Aplysia נוירונים californica לפתח קונוסים צמיחה גדול בתרבות כי הם מעולה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צמיחה חרוט והדרכה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה ו ציפוי של תא עצב Aplysia התיק, כמו גם להקמת תא הדמיה תא חי.

קונוסים הצמיחה העצבית הם מבנים ניעתי מאוד בקצה של אקסונים כי ניתן לזהות רמזים הדרכה הסביבה transduce מידע זה לתנועה כיוונית לכיוון תא היעד המתאים. כדי להבין כיצד מידע והדרכה מועבר מתא השטח לרשתות הבסיסית cytoskeletal דינמי, צריך מערכת מודל מתאים הדמיה תא חי של הדינמיקה חלבון ברזולוציה של זמן ומרחב גבוהה. טיפוסית גביעי צמיחה חוליות קטנים מדי כדי לנתח באופן כמותי F-אקטין ודינמיקה microtubule. נוירונים של ארנבת ים Aplysia californica לפעמים 5-10 גדול יותר נוירונים החוליות, יכול בקלות להיות כל הזמן בטמפרטורת החדר הם תאים חזקים מאוד המיקרומניפולציה מדידות biophysical. קונוסים הצמיחה שלהם הגדירו מאוד אזורים cytoplasmic ומערכת היטב תיאר cytoskeletal. גופי התא העצבי יכול להיות microinjected עם מגוון רחב של בדיקות לחקר חרוט צמיחה תנועתיות והדרכה. בפרוטוקול הנוכחי אנחנו מדגימים נוהל דיסקציה של הגנגליון הבטן, תרבות של נוירונים תא שקית והקמת תא הדמיה הדמיה תא חי של קונוסים צמיחה.

פתרונות

• L15-ASW תרבית תאים בינוניים (1 ליטר)
  • 1 שקית אבקת L15
  • מוסיפים 800 מ"ל של H ₂ O ultrapure
  • NaCl 400 מ"מ
  • MgSO ₄ 27 mM
  • MgCl ₂ 28 מ"מ
  • L-גלוטמין 4 מ"מ
  • גנטמיצין 50 מיקרוגרם / מ"ל
  • HEPES 5 מ"מ
  • התאם ל-pH 7.9
  • הוסף טיפה אחר טיפה CaCl ₂ 9.3 מ"מ (אם להפסיק משקעים)
  • הוסף H ₂ O ultrapure כדי l 1
  • בדוק osmolarity (950-1000 mmol / ק"ג) עם (Wescor, לחץ אדים # 5520) osmometer
  • סנן 0.22 מיקרומטר באמצעות לחץ חיובי סינון יחידה (מסננים: SVGV010RS Millipore)
  • חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 בחודש
• פולי-L-ליזין (70-150 KD) 200 מיקרוגרם / מניות פתרון מ"ל סטרילי H ₂ O ultrapure המשיך -20 ^o C
• 0.5 מ MgCl ₂ פתרון

יום 1: Dissection של הגנגליון Aplysia בטן

הכנת התמיסה דיסוציאציה האנזימטית

1. לשקול 90-10 מ"ג Dispase אנזים (וורטינגטון, חתול: LS02111) בצינור Eppendorf
2. הוסף 900 μl של המדיום ASW-L15 התרבות, 100 μl של סטרילית H ₂ O ultrapure
3. מערבבים ומניחים בטמפרטורת החדר (RT)

Dissection של הגנגליון בטן

1. ממלאים מזרק 50 מ"ל עם 0.5 פתרון M MgCl _2.
2. קח חיה אחת פגז מטנק, לטפל בעדינות כדי למנוע הגנה דיות של החיה התגובה.
3. מניחים את Aplysia על צידו על לוח דיסקציה (קלקר board), בצד מקורי לצד, ממש הזנב שמאלה.
4. הכנס את המחט לתוך החיה מאחורי הראש להזריק כל פתרון MgCl ₂ לחלל הגוף.
5. לשפשף בעדינות את החיה לפזר את הפתרון MgCl ₂ בכל חלל הגוף, לחכות כמה דקות על החיה להיות מורדם לחלוטין.
6. פין ראש וזנב של החיה על קרש החיתוך עם שתי מחטים.
7. שימוש במלקחיים להרים העור, לחתוך דרך העור שכבת השריר במספריים גדולים לכיוון הראש והזנב לעשות פתח גדול בצד.
8. מצא את הגנגליון בטן תחת מברשת השחלה דמוי. שימוש במלקחיים כדי להחזיק את העצבים על חיבור 1 ס"מ מול הגנגליון בטן, לחתוך את העצבים במספריים לנתיחה מול עמדת מלקחיים מחזיק מאחורי הגנגליון הבטן.
9. הגנגליון המקום לתוך הפתרון Dispase ו דגירה של 15-16 שעות ב 22 ° C בעזרת אמבט מים בטמפרטורה מבוקרת.

