Ağ Farmakolojisi Hiperlipidemiye Karşı Fructus Phyllanthi Mekanizmasının Tahmini ve Metabolomik Validasyonu

Bu protokol, Fructus Phyllanthi'nin hiperlipidemiye karşı temel hedeflerini ve mekanizmalarını araştırmak için ağ farmakolojisi tahmini ve metabolomik doğrulamaya dayanan entegre bir stratejiyi tanımlamaktadır.

Hiperlipidemi tüm dünyada kardiyovasküler hastalıklar ve karaciğer hasarı için önde gelen bir risk faktörü haline gelmiştir. Fructus Phyllanthi (FP), Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) ve Hint Tıbbı teorilerinde hiperlipidemiye karşı etkili bir ilaçtır, ancak potansiyel mekanizma daha fazla araştırma gerektirir. Bu araştırma, ağ farmakolojisi tahminini metabolomik validasyon ile birleştiren entegre bir stratejiye dayanarak FP'nin hiperlipidemiye karşı mekanizmasını ortaya koymayı amaçlamaktadır. Toplam kolesterol (TC), trigliserit (TG), düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol (LDL-C) ve yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol (HDL-K) dahil olmak üzere plazma lipid düzeyleri değerlendirilerek yüksek yağlı diyet (HFD) ile indüklenen fareler modeli oluşturulmuştur. FP'nin aktif bileşenlerini ve hiperlipidemiye karşı potansiyel hedefleri bulmak için ağ farmakolojisi uygulandı. Normal grup, model grubu ve müdahale grubu arasındaki diferansiyel metabolitleri ve bunlara karşılık gelen yolları tanımlamak için plazma ve karaciğer metabolomikleri yapıldı. Ağ farmakolojisi ve metabolomik arasındaki ilişki, FP'nin hiperlipidemiye karşı sürecinin kapsamlı bir görünümünü elde etmek için daha da inşa edilmiştir. Elde edilen anahtar hedef proteinler moleküler kenetlenme ile doğrulandı. Bu sonuçlar, FP'nin HFD tarafından indüklenen hiperlipideminin plazma lipid seviyelerini ve karaciğer hasarını iyileştirdiğini yansıtmıştır. FP'de gallik asit, quercetin ve beta-sitosterol, anahtar aktif bileşikler olarak gösterilmiştir. Plazma ve karaciğerde sırasıyla toplam 16 ve altı potansiyel diferansiyel metabolitin, FP'nin metabolomik tarafından hiperlipidemiye karşı terapötik etkilerinde rol oynadığı bulunmuştur. Ayrıca, entegrasyon analizi, müdahale etkilerinin CYP1A1, AChE ve MGAM ile ilişkili olduğunu ve ayrıca esas olarak triptofan metabolizması yolunu içeren L-kinürenin, kortikosteron, asetilkolin ve rafinozun ayarlandığını göstermiştir. Moleküler kenetlenme, hiperlipidemi ile ilişkili protein hedeflerine etki eden yukarıdaki bileşenlerin lipitlerin düşürülmesinde önemli bir rol oynamasını sağlamıştır. Özetle, bu araştırma hiperlipidemi önleme ve tedavi için yeni bir olasılık sağlamıştır.

Hiperlipidemi, insan sağlığı üzerinde ciddi etkileri olan yaygın bir metabolik hastalıktır ve aynı zamanda kardiyovasküler hastalıklar için birincil risk faktörüdür¹. Son zamanlarda, bu hastalık için yaşa bağlı olarak aşağı doğru bir eğilim olmuştur ve genç insanlar uzun süreli düzensiz yaşam tarzları ve sağlıksız beslenme alışkanlıkları nedeniyle daha duyarlı hale gelmiştir². Klinikte, hiperlipidemi tedavisinde çeşitli ilaçlar kullanılmıştır. Örneğin, hiperlipidemi ve buna bağlı aterosklerotik bozuklukları olan hastalar için en sık kullanılan ilaçlardan biri statinlerdir. Bununla birlikte, statinlerin uzun süreli kullanımı, ihmal edilemeyecek yan etkilere sahiptir, bu da hoşgörüsüzlük, tedavi direnci ve advers olaylar gibi kötü bir prognoza yol açar ^3,4. Bu eksiklikler hiperlipidemi hastaları için ek ağrılar haline gelmiştir. Bu nedenle, stabil lipid düşürücü etkinlik ve daha az yan etki için yeni tedaviler önerilmelidir.

