In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

Mit dem wachsenden Interesse an Stammzelltherapien, sind molekulare Bildgebungsverfahren ideal für die Überwachung Stammzellen Verhalten nach der Transplantation. Luciferase Reporter Gene nicht-invasive, repetitive Beurteilung der das Überleben der Zelle, den Standort und Verbreitung in vivo ermöglicht. Dieses Video wird gezeigt, wie man hESC Proliferation in einer lebenden Maus zu verfolgen.

Die Entdeckung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) hat sich dramatisch die Werkzeuge zur Verfügung, um Mediziner in der regenerativen Medizin interessiert erhöht. Allerdings hat die direkte Injektion von hESCs, und Zellen aus hES differenziert, in lebende Organismen bisher durch erhebliche Zelltod, Teratom-Bildung und Host Immunabwehr behindert. Das Verständnis der in vivo hESC Verhalten nach der Transplantation erfordert neuartige bildgebende Verfahren in Längsrichtung Monitor hESC Lokalisation, Ausbreitung und Lebensfähigkeit. Die molekulare Bildgebung hat Ermittler einen hohen Durchsatz, kostengünstig und empfindliche Methode für die Verfolgung von in vivo Proliferation über Tage, Wochen und sogar Monate. Dieser Fortschritt hat sich das Verständnis der räumlich-zeitlichen Kinetik hESC Engraftment, Proliferation und Teratom-Bildung in lebenden Probanden erhöht.

Ein wichtiger Fortschritt in der molekularen Bildgebung hat die Ausweitung der nicht-invasiven Reportergen-Assays von Molekular-und Zellbiologie in in vivo multimodalen Bildgebung Plattformen. Diese Reporter-Gene unter der Kontrolle von technischen Promotoren und Enhancer, die die Vorteile der Wirtszelle s Transkriptionsmaschinerie sind in Zellen mit einer Vielzahl von Vektor-und Nicht-Vektor-Methoden eingeführt. Einmal in der Zelle kann Reportergene entweder konstitutiv oder nur unter bestimmten biologischen oder zellulären Bedingungen transkribiert werden, abhängig von der Art des verwendeten Promotor. Transkription und Übersetzung von Reporter-Genen in bioaktive Proteine ​​wird dann mit empfindlichen, nicht-invasive Instrumente (zB CCD-Kameras) mit Signal-Erzeugung Sonden wie D-Luciferin detektiert.

Um zu vermeiden, die Notwendigkeit für exzitatorische Licht zur Gewinnung von Stammzellen in vivo verfolgen, wie es für die Fluoreszenz-Bildgebung erforderlich, für Biolumineszenz Reportergen Imaging-Systeme nur eine exogen verabreichtes Sonde Lichtemission zu induzieren. Firefly Luciferase aus dem Leuchtkäfer Photinus pyralis abgeleitet, kodiert ein Enzym, das D-Luciferin katalysiert die optisch aktiven Metaboliten, Oxyluciferin. Optische Aktivität kann dann mit einem externen CCD-Kamera überwacht werden. Stabil transduzierten Zellen, dass der Reporter tragen im Rahmen ihrer chromosomalen DNA-Konstrukt passieren das Reporter-Konstrukt DNA auf Tochterzellen, so dass für die Längs-Überwachung hESC Überleben und Proliferation in vivo. Darüber hinaus, weil die Expression des Reportergens Produkt zur Signalerzeugung erforderlich ist, wird einzig gangbare Eltern und Tochterzellen erzeugen Biolumineszenzsignal; apoptotischen oder tote Zellen nicht.

In diesem Video werden die spezifischen Materialien und Methoden für die Verfolgung von Stammzellen die Proliferation und Teratom-Bildung mit Biolumineszenz-Bildgebung erforderlich beschrieben werden.