יום 2: ציפוי של תאים Aplysia שקית

הכנה מרובה ליזין מצופה coverslips

1. בשנת ספסל זרימה, להכין שלושה 35mm בצלחות פטרי כמו עבודה כלים לניתוח של הגנגליון, למלא אותם עם בינוני 4 L15-ASW מ"ל כל אחד. מעבירים את הגנגליון בטן מפתרון dispase לאחד את הכלים לעבוד אחרי 15.5 שעות של מערכת העיכול.
2. בעזרת מלקחיים לקחת חומצה לניקוי # 1.5 coverslips (22x22 מ"מ) לאחסן אתנול, להסיר אלכוהול לעקר coverslips ידי בוער להם בקצרה על מבער בונזן. תנו להם להתקרר בקצרה לפני הצבת coverslips לתוך הכלים תרבות.
3. הכנת ציפוי קצה מעוקל על ידי כיפוף קצה צהוב מעל מבער בונזן (להבה לזמן קצר בלבד, כדי למנוע התכה של פלסטיק!).
4. הכן את הכמות המתאימה של 20 מיקרוגרם / מ"ל פתרון מרובה ליזין על ידי דילול 200 מיקרוגרם / מ"ל מניות פתרון סטרילי עם H ₂ O ultrapure.
5. כיסוי כל coverslip עם μl של 500 מיקרוגרם 20 / ml poly-ליזין דגירה במשך 20 דקות ב RT.
6. לשטוף כל coverslip 3-5 פעמים עם 500 μl סטרילי H ₂ O ultrapure כל אחד.
7. הסר מים coverslips; למלא צלחת עם כל 4 מ"ל של מדיום L15-ASW תרבות.

דיסוציאציה של תאים בשקית

1. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לחתוך את הגנגליון בטן במחצית מספריים לנתיחה ו מלקחיים באמצעות ניקה בעבר עם אתנול 95% (איור 1 שורה 1).
2. על חצי אחד של הגנגליון, לחתוך בין אשכול תיק התא בתאי hemiganglion (1 איור קו 2), לחתוך שלוחות העצבים שנותרו בצד השני של תאים שק (איור 1 שורה 3). עבודה על חצי אחד של גנגליון בכל פעם; לעזוב את החצי השני בצלחת ואילו תאים אשכול הראשונים הם להיות מצופה.
3. השימוש בשתי מלקחיים (או אחד מלקחיים ומספריים דיסקציה), תיק שחרור תא מצרר על ידי לחיצה בצד את מעטפת רקמת החיבור שסביב אשכול תא שקית. גזור משם רקמת חיבור במספריים לנתיחה במידת הצורך. היזהרו לא לסחוט ולגעת אשכול תא שקית יותר מדי במהלך תהליך זה.
4. כאשר רוב רקמת החיבור מוסר, להעביר את bאשכול AG תא לצלוחית עבודה חדש עם קצה צהוב כפוף מוכן קודם לכן. היזהרו שלא להניח את האשכול תא שקית להיות לכוד בתוך קצה צהוב או תקוע ממשק האוויר / בינוני.
5. Triturate אשכול עם קצה צהוב להסיר תאים תיק בודדים. לעשות זאת על ידי pipetting אשכול פנימה והחוצה של קצה. התחל עם כוחות גזירה נמוכים ולהגדיל כוח כנדרש. השתמש תמיד הכוח הנמוך ביותר הנדרש כדי להסיר את הנוירונים בלי להרוג תאים רבים מדי.
6. איסוף 3-5 תאים בריאים שקית ולהעבירם צלחת עם coverslip poly-ליזין מצופה. הימנע להרים תאים מתים (הם שחור / שקוף במרכז) ופסולת רקמת חיבור.
7. חזור על שלב 6. מקום על 15-25 נוירונים חיים למרכז coverslip כל אחד. אם תאים מתים או פסולת מועברים גם להסיר את החומר לא רצויות על ידי מרים אותו או לפוצץ אותו הרחק תאים בריאים. תהליך זה לוקח בערך 2-3 שעות אשכולות שניהם.
8. פעם סיים לשמור את הכלים תרבות על הספסל תזרים לפחות 2 שעות RT כדי לאפשר לתאים לצרף (לשמור על הספסל את זרימת מפוח כדי למנוע רעידות לא רצויות).
9. מניחים את הכלים לתוך באינקובטור ב 14 מעלות צלזיוס למשך הלילה, או עד לשימוש נוסף. קונוסים הצמיחה עשויה להתפתח 40-10 שעות.