Geleneksel Çin Tıbbı (TCM), iyi etkinliği ve az sayıda yan etkisi nedeniyle hastalıkları tedavi etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır⁵. Fructus Phyllanthi (FP), Phyllanthus emblica Linn'in kurutulmuş meyvesi. (halk arasında amla berry veya Hint bektaşi üzümü olarak bilinir), geleneksel Çin ve Hindistan ilaçlarının ^6,7 ünlü bir ilaç ve gıda homolog malzemesidir. Bu ilaç, TCM teorileri^8'e göre, ısıyı temizlemek, kanı soğutmak ve sindirimi teşvik etmek için kullanılmıştır. Modern farmakolojik çalışmalar, FP'nin bir antioksidan, bir anti-enflamatuar, karaciğer koruması, bir anti-hipolipidemik vb. gibi bir dizi çok yönlü biyolojik özellikten sorumlu olan gallik asitler, ellagik asitler ve kuersetin⁹ gibi biyoaktif bileşikler bakımından zengin olduğunu göstermiştir¹⁰. Son zamanlarda yapılan araştırmalar, FP'nin hiperlipidemili hastaların kan lipitlerini etkili bir şekilde düzenleyebileceğini göstermiştir. Örneğin, Variya ve ^ark.11, FP meyve suyunun ve gallik asidin ana kimyasal bileşeninin plazma kolesterolünü azaltabileceğini ve karaciğer ve aorttaki yağ infiltrasyonunu azaltabileceğini göstermiştir. Terapötik etkinlik, peroksizom proliferatör-aktive reseptör-alfa ekspresyonunu arttırmada ve hepatik lipojenik aktiviteyi azaltmada FP'nin regülasyonu ile ilişkiliydi. Bununla birlikte, FP'nin hiperlipidemi iyileştirmede altta yatan mekanizması daha fazla araştırılmalıdır, çünkü biyoaktif bileşenleri oldukça geniştir. FP'nin terapötik etkinliğinin potansiyel mekanizmasını keşfetmeye çalıştık, bu da bu ilacın daha da geliştirilmesi ve kullanılması için yararlı olabilir.

Şu anda, ağ farmakolojisi, TCM'nin terapötik mekanizmasını incelemek için bütünsel ve etkili bir teknik olarak kabul edilmektedir. Tek bir hastalığa neden olan genleri ve yalnızca bireysel bir hedefi tedavi eden ilaçları aramak yerine, çok bileşenli ilacın kapsamlı tedavisi ile ilgili çok hedefli mekanizmasını bulmak için eksiksiz bir ilaç-bileşen-gen-hastalıklar ağı inşa edilmiştir¹². Bu teknik, kimyasal bileşimleri büyük olduğu için TCM için özellikle uygundur. Ne yazık ki, ağ farmakolojisi yalnızca teorideki kimyasal bileşenlerden etkilenen hedefleri tahmin etmek için kullanılabilir. Ağ farmakolojisinin etkinliğini doğrulamak için hastalık modelindeki endojen metabolitler gözlenmelidir. Sistem biyolojisinin gelişmesiyle ortaya çıkan metabolomik yöntem, endojen metabolitlerdeki değişiklikleri izlemek için önemli bir araçtır¹³. Metabolitlerdeki değişiklikler, konağın kararlı durum değişikliklerini yansıtır ve bu da iç mekanizmayı incelemek için önemli bir göstergedir. Bazı araştırmacılar, ilaçlar ve hastalıklar arasındaki etkileşim mekanizmasını keşfetmek için ağ farmakolojisi ve metabolomiklerini başarıyla entegre etmişlerdir^14,15.

Bu makalede, ağ farmakolojisi ve metabolomik tekniklerini entegre ederek FP'nin hiperlipidemiye karşı mekanik temeli araştırılmaktadır. Ağ farmakolojisi, FP'deki ana aktif bileşenler ile hiperlipidemi için moleküler hedefler arasındaki ilişkiyi analiz etmek için uygulandı. Daha sonra, metabolik düzeyde ilaç eylemlerini açıklayabilen hayvan modelindeki endojen metabolitlerin değişimini gözlemlemek için metabolomik yapıldı. Tek başına ağ farmakolojisi veya metabonomik uygulamasıyla karşılaştırıldığında, bu entegre analiz daha spesifik ve kapsamlı bir araştırma mekanizması sağlamıştır. Ek olarak, moleküler yerleştirme stratejisi, aktif bileşenler ve anahtar proteinler arasındaki etkileşimi analiz etmek için kullanılmıştır. Genel olarak, bu entegre yaklaşım, ağ farmakolojisi için deneysel kanıt eksikliğini ve metabolomik yöntem için endojen bir mekanizmanın eksikliğini telafi edebilir ve doğal tıbbın terapötik mekanizma analizi için kullanılabilir. Protokolün ana şematik akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

Hayvanların ele alınmasını içeren tüm prosedürler, Chengdu Üniversitesi Geleneksel Çin Tıbbı Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüş ve Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol numarası 2020-36). Bu çalışmada erkek C57BL/6 fareler (20 ± 2 g) kullanılmıştır. Fareler ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Ağ farmakolojisine dayalı tahmin

NOT: Ağ farmakolojisi, FP'nin aktif bileşenlerini ve bunların hiperlipidemiye karşı temel hedeflerini tahmin etmek için kullanılır.