1. Bau von Double Fusion Reporter Gene
   1. Um Biolumineszenz-Bildgebung des menschlichen embryonalen Stammzellen durchzuführen, müssen Sie zunächst Zellen, die stabil exprimieren, einem Luciferase-Reportergen wie Glühwürmchen-Luciferase durch einen konstitutiven Promotor wie Ubiquitin oder EF1A getrieben zu erhalten.
   2. Der Schwerpunkt dieses Protokoll ist auf Reportergen-Anwendungen, so detaillierten Verfahren nicht vorgesehen sind hier. Allerdings ist unser Labor die allgemeine Strategie zu einer doppelten Fusionskonstrukt Vektor, der Glühwürmchen-Luciferase (fluc) und Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) durch einen Abstandhalter in pCDNA 3,1 + getrennt enthält.
   3. Kurz gesagt, unsere Doppel-Fusionsgen wurde ursprünglich nach dem Cytomegalovirus-Promotor in pCDNA 3.1 (+) gelegen, so das 3,3 kbp-Fragment wurde unter Verwendung NdeI und NotI Verdauung und blunt-end in die multiple Klonierungsstelle eines selbst-inaktivierenden (SIN ligiert ) lentiviralen Vektor, unter der Kontrolle eines Ubiquitin-Promotor.
      
      
2. Lentivirale Transduktion
   1. hESCs kann transduziert werden 3-5 Tage nach dem Durchgang bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 (virale Titer von ca. 107 mit 106 Zellen inkubiert).
   2. Die aufgetauten virale Lager direkt an die frische hESC Medien hinzugefügt werden.
   3. Aktualisieren Sie die Medien 12 und 24 Stunden später.
   4. Nach 48 h kann Transduktionseffizienz von qualitativ beurteilt mittels Fluoreszenzmikroskopie. Anschließend kann FACS verwendet werden, um infizierte Zellen zu isolieren.
      
      
3. Die Kultivierung hESCs und Einführung in die Imaging Set-up
   1. Kultur Ihrer Luciferase positive hESCs in Feeder-freien Bedingungen. Wir in der Regel folgt dem Standard WiCell Protokoll und verwenden 6-well Platten in growth factor reduziert Matrigel beschichtet, entweder mit konditionierten Medien oder kommerzielle, Feeder-freien Medien.
   2. Zum Nachweis der Luciferase-positiven Zellen werden zu können, muss der Reporter-Sonde D-Luciferin bereits vorbereitet. Um dies zu tun, aliquoten Luciferin in 1-1.5 ml Vorbereitungen auf eine Endkonzentration von 45 mg / mL. Halten Sie die Aliquots bei -20 ° C, wenn nicht in Gebrauch ist und zur Vermeidung von Lichteinfall durch Abdecken mit einem Papiertuch, wenn sie nicht in der Lagerung.
   3. Um die Luciferase-positiven Zellen sichtbar zu machen, verwenden wir IVIS 50 und IVIS 200 Imaging Systems (Xenogen Corporation, Alameda, CA). Letzteres enthält eine integrierte isoflourane Apparate-und Induktions-Kammer für temporäre Anästhesie bei Kleintieren.
      
      
4. In-vitro-Biolumineszenz-Bildgebung von Zellkulturen
   1. Für In-vitro-Biolumineszenz-Bildgebung, ist es wichtig, sterilen Bedingungen zu halten. Daher sollte der Imaging-System steril sein, vorzugsweise in einer Zellkultur Raum.
   2. Vor Bildgebung, entfernen Sie die Zelle Medien und fügen gerade genug PBS zu den Zellen zu decken. Zum Beispiel, 1ml PBS in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit Ihren hESC Kulturen.
   3. Das Verhältnis von D-Luciferin zu PBS sollte 1:100 sein, so fügen Sie 10 ul aufgetauten D-Luciferin in jede Vertiefung der 6-Well-Platte.
   4. Warten Sie eine Minute, dann nehmen Sie ein Bild mit einer Belichtungszeit von 1 Sekunde. Wenn das Signal schwach ist, erhöhen Sie die Belichtung Intervall und versuchen Sie es erneut.
   5. Die Biolumineszenz-Signal spiegelt Zellzahl, so Quantifizierung Assays durchgeführt werden kann, dass korrelieren Signal mit unterschiedlichen Zellzahlen.
      
