanılabilir) organizasyon çok biyolojik düzeyde bağlantı ve toxicants her iki birey ve nüfus düzeyi fitness üzerinde; etkisini anlamak 2) toxicants etkisini gelişimsel pozlama farklı aşamalarında test; 3) test sonuçları kirleticilerin multigenerational ve evrimsel; ve 4) aynı anda birden fazla kirletici ve stres test.

Sözlü olarak Drosophila contaminant(s) boyunca geliştirme için teşhir ederek çeşitli toksikolojik sorular Drosophila biyolojik organizasyonun farklı düzeylerde açarak test edilebilir. Bu bölümde daha önce yayımlanmış belgeleri23,24saat içinde bu iletişim kuralını kullanan elde temsilcisi sonuçları sunar. Özellikle, bu iletişim kuralı daha önce birikimi, ortadan kaldırılması ve kurşun (Pb) maruz kalma ve çoluk çocuk23ilk nesil boyunca aynı nesil içinde tutma değerlendirmek için kullanılan; ve birikimi dostum seçim24dolaylı çalışma.
Tablo 1 ve Şekil 4 birikimi ve Pb ortadan kaldırılması F0 ve F1 nesiller belirlemek için bu iletişim kuralını kullanan elde temsilcisi sonuçları göster.
Tablo 1 gösterir temsilcisi sonuçları nesil içinde maruz kaldığında Pb birikimi göstergesidir (çeşitli dozda: 0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 ve 500 µM PbAc) (üçüncü-biçim larva, göçebe birden çok gelişim aşamalarında test örneklerinde Pupa örnekleri, yeni eclosed yetişkin ve olgun kadın ve erkek) Peterson ve diğerleriiçin. 23 -20 ° C'de dondurulmuş, nitrik asit ve hidrojen peroksit ile tedavi ve ICP-MS23,42kullanarak Türkçe için test çeşitli gelişim aşamalarında, örnekleri toplanmıştır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Doz (µM PbAc)</td>
			<td style="text-align: center;">Larva</td>
			<td style="text-align: center;">Pupa durumlarda</td>
			<td style="text-align: center;">Yeni Eclosed yetişkin</td>
			<td style="text-align: center;">Yetişkin kadın Olgun</td>
			<td style="text-align: center;">Yetişkin erkekler olgun</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td style="text-align: center;">0,009 ± 0.001</td>
			<td style="text-align: center;">0,099 ± 0,02</td>
			<td style="text-align: center;">0,04 ± 0,005</td>
			<td style="text-align: center;">0,069 ± 0.031</td>
			<td style="text-align: center;">0.0015 ± 0,003</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td style="text-align: center;">0,42 ± 0,025</td>
			<td style="text-align: center;">0,46 ± 0.03</td>
			<td style="text-align: center;">0,12 ± 0,009</td>
			<td style="text-align: center;">0,12 ± 0.012</td>
			<td style="text-align: center;">0,056 ± 0.008</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td style="text-align: center;">7.5 ± 0.67</td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td style="text-align: center;">5.2 ± 0.71</td>
			<td style="text-align: center;">2,77 ± 0,30</td>
			<td style="text-align: center;">1.11 ± 0,14</td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
		</tr>
<tr>
<td>75</td>
			<td style="text-align: center;">14 ± 1.06</td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td style="text-align: center;">12 ± 0,95</td>
			<td style="text-align: center;">4.7 ± 0,38</td>
			<td style="text-align: center;">3,36 ± 0,58</td>
			<td style="text-align: center;">1.20 ± 0.63</td>
			<td style="text-align: center;">1.24 ± 0,46</td>
		</tr>
<tr>
<td>250</td>
			<td style="text-align: center;">89 ± 8,49</td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;"></td>
			<td style="text-align: center;">25.06 ± 4,72</td>
			<td style="text-align: center;">5,46 ± 0,75</td>
		</tr>
<tr>
<td>500</td>
			<td style="text-align: center;">271 ± 41.01</td>
			<td style="text-align: center;">334.30 ± 39.43</td>
			<td style="text-align: center;">8.44 ± 0,84</td>
			<td style="text-align: center;">46.50 ± 14.72</td>
			<td style="text-align: center;">14.43 ± 1.83</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: test Türkçe yükler (ng/bireysel) demek D. melanogaster Türkçe sözlü maruz sahne sınamak için yumurta aşamasından sonra geliştirme sırasında. Gösterilen demek anlamına gelir (ng/sinek) ± standart hatası (n 8 larva, n = 3 kontrol yetiştirilen yetişkin, n = 3 Türkçe yetiştirilen yetişkin =). Vahşi türü D. melanogaster denetimde yetiştirilen edildi veya orta Kurşunlu (0, 10, 40, 50, 75, 100, 250 ya da 500 µM PbAc) çeşitli gelişim aşamalarında için yumurta sahneden. Örnekleri toplanmış ve bu tablo Peterson ve arkdeğiştirildi ICP-Bayan42 kullanarak Türkçe biriktirme test. 23