1. Aktif bileşenlerin seçimi ve temel hedefler
   1. FP'nin aday aktif bileşenlerinin ve hedeflerinin listesini elde etmek için Geleneksel Çin Tıbbı sisteminin farmakoloji veritabanında (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) "Phyllanthi Fructus" anahtar kelimesini arayın.
      NOT: Normalde, veritabanında yalnızca oral biyoyararlanım (OB) %≥30 ve ilaç benzeri (DL) değerleri ≥0,18 olan bileşenler aktif bileşenler olarak dahil edilir.
   2. İlgili hiperlipidemi aday hedeflerini elde etmek için GeneCards veritabanında (https://www.genecards.org/), Online Mendel Inheritance in Man veritabanında (OMIM; https://omim.org/) ve terapötik hedef veritabanında (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) "hiperlipidemi" anahtar kelimesini arayın. Hastalık hedeflerinin e-tablolarını indirin. Hiperlipidemi hedefleri listesini elde etmek için yinelenen hedefleri silin.
   3. Bu listeleri 1.1.1 ve 1.1.2 adımlarında yer alan yeni bir e-tabloya kopyalayın. Kesişim hedeflerini almak için araç çubuğundaki "Veri - Yinelenenleri Tanımla" işlevini kullanın. Gen ve protein adlarını standartlaştırmak için kesişim hedef listesini UniProtKB'ye (http://www.uniprot.org/) aktarın.
      NOT: Bu hedefler hem FP hem de hiperlipidemi ile ilişkilidir. Bu nedenle, bu kesişim hedeflerini hiperlipidemiye karşı FP'nin hedefleri olarak tahmin edin.
2. Protein-protein etkileşim ağının oluşturulması
   1. STRING veritabanı (https://string-db.org/) 11.5'i açın. FP'nin hiperlipidemiye karşı kesişim hedefi listesini "İsim Listesi" iletişim kutusuna yapıştırın. "Organizmalar" bölümünde Homo sapiens'i seçin ve ARA > DEVAM ET'e tıklayın.
      NOT: İnsanlar ve fareler oldukça benzer genlere sahiptir. Bu nedenle, farelerle daha fazla deneysel doğrulama yapılır.
   2. Sonuçlar mevcut olduğunda, "Gelişmiş Ayarlar" da ağdaki bağlantısı kesilmiş düğümleri gizle seçeneğini işaretleyin. "Minimum gerekli etkileşim puanı"nda en yüksek güveni (0,900) ayarlayın ve ardından GÜNCELLE düğmesini tıklayın.
   3. Başlık çubuğundaki Dışa Aktarımlar'a tıklayın ve protein-protein etkileşimi (PPI) ağının kısa tablo metnini PNG ve TSV formatında indirin.
3. İlaç-bileşen-hastalık-hedef ağının oluşturulması
   1. Cytoscape 3.9.1'i açın (bkz. Adım 1.2.3'ün TSV biçimindeki dosyasını alın. Kontrol panelindeki stil çubuğu aracılığıyla ağ düğümlerinin rengini, yazı tipini ve yan tarafını optimize edin.
   2. Ağ topolojisi analizi için "Ağı Analiz Et" işlevini kullanın. Cytoscape'te CytoHubba ile hub genleri elde edin. İlaç-bileşen-hedef-hastalık ağını kurmak.
4. GO ve KEGG zenginleştirme analizi
   1. DAVID Bioinformatics Resources'ı (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp) açın. Analizi Başlat'a tıklayın ve hedef listeyi soldaki iletişim kutusuna yapıştırın. "Select Identifier" (Tanımlayıcı Seç) bölümünde OFFICIAL GENE SYMBOL (RESMİ GEN SİMGESİ) öğesini seçin. "Tür seç" bölümünde Homo sapiens'i seçin. "Liste türü" ndeki gen listesini işaretleyin. Listeyi Gönder'e tıklayın.
   2. Sonuçlar mevcut olduğunda, yukarıdaki gen listesini DAVID araçlarından biriyle analiz et'e tıklayın. GO fonksiyon zenginleştirme analizi için GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT GOTERM_MF_DIRECT "Gen Ontolojisi" nde işaretleyin. KEGG yol zenginleştirme analizi için "Pathways" (Yollar) bölümündeki KEGG_Pathway işaretleyin.
   3. Sonuçları görüntülemek için İşlevsel Ek Açıklama Grafiği'ne tıklayın.
      NOT: Zenginleştirme analizinin istatistiksel anlamlılık eşiğini p < 0,05 olarak ayarlayın.