באיור 1. סכמטי של הגנגליון californica Aplysia הבטן. קווי צבע לציין היכן לחתוך כדי להשיג תא אשכולות שקית.

יום 3: הגדרת תא הדמיה חיה של תאים Aplysia שקית

האסיפה של הדמיה קאמרית

1. לפני השימוש בתאי שקית ניסויים הדמיה לחיות התא, לבדוק תאים על מיקרוסקופ כוח נמוך. אם התאים לא פיתחו קונוסים צמיחה בריאה, אספקת אמצעי לעזוב טריים ב RT במשך 1-2 שעות.
2. כדי לספק צלחות עם המדיום L15-ASW טריים, להסיר וחצי (~ 2ml) של המדיום הישן עם קו ריק, ולהוסיף 2 מ"ל חדש L15-ASW בינוני לכל צלחת פטרי. חשוב לא להסיר לחלוטין את כל מדיום מן המנה בבת אחת, כמו זה יהיה להסיר תאים coverslip.
3. עבור הדמיה תא שקית, אנחנו להרכיב two coverslips ושני מפרידי הפלסטיק בתא כריך דמוי הדמיה. Coverslip העליון הכריך הוא חתך קצר יותר, כדי לאפשר חילופי קל בינוני ריאגנטים. במהלך האסיפה, coverslips עם תאים בתיק המצורף צריך להיות שקוע בינוני L15-ASW בכל עת כדי למנוע מתאי פירוק.
4. כדי להכין את החדר, לחתוך ~ 2 מ"מ מן הצד הימני של מ"מ coverslips # 1 22x22 עם יהלום עט (חותך זכוכית) השליט.
5. באמצעות מזרק 1 מ"ל, למרוח משחה ואקום גבוה לשני הצדדים של coverslip הקצר, ולצרף מפרידי פלסטיק לכל צד. למרוח משחה ואקום לחלק העליון של מפרידי שניהם.
6. היפוך coverslip והרכבה spacer, ואת המקום לתוך צלחת פטרי המכילה תאים תיק על coverglass. יישר ולחץ בעדינות עד מקל coverslip coverslip מלמעלה למטה עם סיום הפוכה של שני Q-טיפים.
7. בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים הרכבה כריך מתוך צלחת פטרי ללא המדיום דולף החוצה. יישור שתי coverslips, במידת הצורך, ולנגב את עודפי בינוני עם Kimwipe. מניחים את הכריך על החלק התחתון של מחזיק שקופיות מיקרוסקופ ולצרף את המכסה עם טיפול באמצעות קליפים.
8. נקו את מרכז בצד העליון של כריך עם Q-טיפים טפחה על לניקוי זכוכית (Sparkle משמש לניקוי זכוכית). יבש במהירות את מנקה זכוכית עם השני, יבש Q-טיפ להימנע קווי פס. לעשות את אותו הדבר עבור coverslip התחתונה. Coverslips נקי ללא קווי פס חשובים הדמיה באיכות גבוהה.

תיק תאים המיקרוסקופ

מאז תא Aplysia שקית תרבויות עצביים נמצאים בצפיפות נמוכה, עדיף אם ההתקנה מיקרוסקופ שלך יש מיצוב הבמה פונקציות כדי להקל על המעבר בין התאים. תאים תיק יכולים להישמר בקלות במשך כמה שעות על הבמה RT במהלך הניסויים הדמיה. הבורסה בינוני מעת לעת, כדי למנוע אידוי.

תא Aplysia נוירונים תיק לספק סרום ללא מערכת העצבית עם תרבית תאים לא עצביים תאים בודדים. נוירונים אלה מהווים קונוסים צמיחה גדול מאוד מתאים לכתובת מספר שאלות חשובות תא ביולוגי. תא עצב תיק יכול בקלות להיות מניפולציות צילמו בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM) אפשר כמותית לנתח את הפרמטרים השונים של אקטין-F ו פילמור microtubule ודינמיקה טרנסלוקציה. כלים אלה הדמיה יחד עם מידע שפורסמו לאחרונה הגנום Aplysia כמו גם טכניקות ביטוי משופר את הנוירונים האלה מערכת מודל עוצמה לחקר המנגנונים המולקולריים ו הסלולר של תנועתיות עצבי חרוט צמיחה והדרכה.

ברצוננו להודות ריאן Maneri (Oystercatcher Productions, LLC) עבור הצילומים ההליך שלנו רודני McPhail (מחלקת מדעי הביולוגיה, אוניברסיטת Purdue) לקבלת סיוע עם עריכת וידאו לנתיחה. מחקר במעבדה סוטר הוא נתמך על ידי מענקים מ-NIH (R01 NS049233) והמרכז Bindley Bioscience באוניברסיטת Purdue כדי DMS