      
5. Vorbereitung der Maus und Injizieren Zellen in vivo Bildgebung
   1. Reporter-Gen Imaging bietet eine High-Throughput-, kostengünstig und sensitive Methode für die Verfolgung von Zellen nach der Transplantation über Tage, Wochen und sogar Monate. Dies ist besonders wichtig, da transplantierte Stammzellen häufig Teratome zu bilden, werden durch das Immunsystem des Wirtes abgelehnt, oder einfach nur sterben.
   2. Die einfachste Methode zur Bildgebung Teratom-Bildung in vivo ist hESCs, dass die Glühwürmchen-Luciferase Reporter-Gen exprimieren, in den Rücken von SCID-Mäusen und erwerben Biolumineszenz Bilder mit dem IVIS System zu injizieren.
   3. Wenn Sie bereit sind, um die Zellen Transplantation sind, verwenden Dispase oder Kollagenase, um die Zellen zu lösen, waschen mehrmals, und hängen sie in einer 1:1-Mischung von Wachstumsfaktoren reduzierten Matrigel und DMEM. In der Regel haben wir erste Mix der Zellen mit DMEM gekühlt und fügen Sie dann in der Matrigel. Für jede subkutanen Injektionsstelle injizieren wir 200.000 Zellen in ein 50-100 ul Volumen der Matrigel / DMEM suspendiert. Die Zellzahl kann je nach Ihrer Anwendung werden. Denken Sie daran, alles auf Eis vor der Injektion zu halten.
   4. Sobald die Zellen bereit sind, betäuben die Maus, indem Sie es in der Induktion Box mit Isofluran flow eingeschaltet. Nach 1-5 Minuten ist die Maus schläft und kann auf dem OP-Tisch mit stufenloser Isofluran platziert werden.
   5. Da Fell natürlich auto-fluoresziert und die Biolumineszenz Bild zu verdunkeln können, benötigen wir, um das Haar von der Rückseite der Maus zu entfernen. Der einfachste Weg, dies zu tun ist, um einen elektrischen Rasierer verwenden, aber Sie können auch Haarentfernung Gele. Wischen Sie mit Alkohol zu sterilisierendie Haut hinterher
   6. Als nächstes erstellen Sie Ihre Zellsuspension in einer Spritze. 23 bis 27 Gauge-Nadeln funktionieren am besten, da sie nicht verstopfen mit Zellen. Wenn die Nadel zu groß ist (<23 Gauge) die Nadel-Darm-Trakt, sollten Sie ein großes Loch, durch das Zellen wieder austreten kann.
   7. Spritzen Sie die Zellen unter die Haut in die Maus ist wieder da. Da die Haut ist ganz locker, mit dem Daumen und Zeigefinger klemmen und strecken Sie den gewünschten Bereich zu injizieren. Inject direkt unter die Haut, dabei nicht zu durchstechen zu tief. Versuchen Sie auch, um die Nadel ein Herausrutschen aus der Injektionsstelle während Herunterdrücken des Kolbens zu halten: Dadurch wird verhindert, ein Loch in die Haut, durch die den Zellen austreten, wenn Sie wieder zu injizieren ausprobieren können.
   8. Nachdem die Zellen injiziert werden, ein paar Stunden warten, damit die Maus zu wecken und toben, bevor erneut anästhesiert für Biolumineszenz-Bildgebung. Dies vermeidet Isofluran Toxizität.
      
      
6. In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung der transplantierten Zellen
   1. Für ganze Tier Biolumineszenz-Bildgebung haben wir eine intraperitoneale Injektion von D-Luciferin bei 375 mg / kg Körpergewicht. Wiegen Sie das Tier, um die Dosierung vor der Injektion zu berechnen.
   2. Spritzen Sie die D-Luciferin in das Bauchfell, direkt an der Mittellinie. Seien Sie vorsichtig, um nicht zu tief, oder Sie können innere Organe beschädigt werden. Wenn die Maus beginnt zu erwachen, setzen Sie ihn wieder in die Ko-Box und warten Sie eine Minute oder zwei. Bei Mäusen, die maximale Biolumineszenz tritt in der Regel 15-40 Minuten nach der Injektion.
   3. Denken Sie daran, matte schwarze Papier in der Imaging-box Ort, um Hilfe zu absorbieren kein Licht nicht durch die hESCs emittiert. Platzieren Sie die Maus (Rückseite nach oben) in der Imaging-Kammer mit Isofluran, auf der Oberseite des schwarzen Papiers. Beginnen Sie mit einer Belichtungszeit von 10 Sekunden. Wenn das Signal gesättigt ist, versuchen die Verringerung der Belichtungszeit, und wenn zu schwach, erhöhen Sie die Belichtung.
   4. Sobald das Signal Belichtungszeit ist für Sie mit der Maus optimiert wurde, beginnt, die Bilder jede Minute, bis das Signal ein Maximum erreicht. Dies geschieht am besten, indem Sie die Imaging-Software auf "regions of interest (ROI)", dass Ihre Injektionsstellen Abdeckung wählen getan. Durch die Überwachung der Signalstärke bei jedem ROI können Sie leicht feststellen, wenn das Signal zu verringern beginnt, was darauf hinweist, dass die maximale Signalstärke erreicht wurde. Die maximale Signal sollte als endgültige Daten verwendet werden.
   5. Wenn Sie mit Ihren Bildern zufrieden sind, entfernen Sie die Maus von Isofluran und lassen Sie ihn aufwachen in seinem Käfig. Normalerweise sollten die Maus aufwachen innerhalb von 15 Minuten.
   6. Biolumineszenz Reportergen Bildgebung kann wiederholt werden, täglich, wöchentlich und monatlich werden, solange die Zellkulturen in das Tier überleben. Signal aus einem Entwicklungsland Teratom wird exponentiell mit der Zeit, in der Regel in der Größenordnung von Wochen, als die hESCs zu wuchern beginnen.
   7. Nachdem der gewünschte zeitliche Verlauf der Biolumineszenz Bilder erworben wird, kann das Tier geopfert werden und Gewebeschnitten für die Histologie verwendet.