2. Deneysel tasarım

1. FP sulu ekstrakt preparatı
   NOT: FP, TCM⁸ Chengdu Üniversitesi'nde Profesör Lina Xia'nın laboratuvarında işlenir.
   1. Kurutulmuş FP tozunu (90 g) 1 L saf suya temiz bir 2 L hacimsel şişede bekletin. 30 dakika boyunca çözünmeye yardımcı olmak için ultrasonik tedavi kullanın (4 ° C su banyosunda, güç: 250W, frekans: 35 kHz). Ekstraktı çift katmanlı, 1 mm x 1 mm steril tıbbi gazlı bezle elde etmek için çözeltiyi filtreleyin. FP'nin tamamen çözünmesini sağlamak için yukarıdaki işlemi üç kez tekrarlayın.
   2. Daha fazla konsantrasyon için döner evaporasyon yöntemini kullanın. Dönüş hızını 4 saat boyunca 60 °C sıcaklıkta 50 rpm'ye ayarlayın. Sulu ekstraktı 100 mL'ye konsantre edin.
   3. FP'nin ham ekstraktını (0,9 g/mL) eşit olarak iki parçaya (50 mL) bölün. Bir kısmı yüksek doz FP sıvısı (0.9 g / mL) olarak kullanılır. Başka bir parçaya 50 mL saf su ekleyin ve düşük doz FP sıvısı (0.45 g / mL) olarak düşünün. Uygulama için yüksek ve düşük doz FP sulu çözeltileri kullanın. Sıvıyı -20 °C'de kullanıma kadar saklayın.
2. Hayvan hazırlama
   1. 50 erkek C57BL / 6 fareyi (20 ± 2 g) oda sıcaklığında iyi havalandırılan bir odada, 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsü ve yiyecek ve saf suya serbest erişim ile barındırın.
   2. Fareleri rastgele iki gruba atayın: hiperlipidemi indüklemek için normal bir diyetle 10 fareyi ve yüksek yağlı bir diyetle 40 fareyi besleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: 8 hafta boyunca beslendikten sonra, fareler daha fazla ilaç müdahalesi için tarandı.
   3. 8. haftada, her fare yörüngesinden yaklaşık 200 μL kan çekin. Plazma örnekleri almak için kanı 4 ° C'de 5.733 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. TC ve TG seviyelerini ticari olarak temin edilebilen tahlil kitleri ile belirleyin (bakınız Malzeme Tablosu).
   4. Tedavi edilmeyen kontrol (NC) grubu olarak en normal lipit seviyelerine sahip altı fare seçin. Yüksek yağlı diyet grubu olarak önemli ölçüde daha yüksek lipit seviyesine sahip 24 fare seçin ve bunları rastgele dört gruba ayırın: yüksek yağlı diyet (HFD) grubu, düşük doz FP (FP_L) grubu, yüksek doz FP (FP_H) grubu ve pozitif kontrol (PC) grubu.
   5. FP_L ve FP_H gruplarına sırasıyla iki doz FP (düşük doz, 4.5 g / kg ve yüksek doz, 9 g / kg) ile gastrik irrigasyon uygulayın; simvastatin tabletleri ile PC grubuna gastrik irrigasyon (5 mg / kg; bakınız Malzeme Tablosu); ve NC ve HFD gruplarına 4 hafta boyunca günde bir kez aynı miktarda fizyolojik salin ile gastrik irrigasyon.
      NOT: Mevcut çalışmada tedavi için FP ve simvastatinin sulu çözeltileri kullanılmıştır.
   6. 12. haftada,% 1 pentobarbital sodyum (30 mg / kg) ile anesteziden sonra, tüm grupların farelerini kurban edin. Her farenin orbital damarından ~ 400 μL kan örnekleri toplayın.
      NOT: Farelerin ayak parmaklarını ve tabanlarını cımbızla uyarın. Reaksiyon yoksa, yeterli anesteziyi kanıtlar.
   7. Plazma örnekleri elde etmek için kanı 4 ° C'de 5.733 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve ticari olarak temin edilebilen tahlil kitleriyle TC, TG, LDL-C ve HDL-C seviyelerini belirleyin (bkz. Karaciğer dokusu örnekleri¹⁶ alın ve histopatolojik analize tabi tutun. Metabolomik analiz için kalan plazma ve karaciğer örneklerini kullanın (adım 3).
      NOT: Tüm numuneler kullanıma kadar -80 °C'de saklanır.
3. Karaciğer histopatolojik incelemesi
   1. Taze karaciğer dokularını 24 saatten fazla bir süredir% 4 paraformaldehit çözeltisi ile sabitleyin. Dokuyu fiksatiften çıkarın ve hedef dokuları bir neşterle pürüzsüzleştirin. Dokuyu ve ilgili etiketi kurutucuya yerleştirin.
   2. Bir etanol gradyanında dehidrat: 4 saat boyunca% 75 alkol, 2 saat boyunca% 85 alkol, 2 saat boyunca% 90 alkol, 1 saat boyunca% 95 alkol, 1 saat boyunca mutlak etanol, 30 dakika boyunca ksilen. Doku kasetini parafin balmumu içinde bir doku kalıbına üç yıkama için yerleştirin, her biri 30 dakika¹⁶.
   3. Balmumu ile ıslatılmış dokuları doku gömücüye koyun (bkz. Balmumu katılaşmadan önce, dokuları kurutucudan çıkarın, gömülü kutuya koyun ve ilgili etiketi takın.
   4. Balmumu bloklarını -20 °C dondurma masasında soğutun, gömülü çerçeveden çıkarın ve balmumu bloğunu kırpın.
   5. Kesilmiş balmumu bloklarını bir mikrotom kullanarak 3 μm kalınlığında kesitler halinde kesin (bkz. Bölümleri 40 °C suda yüzdürün, slaytlardan çıkarın ve 60 °C fırında pişirin. Su ve kuru balmumu ile pişirdikten sonra, çıkarın ve oda sıcaklığında saklayın.
   6. Bölümleri art arda 10 dakika boyunca ksilen I'e, 10 dakika boyunca ksilen II'ye, 10 dakika boyunca ksilen III'e, 5 dakika boyunca mutlak etanol I'e, 5 dakika boyunca mutlak etanol II'ye, 5 dakika boyunca% 75 alkole yerleştirin ve suda yıkayın¹⁶.
   7. Bölümleri 4 dakika boyunca hematoksilin boyama çözeltisi, farklılaşma için% 1 hidroklorik asit alkol çözeltisi (% 75 alkol), % 1 amonyak su çözeltisi ile maviye boyayın ve suyla yıkayın.
