In vitro ve in vivo Biyoparlaklık Reporter Gen Görüntüleme İnsan Embriyonik Kök Hücreleri

Giderek artan bir ilgi ile kök hücre tedavileri, moleküler görüntüleme teknikleri transplantasyonu sonrası izleme kök hücre davranışı için idealdir. Lusiferaz muhabiri genler hücre sağkalım, konumu ve in vivo çoğalması non-invaziv, tekrarlayan değerlendirme sağladı. Bu video izlemek için yaşayan bir fare hESC çoğalması gösterecektir.

Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) keşif dramatik rejeneratif tıp ilgilenen tıp bilim adamları, mevcut araçları arttı. Ancak, canlı organizmaların içine hESC ayırt hESC ve hücrelerin doğrudan enjeksiyon şimdiye kadar önemli hücre ölümü, teratom oluşumu ve konağın bağışıklık ret engel olmuştur. Naklinden sonra in vivo hESC davranışı anlamak roman görüntüleme teknikleri boyuna hESC lokalizasyonu, proliferasyon ve canlılığı izlemek için gereklidir. Moleküler görüntüleme araştırmacılar, gün boyunca in vivo hücre çoğalması, haftalar ve hatta aylar izlemek için yüksek verimli, ucuz ve duyarlı bir araç vermiştir. Bu gelişme, uzay-zamansal hESC engraftman, yayılması ve yaşayan kişilerde teratom oluşumu kinetiği anlayışı önemli ölçüde artmıştır.

Moleküler görüntüleme alanında önemli bir ilerleme noninvaziv raportör gen deneyleri, in vivo ve çok amaçlı görüntüleme platformlar moleküler ve hücre biyolojisi uzantısı olmuştur. Bu muhabir genler, konak hücre s transkripsiyonel makine yararlanmak mühendislik rehberleri ve arttırıcılar kontrolü altında, vektör ve vektörel olmayan yöntemleri kullanarak çeşitli hücre içine tanıtıldı. Muhabiri genler hücre kullanılan organizatörü türüne göre, biyolojik veya hücresel belirli şartlar altında ya yapısal ya da sadece transkripsiyonu olabilir. Biyoaktif proteinlerin içine muhabiri genlerin transkripsiyon ve tercümesi sonra D-luciferase gibi sinyal üreten problar kullanılarak hassas, noninvaziv enstrümantasyon (örneğin, CCD kamera) ile tespit edilir.

Floresan görüntüleme için gerekli olan kök hücrelerin in vivo olarak izlemek için eksitatör ışık için ihtiyaç önlemek için, biyoparlaklık muhabiri gen görüntüleme sistemleri, ışık emisyon ikna etmek için sadece bir Eksojen olarak uygulanan prob gerektirir. Firefly lusiferaz, ateşböceği Photinus pyralis türetilen, optik olarak aktif metaboliti, oxyluciferin D-luciferase katalize bir enzim kodlar. Optik faaliyet, daha sonra harici bir CCD kamera ile takip edilebilir. Stabil muhabir taşıyan hücreler kendi kromozomal DNA'da inşa transduced muhabiri hESC hayatta kalma ve in vivo çoğalması boyuna izlenmesi için izin kızı hücrelerinin DNA inşa geçecek. Ayrıca, muhabir gen ürünü ifade sinyal üretimi için gerekli olduğundan, tek uygun anne-baba ve kızı hücreleri biyoparlaklık sinyal yaratacak, apoptotik ya da ölü hücrelerden olmaz.

Bu video, özel malzemeler ve biyoparlaklık görüntüleme izleme kök hücre çoğalması ve teratom oluşumu için gerekli yöntemler ele alınacaktır.

