Aplysia californica nöronların büyüme konisinin motilite ve rehberlik yüksek çözünürlüklü görüntüleme için mükemmel bir büyük kültür büyüme konileri gelişir. Burada, diseksiyon ve Aplysia çanta hücresi nöronların kaplama gibi canlı hücre görüntüleme için bir oda kurmak için bir protokol mevcut.

Nöronal büyüme konileri, ortamda, rehberlik ipuçları tespit ve uygun hedef hücre doğru yönlü hareket içine bu bilgileri transduce akson ucunda son derece hareketli yapılardır. Rehberlik bilgileri tam olarak hücre yüzeyi altında yatan dinamik sitoskeletal ağlara iletilir anlamak için, bir canlı hücre protein dinamiği yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte görüntüleme için uygun bir model sistem gerekiyor. Tipik omurgalı büyüme konileri kantitatif F-aktin ve mikrotübül dinamiklerini analiz etmek için çok küçük. Deniz tavşan Aplysia californica Nöronlar, omurgalı nöronlar 5-10 kat daha büyük oda sıcaklığında kolayca saklanabilir ve mikromanipülasyon ve biyofiziksel ölçümler için çok sağlam hücreler. Onların büyüme konileri çok sitoplazmik bölge ve iyi tanımlanmış bir iskelet sistemi tanımlamıştır. Nöronal hücre gövdeleri büyüme konisinin motilite ve rehberlik eğitimi için probların çeşitli microinjected olabilir. Mevcut protokolde, karın ganglion, çanta hücresi nöronların kültür ve büyüme konileri canlı hücre görüntüleme için bir görüntüleme odası kurma diseksiyonu için bir prosedür ortaya koymaktadır.

Çözümler

• L15-ASW hücre kültür ortamı (1l)
  • 1 torba toz L15
  • 800 ml H ₂ O ultra saf eklemek
  • NaCl 400 mm
  • MgSO ₄ 27 mM
  • MgCl ₂ 28 mM
  • 4 mM L-Glutamine
  • Gentamisin 50 mg / ml
  • Hepes 5 mm
  • PH 7.9 'a ayarlayın
  • Damla damla CaCl ₂ 9.3 mM ekle (çökeltileri eğer stop)
  • 1 lt H ₂ O ultra saf ekle
  • Ozmometre (buhar basıncı, Wescor # 5520) ozmolarite (950-1000 mg / kg)
  • Filtre 0.22 mikron pozitif basınçlı filtrasyon ünitesi (Millipore SVGV010RS Filtreler) kullanarak
  • 1 ay kadar 4 ° C'de muhafaza
• Poli-L-lisin (70-150 kD) 200 mg / ml stok solüsyonu steril H ₂ O ultra saf ^-20 ° C'de muhafaza
• 0.5 M MgCl ₂ çözümü

1. Gün: Aplysia karın ganglion diseksiyonu

Enzimatik disosiasyon çözüm hazırlanması

1. Eppendorf tüp Dispase enzim (LS02111 Worthington, Kedi): 9-10 mg tartılır
2. Ul 900, L15-ASW kültür ortamı ve steril H ₂ O ultrapure 100 ul
3. Mix ve yerde oda sıcaklığında (RT)

Karın ganglion diseksiyonu

1. 0.5 M MgCl ₂ çözeltisi ile 50 ml şırınga doldurun.
2. Tanktan bir hayvanın, hayvan mürekkep savunma tepkisini önlemek için nazikçe.
3. Sol sağ, kaudal tarafında bir diseksiyon tahtada yan Aplysia (strafor kurulu), rostral tarafında yerleştirin.
4. Sadece başın arkasında hayvan iğne takın ve vücut boşluğuna tüm MgCl ₂ çözüm enjekte.
5. Yavaşça vücut boşluğuna boyunca MgCl ₂ çözüm dağıtmak için hayvan ovmak tamamen anestezi hayvan için birkaç dakika bekleyin.
6. Diseksiyonu kuruluna hayvanın baş ve kuyruk iki iğne ile sabitleyin.
7. Forseps tarafında büyük bir açılım yapmak için büyük baş ve kuyruk doğru makas ile deri ve kas tabakası ile kesim, cilt kaldırmak için kullanın.
8. Fırça gibi yumurtalık altında karın ganglion bulun. Karın ganglion önünde yaklaşık 1 cm bağlantı sinirleri tutmak için forseps kullanımı, forseps konumdan önünde ve karın ganglion arkasında diseksiyon makas ile sinirler kesilir.
9. 22 Dispase çözüm ve 15-16 saat boyunca inkübe içine yerleştirin ganglion ° C sıcaklık kontrollü su banyosu.