   8. Bölümleri 2 dakika boyunca eozin boyama çözeltisi ile lekeleyin ve suyla yıkayın.
   9. Bölümleri 200x ve 400x büyütmeli optik bir mikroskop kullanarak gözlemleyin.
4. Sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi )LC-MS) analizi
   1. FP'nin içerik tanımlaması
      NOT: Analiz, hibrid kuadrupol-orbitrap yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; bakınız Malzeme Tablosu) ile birleştirilmiş ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak gerçekleştirilir.
      1. 1 g kurutulmuş FP tozunu hassas bir şekilde ölçün ve temiz bir 50 mL hacimsel şişeye koyun.
      2. Volumetrik şişeye 25 mL% 70 metanol ekleyin ve doğru şekilde tartın. Çözünmeye yardımcı olmak için 30 dakika boyunca ultrasonik tedavi (4 ° C su banyosunda, güç: 250 W, frekans: 35 kHz) kullanın. Çözünmeden sonraki kaybı kesin olarak belirlemek için tekrar doğru bir şekilde tartın ve kaybı telafi etmek için% 70 metanol kullanın.
         NOT: Hacimsel şişenin ölçeği, özellikle 4 °C su banyosundan sonra doğru olmadığından, hacmi ölçmeyin.
      3. Tamamen karıştırmak için çalkalayın. Filtrelemek için 0,22 μm mikro gözenekli bir membran kullanın.
   2. Plazma numunesi hazırlama
      1. 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde çift hacimli (200 μL) asetonitril içine 100 μL plazmayı (adım 2.2.7) hassas bir şekilde ekleyin ve en az 30 s boyunca bir vorteks vibratörü ile vorteks edin. Tüm örnekler için bu yordamı izleyin.
      2. Tüm numuneleri 17.200 x g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra süpernatantları yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. Süpernatantları azot altında kurutun. 200 μL ekstraksiyon çözücüsü ile yeniden oluşturun (asetonitril:su = 4:1 [v/v]).
      3. Vorteks en az 30 s için yeniden yapılandırılmış çözelti ve 10 dakika boyunca ultrasonik tedavi kullanın (4 ° C su banyosunda, güç: 250 W, frekans: 35 kHz). 4 °C'de 10 dakika boyunca 17.200 x g'de santrifüj.
      4. Süpernatantları 0,22 μm filtre membranları ile filtreleyin ve analiz için 4 °C'de tutun.
   3. Karaciğer örneği hazırlama
      1. 90 mg karaciğer dokusunu (adım 2.2.7) buz gibi soğuk metanol suyunda (1:1, v/v, 1 mL) 1 dakika homojenize edin ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 21.500 x g'de santrifüj edin. Süpernatantı 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın. Tüm örnekler için bu yordamı izleyin.
      2. Aynı prosedürü izleyerek çökeltileri tekrar çıkarın ve süpernatantları yeni 1,5 mL santrifüj tüplerinde bir araya getirin. Süpernatantları azot altında kurutun. 300 μL ekstraksiyon çözücüsü ile yeniden oluşturun (metanol:su = 4:1 [v/v]).
      3. Vorteks en az 30 s için yeniden yapılandırılmış çözelti ve 10 dakika boyunca ultrasonik tedavi kullanın (4 ° C su banyosunda, güç: 250 W, frekans: 35 kHz). 4 °C'de 15 dakika boyunca 17.200 x g'de santrifüj.
      4. Süpernatantları 0,22 μm filtre membranları ile filtreleyin ve analiz için 4 °C'de tutun.
         NOT: Havuza alınmış kalite kontrol (QC) numuneleri, her plazma ve karaciğer numunesinden (altı numuneden biri) 10 μL alikot karıştırılarak hazırlanmıştır.
   4. LC-MS analiz parametreleri
      NOT: Mobil faz %0.1 formik asit (çözücü A) ve asetonitrilden (çözücü B) oluşur. Bu çözücüleri temiz bir cam şişeye aktarın ve LC-MS sistemine bağlayın.
      1. LC-MS sisteminin "giriş dosyasında" plazma örneklerinin gradyan programlarını şu şekilde ayarlayın: %1 B (0-1,5 dk), %1-%60 B (1,5-13,0 dk), %60-%99 B (13,0-20,0 dk), %99 B (20,0-25,0 dk), %99-%1 B (25,0-25,1 dk) ve %1 B'de 27 dk'ya kadar muhafaza edin.
      2. LC-MS sisteminin "giriş dosyasında" plazma numunelerinin otomatik numune alma cihazı koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: enjeksiyon hacmi, 2 μL; ve her analiz için akış hızı, 0,3 mL/dak.
      3. LC-MS sisteminin "giriş dosyasında" karaciğer örneklerinin gradyan programını şu şekilde ayarlayın: %1 B (0-1 dk), %1-%53 B (1-15 dk), %53-%70 B (15-30 dk), %70-%90 B (30-32 dk), %90-%95 B (32-40 dk), %95-%1 B (40-42 dk) ve 45 dakikaya kadar %1 B'de tutun.
      4. LC-MS sisteminin "giriş dosyasında" karaciğer örneklerinin otomatik örnekleyici koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: enjeksiyon hacmi, 5 μL; ve her analiz için akış hızı, 0,3 mL/dak.
      5. LC-MS sisteminin "MS tune dosyasında" hem plazma hem de karaciğer örneklerinin MS algılama koşullarını ayarlayın. MS edinimini hem pozitif hem de negatif iyonizasyon modlarını kullanarak gerçekleştirin.
         NOT: Isıtılmış elektrosprey iyonizasyon parametreleri aşağıdaki gibidir: püskürtme gerilimi: pozitif iyonizasyon için 3,5 kV ve negatif iyonizasyon için 3,8 kV; kılıf gazı akışı: 55 arb; yardımcı gaz akışı: 15 arb; prob ısıtıcı sıcaklığı: 300 °C; ve kılcal sıcaklık: 350 °C.
      6. Toplanan ham verileri Compound Discoverer yazılımına aktarın ve üreticinin talimatlarını izleyerek yöntem şablonunu ayarlayın (bkz.