1. Double Fusion Reporter Gen İnşaatı
   1. Insan embriyonik kök hücreleri biyoparlaklık görüntüleme gerçekleştirmek için, ilk stably ateşböceği lusiferaz Ubiquitin veya EF1a gibi bir kurucu organizatörü tarafından tahrik gibi bir lusiferaz muhabiri gen ifade hücreleri elde etmek için gerekir.
   2. Bu protokolün odak muhabiri gen uygulamaları, ayrıntılı yordamlar burada verilmez. Ancak, bizim laboratuvar genel stratejisi ateşböceği lusiferaz (fluc) ve pCDNA 3.1 içinde bir boşluk + ayrılmış gelişmiş yeşil flüoresan protein (egfp) içeren bir çift füzyon inşa vektör kullanmaktır.
   3. Kısaca, çift füzyon geninin ilk pCDNA 3.1 sitomegalovirüs organizatörü (+) akış aşağısında bulunan, bu yüzden 3.3 kbç parçası bir öz-inaktive (SIN çoklu klonlama siteye bağlandı NdeI ve Noti sindirim ve künt uç kullanılarak eksize edildi Ubiquitin promotör kontrolü altında) lentiviral vektör.
      
      
2. Lentiviral İletimi
   1. hESC 10 enfeksiyon bir çokluk (İçişleri Bakanlığı) (106 hücreleri ile inkübe yaklaşık 107 viral titresi) 3-5 gün geçtikten sonra transduced olabilir.
   2. Çözülmüş viral stok taze hESC medya doğrudan eklenebilir.
   3. Medya 12 ve 24 saat sonra yenileyin.
   4. 48 saat sonra, transdüksiyon verimliliği niteliksel floresan mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. Daha sonra, FACS enfekte hücreleri izole etmek için kullanılabilir.
      
      
3. Kültürleme hESC ve Set-up Görüntüleme için giriş
   1. Kültür lusiferaz olumlu hESC besleyici özgür koşullar. Biz genellikle standart WiCell protokolü takip ve klimalı ortam veya ticari ya Matrigel azalır büyüme faktörü kaplı 6-kuyucuğu, besleyici ücretsiz medya kullanın.
   2. Lusiferaz pozitif hücrelerin saptamak için, muhabir prob D-luciferase şimdiden hazırlıklı olması gerekir. 1-1.5 mL hazırlıklarında son bir 45 mg / ml konsantrasyonda bu kısım luciferase yapmak için. -20 ° C'de alikotları depolama zaman kağıt havlu ile kaplayarak kullanmak ve ışığa maruz kalmasını önlemek.
   3. Lusiferaz pozitif hücrelerin görselleştirmek için, biz IVIS 50 ve IVIS 200 Görüntüleme Sistemleri (Xenogen Corporation, Alameda, CA) kullanın. Bu ikinci sistem, küçük hayvanlar geçici anestezi için entegre bir isoflourane cihaz ve indüksiyon odası içerir.
      
      
4. HESC in vitro biyoparlaklık görüntüleme
   1. In vitro biyoparlaklık görüntüleme için, steril koşullarda muhafaza etmek önemlidir. Bu nedenle, görüntüleme sistemi, tercihen bir hücre kültürü odada, steril olmalıdır.
   2. Görüntüleme önce, hücre medyayı çıkartın ve hücreleri kapsayacak şekilde yeterli PBS ekleyin. Örneğin, her bir kuyunun hESC kültürleri içeren 6-plaka 1ml PBS ekleyin.
   3. D-luciferase PBS oranı 1:100 olmalıdır, bu nedenle 6 plaka her iyi çözülmüş D-luciferase 10 mcL ekleyin.
   4. Bir dakika bekleyin, sonra 1 saniye pozlama süresi kullanarak bir görüntü alır. Sinyal zayıfsa, pozlama aralığı artırmak ve tekrar deneyin.
   5. Bioluminescent sinyali hücre sayısı yansıtır, farklı hücre sayıları ile sinyal korele olduğu kantitatif testleri yapılabilir.
      