2. Gün: Aplysia çanta hücreleri Kaplama

Poli-lizin kaplı lamelleri hazırlanması

1. Bir akış tezgah, 4 ml L15-ASW orta her doldurma, ganglion diseksiyonu için çalışma yemekleri olarak üç 35mm Petri yemekler hazırlamak. Dispase çözüm karın ganglion sindirim 15.5 saat sonra çalışma yemekler aktarın.
2. Forseps almak asit temizleme # 1.5 lamelleri (22x22 mm) etanol içinde saklanan, alkol kaldırmak ve Bunsen beki üzerinde kısaca onlara alevli lamelleri sterilize. Lamelleri kültür yemeklerinin içine yerleştirmeden önce onları kısa bir süre soğumasını bekleyin.
3. Bunsen beki üzerinde sarı bir ucu (alev sadece kısa bir süre plastik erime önlemek için!) Eğilme, kavisli bir kaplama ucu hazırlayın.
4. 20 mcg / ml poli-lizin çözüm uygun miktarda steril H ₂ O ultrapure ile 200 mg / ml stok solüsyonu seyreltilmesi ile hazırlayın.
5. 20 mg / ml poli-lizin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe 500 ul her lamel örtün.
6. 500 ul steril H ₂ O ultra saf her her lamel 3-5 kez yıkayın.
7. Lamelleri gelen suyu çıkarın; L15-ASW kültür ortamı 4 ml her çanağı doldurmak.

Çanta hücreleri Fototerapisi

1. Diseksiyon mikroskobu altında, daha önce% 95 etanol (Şekil 1 satır 1) ile temizlenmelidir yarım kullanarak diseksiyon makas ve forseps karın ganglion kesti.
2. Çanta hücre küme ve hemiganglion hücreleri (Şekil 1 satır 2) arasındaki kesin ganglion, sinir uzantıları çanta hücrelerinin diğer tarafında kalan (Şekil 1 satır 3) kesip bir yarısında. Bir defada ganglion bir yarım çalışın; tabak içinde, diğer yarısı terk edilirken ilk küme hücre kaplama.
3. Iki forseps (veya bir forseps ve diseksiyon makas), çanta hücre kümesi etrafındaki bağ dokusu kılıf bir kenara iterek sürüm çanta hücre kümesi. Gerekirse bağ dokusu diseksiyon makas ile kesin. Bu işlem sırasında sıkmak ve çanta hücre kümesi çok fazla dokunmamaya dikkat edin.
4. En bağ dokusu çıkarılır, b transferbükük sarı ucu ile yeni bir çalışma çanak içine ag hücre kümesi önceden hazırlanmış. Sarı ucu torba hücre kümesi içinde sıkışıp veya hava / orta arayüzü sıkışmış izin vermeyin dikkatli olun.
5. Bireysel çanta hücreleri çıkarmak için sarı ucu ile küme Karışım. Ucu ve küme pipetleme bunu. Düşük kesme kuvvetleri ile başlayın ve gerektiğinde kuvvetini artırmak. Her zaman çok fazla hücre öldürmeden nöronların kaldırmak için gereken en düşük güç kullanmayın.
6. 3-5 sağlıklı çanta hücreleri toplamak ve poli-lizin kaplı lamel ile bir çanak aktarabilirsiniz. Ölü hücreleri (onlar merkezinde siyah / şeffaf) ve bağ dokusu enkaz toplayıp kaçının.
7. 6. adımı tekrarlayın. ve 15-25 canlı nöronlar hakkında her lamel merkezi haline bir yer. Yanı sıra, ölü hücreleri veya enkaz aktarılıyorsa, toplayıp ya da sağlıklı hücreleri uzak üfleme istenmeyen malzeme çıkarmak. Bu süreç, her iki kümeleri için yaklaşık 2-3 saat sürer.
8. Daha sonra RT en az 2 saat akışını bankta kültür yemekleri tutmak (istenmeyen titreşimi önlemek için akışı tezgah üfleyici tutmak) hücreleri takmak için izin bitirdi.
9. Yemekler, 14 ° C, gece ya da daha sonra kullanmak kadar bir inkübatör içine yerleştirin. Büyüme konileri, 4-10 saat içinde gelişebilir.

Şekil 1. Aplysia californica karın ganglion şematik. Çanta hücre kümeleri elde etmek için burada kesmek için Renk hatları göstermektedir.