3. Metabolomik doğrulama

NOT: Plazma ve karaciğer metabolitlerinin metabolomik profilleme verileri, moleküler özellik ekstraksiyon algoritması benimseyerek metabolik özellik ekstraksiyonunu gerçekleştirmek için Compound Discoverer yazılımına aktarılır. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: kütle sapması, 5 x 10-6; kütle aralığı, 100-1.500; sinyal-gürültü oranı (SNR) eşiği, 3; ve tutma süresi sapması, 0,05. Metabolomiklerin stabilitesini ve tekrarlanabilirliğini, QC tepe alanlarının göreceli standart sapması (RSD) ile değerlendirin.

1. LC-MS bulgularından elde edilen integral değerlerin çok değişkenli istatistiksel analizi için SIMCA-P yazılımını kullanın (bkz. Ortalama merkezli veriler ve örnek sınıfların modellenmesi için ortogonal kısmi en küçük kareler diskriminant analizini (OPLS-DA) kullanın.
2. OPLS-DA testinden sonra, potansiyel diferansiyel metabolitler olarak >1'lik projeksiyon (VIP) değerlerinde değişken öneme sahip integral ve Student'ın t-testinden <0.05'lik bir p-değeri olan metabolitleri göz önünde bulundurun.
3. İnsan Metabolomu (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG; https://www.kegg.jp/) ve MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/) dahil olmak üzere açık veritabanı kaynakları ile bozulmuş metabolitleri ve metabolik yolları tanımlayın.
4. MetaboAnalyst5.0 ve 'Wu Kong' platformu (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/) tarafından sonuç görünümlerini görselleştirin.

4. Moleküler yerleştirme

1. Seçilen FP bileşenlerinin 3B yapısını sırasıyla TCMSP veritabanından indirin. 'Kimyasal adı' arama kutusundaki bileşen adlarını arayın ve ilgili 3D yapı dosyalarını mol2 formatında indirin.
2. Anahtar hedeflerin kristal yapılarını AlphaFold Protein Yapısı Veritabanı'ndan indirin (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Arama kutusundaki hedef adlarını arayın ve ilgili kristal yapı dosyalarını pdb formatında indirin.
3. İçeriği ve hedef yapıları AutoDockTools yazılımına aktarın. Su moleküllerini silmek için Düzenle > Suyu Sil'e tıklayın. Hidrojen eklemek > Hidrojen > Düzenle'ye tıklayın. Malzemeleri 'ligand' olarak ayarlayın ve tüm hedefleri 'reseptör' olarak seçerek kör kenetlenme ^{gerçekleştirin17}.
4. Yeni geliştirilen alanı ayarlamak için "merkez" ve "boyut" un arkasındaki kutuya bir değer girin, böylece ligand ve reseptörü tamamen kuşatmayı mümkün kılar. Ligand ve reseptör dosyalarını pdbqt formatında kaydedin.
5. Moleküler yerleştirme gerçekleştirmek için AutoDock Vina'yı kullanın. "Reseptör" çubuğunu 'receptor.pdbqt' adına ve 'Ligand' çubuğunu 'ligand.pdbqt' adına ayarlayın. Reseptöre ligand bağlanması için en uygun yeri elde edin. Bağlama enerjisi değerini optimum konumda kaydedin.
   NOT: Yerleştirme işlemi Genetik Algoritma¹⁴ tarafından hesaplanmıştır. Tüm yerleştirme çalıştırma seçenekleri varsayılan değerlerdi. Yerleştirme çerçeveleri otomatik olarak en yüksekten en düşük bağlanma enerjisine doğru sıralanacaktır.
6. Görsel sistem modelini elde etmek için yerleştirme dosyalarını PILP'ye (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) aktarın. Model dosyalarını pse formatında indirin ve daha fazla görselleştirme oluşturmak için bunları PyMOL yazılımına aktarın (bkz.

5. İstatistiksel analiz

NOT: Veri analizi için SPSS istatistik yazılımını kullanın (bakınız Malzeme Tablosu). p < 0,05 değerini istatistiksel olarak anlamlı olarak düşünün.

1. Değerleri standart sapma (SD) ± araç olarak ifade edin.
2. Gruplar arasında istatistiksel anlamlılığı test etmek için tek yönlü bir ANOVA ve ardından post hoc en az anlamlı fark (LSD), Dunnett (eşit varyans durumunda) veya Dunnett'in T3'ünü (eşit olmayan varyans durumunda) gerçekleştirin.