Şekil 4, ebeveyn üretimi (F0) Türkçe için kontrol ortamı, şeklindeki yumurta aşamaları yetişkinliğe, üzerinden maruz kalmış ve çoluk çocuk (F1) ilk nesil yetişkinlik24kadar kontrol aracı olarak yetiştirilen. PB birikimi ve eleme algılamak için yöntemleri Peterson ve arkbenzerdi. 23. bu deney sonuçlarından belirtmek ebeveyn pozlama yetişkin yavru24ilk nesil yayın yapıyor. Bu nedenle, bu iletişim kuralını kullanan, adaptif yanıt-e doğru farklı evrimsel ölçekler, hem de F0 pozlama transgenerational etkilerini test etmek mümkündür. Benzer sonuç Peterson ve arkiçinde bulunamadı. 23
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig4.jpg"> Şekil 4: PB birikimi D. melanogaster (A) anne (F0) ve (B) harfi çoluk çocuk (F1). (A) ve (B) çubuklarında görüntülemek ortalama (ng/Yetişkin) ±SEM. (A) barlarda yukarıda gösterilen örnek boyutları ve (B). p = < 0,001. (A) F0 yetişkin sözlü olarak 250 µM maruz kaldılar ICP-Bayan42(B) kullanarak Türkçe birikimi için test edilecek (sonra 24 saat depuration) yaş 5 d sonrası eclosion ve toplanan yaş 6 gün sonrası eclosion yumurta aşamasından bu protokolü kullanarak PbAc F0 yetişkin denetimi orta tedavisinde içinde şeklindeki. Yıkamaya F1 yavru yumurta aşamasından denetim orta yetişkinlik (Bu iletişim kuralını kullanan) olarak yetiştirilen ve ICP-MS kullanarak Türkçe birikimi için test edildi. İçinde (B): "CF + CM"= F1 yetişkin anne ile kontrol ortamı, "CF + PbM" yetiştirilen Kurşunlu orta, "PbF + CM" yetiştirilen babaları olan F1 yetişkin = ile Kurşunlu orta, "PbF + PbM" yetiştirilen anneler F1 yetişkin = F1 = Yetişkin anne ile Kurşunlu ortamda yetiştirilen. Bu rakam Peterson ve ark. değiştirildi 24 <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
Sonuçları Tablo 1 ve Şekil 4 sunulan Drosophila kolayca Türkçe farklı dozlarda, gelişim dönemleri ve evrimsel ölçekler Bu iletişim kuralını kullanan biriken olduğunu gösterir. Bu nedenle, bu protokolün D. melanogaster sözlü bir kirletici için açığa etkinliği gösterir.
Şekil 5' te, Peterson ve ark. tarafından kullanılan burada açıklanan protokol dostum tercih gelişimsel Pb pozlama etkilerini test etmek için, 24 . Deneysel konular yumurta sahne alanı'ndan yetişkinliğe denetim üzerinde yetiştirilen edildi veya orta yumurta sahne alanı'ndan yetişkinliğe Kurşunlu ve dostum tercih için depuration 24 saat sonra test. Peterson ve ark. 24 Türkçe günese maruz kalan kadın tercihen seçeneği, bir denetim veya Pb maruz erkek verildiğinde Pb maruz erkek ile evlendirilen buldum. Bu sonuçlar fenotipik çıktıyı inceleyin Protokolü uygulanması temsilcisi bir örnektir.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig5.jpg"> Şekil 5: Dostum tercih olarak kadın ve erkek için 250 µM maruz PbAc yumurtadan sahne yetişkinliğe. Barlarda(a)(B) ve (Cortalama yüzde (%) çiftleşme başarısında (60 dakika) ± SEM göster) *** p = < 0,001. * p = < 0,05. (A), (B) ve (C) deneysel bireylerde denetimine maruz bırakıldı veya orta Kurşunlu (250 µM PbAc) üzerinden yetişkinlik Olgun yumurta aşamaları ve dostum seçim farklılıkları için test. (A) her iki denetim veya Pb yetiştirilen erkekler (Yani iki seçmeli test) için kadın tercih. Örneklerin boyutu vardı: N = 126 denetim yetiştirilen kadın ve 137 Pb yetiştirilen kadın. (B) denetim ve Pb yetiştirilen kadın (Yani iki seçmeli test) için erkek tercih. Örnekleri boyutları vardı: N 59 denetim yetiştirilen erkekler ve N = 64 Türkçe yetiştirilen erkekler =. (C) bir tercih olarak ve tek başına ya da maruz kalma (yani hayır seçmeli testler) bir ortak ile eşleştirildiğinde erkeklerde dostum. İçinde (C): "CF + CM" = bir denetim yetiştirilen erkek eşleştirilmiş olan bir denetim yetiştirilen erkek (N = 85 çiftleri), "CF + PbM" bir denetim yetiştirilen erkek bir Pb yetiştirilen erkek ile eşleştirilmiş = (N = 79 çiftleri), "PbF + CM" bir erkek Türkçe yetiştirilen bir denetim yetiştirilen erkek ile eşleştirilmiş = (N = 91 çiftleri), "PbF + PbM"= 1 Pb yetiştirilen kadın + Pb yetiştirilen bir erkek (N = 98 çiftleri). Bu rakam Peterson ve ark. değiştirildi 24. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory at JoVE.com