3. Gün: Aplysia çanta hücreleri canlı görüntüleme için oda kurma

Görüntüleme odasının Meclisi

1. Çanta hücreleri canlı hücre görüntüleme deneyleri için kullanmadan önce, bir düşük güç mikroskobu hücreler inceleyin. Hücrelerin sağlıklı büyüme konileri gelişmiş değil varsa, oda sıcaklığında 1-2 saat için taze orta ve terk kaynağı.
2. Taze L15-ASW orta plakalar tedarik için eski orta yarısından fazlası (~ 2 ml), bir vakum hattı ile kaldırmak ve 2 ml yeni L15-ASW petri başına orta eklemek. Tamamen bu lamel hücreleri çıkarmak gibi bir defada çanak tüm orta kaldırmak için önemlidir.
3. Çanta hücre görüntüleme için, biz, bir sandviç gibi görüntüleme odasında iki lamelleri ve iki plastik ayırıcılar monte. Sandviç üst lamel, orta ve reaktiflerin kolay değişimi sağlamak için kısa kesilir. Montaj sırasında yerinden oynatmamaya hücreleri engellemek için her zaman bağlı çanta hücreleri ile lamelleri L15-ASW orta batmış olmalıdır.
4. Odanın hazırlamak için, kesilmiş ~ 2mm elmas kalem (cam kesici) ve cetvel ile # 1 lamelleri 22x22 mm sağ tarafında.
5. 1 ml şırınga kullanarak, yüksek vakum gres kısa lamel iki taraf için geçerlidir ve her iki tarafındaki plastik ayırıcılar eklemek. Hem ayırıcılar üst vakum gres yağı uygulayın.
6. Bir coverglass çanta hücreleri içeren petri lamel ve ara montaj, yer ve tersine çevirin. Aynı hizaya getirin ve yavaşça iki Q-ipuçları ters ucu ile alt üst lamel lamel sopa bastırın.
7. Forseps kullanarak, yavaşça dışarı sızdıran orta olmadan petri sandviç montaj dışarı çıkarın. Gerekirse, iki lamelleri hizalayın ve bir Kimwipe fazla orta silin. Sandviç, mikroskop lamı sahibinin alt kısmında üzerine yerleştirin ve klipler kullanarak bakım kapağı takın.
8. Q-ipuçları ile sandviç üst tarafında merkezinde temiz bir cam temizleyicisi (Sparkle cam temizleyici olarak kullanılır) sildi. Ikinci, kuru bir Q-tip ile cam temizleyici çizgileri önlemek için hızlı bir şekilde kurulayın. Alt lamel için de aynı işlemi yapın. Temizlik lamelleri çizgileri ücretsiz yüksek kaliteli görüntüleme için önemlidir.

Çanta hücreleri mikroskop

Aplysia çanta nöronal hücre kültürleri düşük yoğunluklu olduğundan mikroskop hücreleri arasında geçiş kolaylaştırmak için kurulum aşamasında konumlandırma fonksiyonları varsa, bu en iyi olur. Çanta hücreleri kolayca görüntüleme deneyler sırasında sahnede birkaç saat oda sıcaklığında tutulmalıdır. Buharlaşmasını önlemek için düzenli aralıklarla Exchange orta.

Aplysia çanta hücre nöronlar olmayan çok az sayıda nöron hücreleri ile bir serum serbest nöronal hücre kültürü sistemi sağlar. Bu nöronlar, bir dizi önemli hücre biyolojik soruları çözmek için uygun çok geniş bir büyüme konileri oluşturur. Çanta hücre nöronlar birkaç saat içinde kolayca manipüle ve oda sıcaklığında az görüntülü olabilir. Floresan kullanarak bir F-aktin ve mikrotübül polimerizasyon ve translokasyon dinamiklerinin kantitatif çeşitli parametreler analiz edebilir speckle Mikroskobu (FSM). Geçtiğimiz günlerde serbest bırakılan Aplysia genom bilgilerinin yanı sıra geliştirilmiş ifade teknikleri ile birlikte bu görüntüleme araçları, moleküler ve hücresel mekanizmaları nöronal büyüme konisinin motilite ve rehberlik eğitimi için güçlü bir model sistem bu nöronların olun.

Biz Ryan Maneri (Oystercatcher Productions, LLC), diseksiyon video düzenleme ile ilgili yardım için prosedür ve Rodney McPhail (Biyolojik Bilimler Bölümü, Purdue University) çekim için teşekkür etmek istiyorum. Suter laboratuarında Araştırma Purdue Üniversitesi'nde NIH (R01 NS049233) ve Bindley Bioscience Merkezi hibe DMS tarafından desteklenmektedir