Ağ farmakolojisi
FP'deki toplam 18 potansiyel bileşen, veritabanından ve LC-MS analizinden farmakokinetik ve farmakodinamik özelliklerine göre taranmıştır (toplam iyon kromatogramları Ek Şekil 1'de gösterilmiştir). İlgili literatür sayesinde, gallik asit içeriği diğer bileşenlerden çok daha yüksektir ve lipitlerin düşürülmesinde etkilidir ^9,11. Bu nedenle, bu bileşen de potansiyel bir bileşen olarak kabul edildi. Toplamda, FP'nin 19 bileşeni ve 134 bileşenle ilgili hedefi oluşturulmuştur. 19 bileşenin tümü Tablo 1'de gösterilmiştir. Daha ileri analizler için en temsili bileşenleri seçmek için, bu bileşenler Geleneksel Çin Tıbbı veritabanının Moleküler Mekaniği için Biyoinformatik Analiz Aracı'na (BATMAN-TCM; http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/) aktarılmıştır. İçerik-hedef-yolak-hastalık ağına göre, gallik asit, kuersetin ve beta-sitosterol gibi bazı biyoaktif bileşenler, FP'nin hiperkolesterolemi ve koroner ateroskleroz ile ilişkili en önemli bileşenleri olarak tanımlanmıştır (Ek Şekil 2). Bunlar arasında, gallik asit en çok çalışılan fenolik asitlerden biridir; FP^18'de sunulan ana biyoaktif bileşendir. Bu arada, gallik asit aynı zamanda FP'deki en yüksek içerikli bileşendir; konsantrasyonu genellikle% 1 ila% 3'tür. El-Hussainy ve ^ark.19, gallik asidin kalp hasarını sınırlayabileceğini, lipit profilini iyileştirebileceğini ve kardiyak inflamatuar belirteçleri aşağı regüle edebileceğini ortaya koymuştur. Quercetin ve beta-sitosterol içerikleri daha düşüktür, ancak bazı çalışmalar lipitleri düşürme üzerindeki etkilerini kanıtlamıştır. Quercetin, bitkilerde yaygın olarak bulunan önemli bir flavonoid olarak, antioksidan, antienflamatuar ve kardiyovasküler koruma etkileri gibi çeşitli özelliklere sahiptir²⁰. Lu ve ^ark.21, quercetin ile zenginleştirilmiş meyve suyunun, hafif hiperkolesterolemisi olan sağlıklı bireylerde TC, LDL-C ve HDL-C seviyelerini azaltabileceğini çalışmışlardır. Beta-sitosterol gelince, klinik çalışmalar bitki sterolünün hiperkolesterolemi ve kardiyovasküler hastalıkları önemli ölçüde önleyebileceğini göstermiştir^22,23. Althwab ve ^ark.24, beta-sitosterolün HFD sıçanlarında lipit profilini ve aterojenik indeksi iyileştirebileceğini kanıtlamıştır. FP'nin lipit düşürücü etkisinin bu üç bileşenle ilişkili olabileceği görülebilir.

Ek olarak, Genecards, OMIM ve TTD veritabanlarından hiperlipidemi ile ilişkili 1.552 hedef toplanmıştır. FP ile ilişkili 134 hedef hiperlipidemi ile ilişkili hedeflerle eşleştirildikten sonra, 62 hedef hiperlipidemiye karşı FP için potansiyel hedefler olarak belirlenmiştir (Şekil 2A). UniProt veritabanına göre, kesişen tüm hedefler resmi sembollerine normalleştirildi. Daha sonra, PPI ağı STRING (Şekil 2B) ve Cytoscape (Şekil 2C) tarafından inşa edilmiştir. Hesaplama yöntemlerinin puanlarını birleştirerek, ilk 10 hedef ESR1, RELA, FOS, EGFR, HIF1A, AR, CCND1, IL6, MAPK8 ve MYC idi. Ayrıntılar Ek Şekil 3'te sunulmuştur. Bu 62 hedefin tümü, metabonomik sonuçlarla bütünleşen daha ileri analizlerin temelidir.

GO ve KEGG yolakları zenginleştirme analizi ile yapıldı. Hedef sayısına göre ilk 15 yol, p değerine göre analiz için seçildi. GO zenginleştirme sonuçları, FP'nin hiperlipidemiye karşı biyolojik süreçlerinin ve moleküler fonksiyonunun esas olarak gen ekspresyonu ve protein bağlanması ile ilişkili olduğunu göstermiştir (Şekil 2D). KEGG zenginleştirmesi, FP'nin lipid metabolizması ve ateroskleroz sürecine müdahale edebileceğini kanıtladı (Şekil 2E), yani FP, lipid metabolizmasını etkileyerek hiperlipidemi rahatlatır.

FP'nin plazma lipid düzeyleri ve karaciğer indeksi üzerine etkisi
FP'nin hiperlipidemi üzerindeki gelişmiş etkisini test etmek için ilk önce TC, TG, LDL-C, HDL-C ve karaciğer indeksindeki (karaciğer ağırlığının vücut ağırlığına oranı) değişiklikler ölçüldü. NC grubuyla karşılaştırıldığında, HFD grubundaki fareler, uzun süreli HFD müdahalesinin lipid seviyelerini artırabileceğini ve hiperlipidemi indükleyebileceğini gösteren TC (p < 0.001), LDL-C (p < 0.001) ve TG (p < 0.05) plazma düzeylerinde anlamlı bir artış göstermiştir (Şekil 3).