      
5. In vivo görüntüleme için fare ve hücreleri enjekte hazırlanması
   1. Muhabir gen görüntüleme, günler, haftalar, ve hatta aylar boyunca transplantasyonu sonrası izleme hücreler için yüksek verimli, ucuz ve duyarlı bir yöntem sağlar. Nakledilen kök hücreler sık ​​teratom formu konağın bağışıklık sistemi tarafından reddedilir, ya da sadece ölmek bu yana bu özellikle önemlidir.
   2. In vivo görüntüleme teratom oluşumu için basit yöntem, SCID farelere sırtında ateşböceği lusiferaz muhabiri gen ifade ve IVIS sistemi ile bioluminescent görüntüler elde hESC enjekte etmek.
   3. Hücre nakli için hazır olduğunuzda, hücreler gevşetmek için birkaç kez yıkayın ve büyüme faktörü azaltılmış matrigel ve DMEM 1:1 karışımı askıya dispase veya kollajenaz kullanın. Genelde ilk soğutulmuş DMEM hücrelerin karışımı ve sonra matrigel ekleyin. Her subkutan enjeksiyon site için, biz matrigel / DMEM karışımı 50-100 ul hacmi askıya 200.000 hücreler enjekte edilir. Hücre sayısı Kullandığınız uygulamaya bağlı olarak ayarlanabilir. Enjeksiyondan önce buz üzerinde her şeyi tutmak için unutmayın.
   4. Hücrelerin hazır edildikten sonra, açık izofluran akışı ile indüksiyon kutusuna koyarak fare uyutmak. 1-5 dakika sonra, fare uyuyor ve sürekli izofluran ile ameliyat masasına yerleştirilebilir.
   5. Kürk doğal otomatik fluoresces ve bioluminescent görüntü gizleyebilir, çünkü biz farenin arka tarafında saç kaldırmak gerekir. Bunu yapmanın en kolay yolu, bir elektrikli tıraş makinesi kullanmak için, ama aynı zamanda saç kaldırılması jelleri kullanabilirsiniz. Sterilize etmek için alkol ile silin.Daha sonra deriyi
   6. Sonra, bir şırınga hücre süspansiyonu çizin. Hücrelerle birlikte tıkamaz yılından bu yana 23 - 27 gauge iğne en iyi şekilde çalışır. Iğne çok büyükse (23 gauge) iğne yolu hücreleri geri sızıntı olabilir büyük bir delik bırakabilir.
   7. Hücreler farenin arkasına deri altına enjekte edilir. Cildi oldukça gevşek olduğundan, çimdik, başparmak ve işaret parmağı kullanmak ve enjekte etmek istediğiniz bölgeyi germek. Ponksiyon çok derinden umurumda değil alarak, sadece deri altına enjekte edilir. Ayrıca, Medyumu sırasında enjeksiyon yerinde dışarı kayar iğne tutmaya çalışın: Bu cilt hücreleri tekrar enjekte etmeye çalışırsanız sızıntı olabilir bir delik oluştururken önleyecektir.
   8. Hücreleri enjekte edildikten sonra, fare uyanmak için izin ve biyoparlaklık görüntüleme için yeniden anestezi önce çalıştırmak için bir kaç saat bekleyin. Bunu yapmak izofluran toksisite önler.
      
      
6. Nakledilen hücrelerin in vivo biyoparlaklık görüntülemede
   1. Tüm hayvan biyoparlaklık görüntüleme için, D-luciferase intraperitoneal olarak 375 mg / kg vücut ağırlığı. Enjeksiyondan önce dozu hesaplamak için hayvan tartılır.
   2. Sadece orta hat kapalı, periton D-luciferase enjekte edilir. Çok derin gitmek ya da iç organlara zarar verebilir dikkatli olun. Fare uyanmak başlarsa, nakavt kutusuna geri koyun ve bir ya da iki dakika bekleyin. Fareler için, maksimum biyoparlaklık genellikle enjeksiyondan sonra 15-40 dakika oluşur.
   3. HESC tarafından yayılan herhangi bir ışık absorbe yardımcı olmak için mat siyah kağıt görüntüleme kutusunda yer unutmayın. Siyah kağıt üstünde, izofluran ile görüntüleme odasında fare (arka kadar) yerleştirin. 10 saniyelik bir pozlama süresi ile başlayın. Sinyal doymuş ise, pozlama süresini azaltmayı deneyin, çok zayıf, pozlama artırmak.
   4. Farenizi sinyal maruz kalma süresi için optimize edildikten sonra, sinyal maksimum ulaşıncaya kadar görüntüler her dakika başlar. Bu en iyi enjeksiyon yerlerini gizlemeleri "ilgi alanları" (ROI) seçmek için görüntüleme yazılımı kullanılarak yapılır. Her ROI sinyal yoğunluğu izleyerek kolayca maksimum sinyal yoğunluğu ulaşıldı belirten sinyal azalmaya başladığında belirleyebilirsiniz. Maksimum sinyal son veri olarak kullanılması gerekir.
   5. Görüntüleri memnun olduğunuzda, izofluran fare kaldırmak ve onun kafes uyanmak için izin. Genellikle, fare, 15 dakika içinde uyanmak gerekir.
   6. HESC hayvan hayatta Biyoparlaklık muhabiri gen görüntüleme sürece, günlük, haftalık ve aylık tekrar edilebilir. Gelişmekte olan bir teratom Sinyal hESC sayısı hızla artmaya başlar, genellikle hafta sipariş üzerine, zaman içinde katlanarak artacaktır.
   7. Biyoparlaklık görüntülerin istenilen zaman içerisinde elde edildikten sonra, hayvan kurban ve histoloji için kullanılan doku kesitlerinde olabilir.