Im Vergleich zu anderen Verfahren wie PET und MRI hat Biolumineszenz begrenzte räumliche Auflösung und reduzierten Gewebepenetration aufgrund der relativ schwachen Energie der emittierten Photonen (2-3 eV); aus diesen Gründen hat es bislang nicht anwendbar in großen Tieren. Allerdings hat Biolumineszenz den Vorteil, dass Low-Cost, High-Throughput-und non-invasive, so dass es sehr wünschenswert, in vivo Stammzellen Tracking bei Kleintieren. Non-Biolumineszenz Reporter-Gene wie PET und Fluoreszenz-Konstrukte können in Verbindung mit Luciferase zu einer Fusion Reportergen, das von verschiedenen Domains, welche die einzelnen Reporter-Gene zusammen schaffen werden. Zum Beispiel verwendet unsere Gruppe eine Fusion Konstrukt, das Fluc, monomeres rot fluoreszierendes Protein (mRFP) und Herpes-simplex-Virus abgeschnitten Thymidinkinase (TTK, eine PET-Reporter-Gen) für Multi-Modalität Verfolgung von Stammzellen Verhalten bei Kleintieren. Mit der Zeit kann stabil integriert Reportergene unterliegen Gen-Silencing durch die endogene chromosomale Maschinen. Ein Reportergen ist die Anfälligkeit für Gen-Silencing ist eng mit der Wahl des Promotors der Fahrt seinen Ausdruck verwandt. Zum Beispiel ist der Cytomegalovirus-Promotor (pCMV) schnell in hESCs zum Schweigen gebracht. Unser Labor hat gute Erfolge mit der menschlichen Ubiquitin-C-Promotor (Schambein), um die Expression eines Double Fusion Festplatte erstellen in mehrere hES-Zelllinien hatten, und haben beobachtet, minimalen Signalverlust über die Zeit.

Im Ergebnis vor hESC-derived Zellerneuerung wird klinisch relevant, müssen einige grundlegende biologische Hürden überwunden werden - und zwar Zelltod oder Apoptose nach der Transplantation von differenzierten Zellen, Teratom-Bildung aus undifferenzierten Zellen und Immunabwehr durch den Wirtsorganismus. Diese und andere Herausforderungen unterstreichen die Notwendigkeit für die Verfolgung von menschlichen embryonalen Stammzellen Transplantation, Überleben und die Vermehrung innerhalb der empfangenden Organismus. Die Entwicklung der molekularen Bildgebung, wie die Glühwürmchen-Luciferase Reportergen und ultra-empfindlichen CCD-Kameras hat nicht-invasive, repetitive Beurteilung der Zell-Lage, die Migration, Proliferation und Differenzierung in vivo ermöglicht. Technologien wie diese helfen Push-Übersetzung hESC Biologie aus dem Labor auf die klinische Anwendung.

Dank Tim Doyle, PhD und der Stanford Center for In Vivo Imaging für die Unterstützung bei Biolumineszenz-Bildgebung. Auch dank Ngan Huang, PhD für die gemeinsame Nutzung ihrer Technik auf Stammzell-Co-Injektion mit Matrix-Lösung. Schließlich Felt dank Steve, Ph.D. für die Unterstützung bei tierärztliche Pflege der Tiere.