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Bu yazıda, fenotipik olarak çıkışları farklı gelişim aşamalarında bir dizi pozlama etkisini Eğitim amacı ile kirleticiler için Drosophila cins içinde tür teşhir için ve daha fazla bir nesil için detaylı bir protokol sağlar.

Drosophila toksisite laboratuvarda test etmek için bir omurgasız Model sistemi olarak kullanmak için deneysel protokol

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

experimental-protocol-for-using-drosophila-as-an-invertebrate-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

12.6K Görüntüleme.  Colorado State University-Pueblo. Bu yazıda, fenotipik olarak çıkışları farklı gelişim aşamalarında bir dizi pozlama etkisini Eğitim amacı ile kirleticiler için Drosophila cins içinde tür teşhir için ve daha fazla bir nesil için detaylı bir protokol sağlar.

Video: Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Yapay Diyet Deney kullanarak Yaprak bitleri Nikotin Tolerans Testi

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Biyoloji

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Hazırlanması Drosophila</emAsma Bırak Protokolü kullanarak Canlı Görüntüleme> Embriyolar

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Gen kullanmak için bir protokol translasyonel araştırma için uygun hayvan modeli belirlemek için zenginleştirme çözümlemesi ayarla

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Su Macroinvertebrates kullanma gruba özel rDNA astar genetik Gut içerik analizleri için laboratuvar iletişim kuralı

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

Laboratuvar konut, turkuaz Killifish (Nothobranchius furzeri) için bir iletişim kuralı

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Sivrisinekler için roman böcek kimyaları toksisite testleri için iletişim kuralları

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic exposure conditions. This puts specific demands on the cell culture models. Many cell types are negatively affected by exposure to air (e.g., drying out) and only remain viable for a few days. This limits the exposure conditions that can be used in these models: usually relatively high concentrations are applied as a cloud (i.e., droplets containing particles, which settle down rapidly) within a short period of time. Such experimental conditions do not reflect realistic long-term exposure to low concentrations of particles. To overcome these limitations the use of a human bronchial epithelial cell line, Calu-3 was investigated. These cells can be cultured at ALI conditions for several weeks while retaining a healthy morphology and a stable monolayer with tight junctions. In addition, this bronchial model is suitable for testing the effects of repeated exposures to low, realistic concentrations of airborne particles using an ALI exposure system. This system uses a continuous airflow in contrast to other ALI exposure systems that use a single nebulization producing a cloud. Therefore, the continuous flow system is suitable for repeated and prolonged exposure to airborne particles while continuously monitoring the particle characteristics, exposure concentration, and delivered dose. Taken together, this bronchial model, in combination with the continuous flow exposure system, is able to mimic realistic, repeated inhalation exposure conditions that can be used for toxicity testing.

Described is the cell culture and exposure method of an in vitro bronchial model for realistic, repeated inhalation exposure to particles for toxicity testing.

Toksisite Testi için Havadaki Parçacıklara Gerçekçi, Tekrarlanan Soluma Maruziyeti için Hava Sıvısı Arayüzü Bronşiyal Epitel Modeli

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...