PET ve MRI gibi diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, biyoparlaklık sınırlı mekansal çözünürlükte ve nispeten zayıf fotonların enerji (2-3 eV) nedeniyle azalmış doku penetrasyonu; bu nedenden dolayı şimdiye kadar büyük hayvanlara uygulanabilir değil. Ancak, biyoparlaklık in vivo kök hücre küçük hayvanlar izleme için son derece cazip, düşük maliyetli, yüksek verim ve non-invaziv olma avantajına sahiptir. PET ve floresan yapıları gibi Sigara biyoparlaklık muhabiri genler lusiferaz ile birlikte, bireysel muhabiri genleri içeren farklı etki oluşan bir füzyon muhabiri gen oluşturmak için kullanılıyor olabilir. Örneğin, grubumuzun bir füzyon fluc, monomerik kırmızı floresan proteini (MRFP) içeren inşa kullanır ve herpes simpleks virüsü timidin kinaz (TTK, PET muhabiri gen), küçük hayvanlarda kök hücre davranış ve çok amaçlı izleme için kesilmiş. Zamanla, stabil bir şekilde entegre muhabiri genler endojen kromozomal makine gen susturulması tabi olabilir. Gen susturulması için bir gazeteci gen duyarlılık organizatörü ifade sürüş seçimi yakından ilişkilidir. Örneğin, sitomegalovirüs organizatörü (pCMV) hızlı hESC susturuldu. Bizim laboratuvar, birden fazla hESC hücre hatları inşa çift füzyon ifade sürücü insan ubikuitin-C organizatörü (kasık) ile iyi bir başarı olmuştur ve zaman içinde en az sinyal kaybı gözlemledik.

Sonuç olarak, hESC-kaynaklı hücre yenilenmesini klinik olarak anlamlı hale gelmeden önce bazı temel biyolojik engellerin üstesinden gelinmesi gerekir farklılaşmış hücrelerin nakli, farklılaşmamış hücrelerden teratom oluşumu, ve ana organizmanın bağışıklık ret yani hücre ölümü ya da apoptoz. Bu ve diğer sorunlar takip hESC engraftman, hayatta kalma ve alıcı organizmanın içinde yayılması için ihtiyaç vurgulayın. Ateşböceği lusiferaz muhabiri gen ve ultra-hassas CCD kamera gibi moleküler görüntüleme tekniklerinin gelişmesi, hücrelerin yerini, göç, proliferasyon ve in vivo olarak farklılaşması non-invaziv, tekrarlayan değerlendirme sağladı. Bu gibi teknolojiler hESC biyoloji laboratuvar klinik uygulamalar doğru itme çeviri yardımcı olacaktır.

Tim Doyle, Doktora ve Stanford biyoparlaklık görüntüleme ile yardım için Vivo Görüntüleme Merkezi sayesinde. Ayrıca matris çözümü ile kök hücre ko-enjeksiyon tekniği paylaşmak için Ngan Huang, doktora teşekkür eder. Son olarak, Steve sayesinde Keçe, Doktora veterinerlik hayvan bakımı ile ilgili yardım için.