FP sulu ekstraktı uygulandıktan sonra, FP_L ve FP_H gruplarında TC düzeyleri anlamlı olarak azaldı (p < 0.05) sırasıyla% 18.8 ve% 12.4 oranında azaldı (Şekil 3A). FP_L ve FP_H gruplarında LDL-K düzeyleri anlamlı olarak azalmıştı (p < 0.05) sırasıyla %13.7 ve %21.8 oranında azaldı (Şekil 3B). HDL-K düzeyi ile ilgili olarak, FP_H grubu HFD grubuna kıyasla anlamlı olarak (p < 0.01) 1.81'den 0.08 mmol/L± 2.6±5'e 0.16 mmol/L'ye yükselmiştir (Şekil 3C). FP müdahalesinden sonra TG düzeyi önemsiz kalmasına rağmen, HFD grubuna göre azalmıştır (Şekil 3D). Son zamanlarda yapılan çalışmalar, LDL-C/HDL-C oranı indeksinin kardiyovasküler hastalıkları öngörmede tek başına LDL-C veya HDL-K'dan daha iyi bir indeks olduğunu göstermiştir^25,26. HFD grubu ile karşılaştırıldığında, LDL-C / HDL-C oranı FP_H grubunda% 46.3 oranında anlamlı bir şekilde azalmıştır (p < 0.01), yani FP müdahalesi kötü kolesterolü azaltmış ve iyi kolesterol seviyelerini arttırmıştır. Ana yağ metabolik organı olarak, karaciğer ağırlığı farelerde yağ depolanmasını belirli bir dereceye kadar yansıtır²⁷. 12 hafta sonra, FP_L grubunda ve FP_H grubunda karaciğer indeksleri HFD grubuna göre anlamlı olarak azaldı (p < 0.01) (Şekil 3F). PC grubu ayrıca yukarıdaki göstergelerde farklı derecelerde azalma gösterdi, FP'nin statinlere benzer etkileri olduğunu ve koruyucu etkinin bir doz-yanıt ilişkisi gösterdiğini gösterdi.

Çeşitli klinik çalışmalar, bir süre ekstrakt veya tam FP aldıktan sonra, TC ve LDL-C düzeylerinin önemli ölçüde azaldığını ortaya koymuştur. Bu arada, HDL-C seviyesi, FP^28,29'un uzun süreli uygulanması üzerine dikkat çekici bir şekilde yükseltildi. Nambiar ve Shetty³⁰, FP suyunun oksitlenmiş düşük yoğunluklu lipoproteinleri azaltabileceğini ve bu nedenle ateroskleroz riskini büyük ölçüde azaltabileceğini buldu. Gopa ve ^ark.31 hiperlipidemili hastalarda FP'nin hipolipidemik etkisini değerlendirmiş ve simvastatin ile karşılaştırmışlardır. FP ile tedavi, TC, LDL-C ve TG'de önemli bir azalmaya ve simvastatininkine benzer şekilde HDL-C seviyelerinde önemli bir artışa neden olmuştur. Bu araştırmada, FP ve simvastatin de benzer terapötik etkilere sahipti ve FP'nin LDL-C düşürücü etkisi ve hepatik onarıcı etkisi simvastatinden üstündü.

Karaciğer histopatolojik gözlemi
HFD farelerde FP'nin hepatik steatoz üzerine etkisi Şekil 4'te gösterilmiştir. NC grubundaki karaciğer patolojik kesitleri düzenli hepatosit morfolojisi, açıkça tanımlanmış hücre sınırları ve belirgin yağ vakuolleri ifade etmedi (Şekil 4A, B). Karşılaştırmalı olarak, HFD grubunda kan damarlarının etrafında farklı boyutlarda yağ vakuolleri vardı ve hücre şişmesi, yağ dejenerasyonu, hücresel sınırların kaybı, hücresel kasılma ve hepatosit nekrozu ile karakterize olarak belirgin karaciğer hasarı gösterdi (Şekil 4C, D). Şekil 4E, F'de gösterildiği gibi, FP müdahalesi özellikle FP_L grubunda karaciğer steatozunu iyileştirebilir. HFD grubu ile karşılaştırıldığında, FP_H (Şekil 4G, H) ve PC grubu (Şekil 4I, J), karaciğer hücre yapısının, yağ dejenerasyonunun ve yağ vakuol azalmasının belirli bir derecede iyileşmesine sahipti. Bu, FP müdahalesinin karaciğer dokusunu HFD'ye bağlı karaciğer hasarından koruyabileceği anlamına gelir.

Metabolomik profil oluşturma
Plazma lipid düzeyi ve karaciğer histopatolojik gözlemine göre, yüksek doz FP'nin hiperlipidemi üzerinde düşük doz FP'ye göre daha iyi bir etkisi vardı. Bu nedenle, metabolizma seviyesindeki değişimlerini analiz etmek için NC, HFD ve FP_H grupları seçildi. QC örneklerinin toplam iyon kromatogramları Ek Şekil 4'te gösterilmiştir. Verilerin doğruluğunu sağlamak için, RSD değerleri% >30 olan özellikler tüm QC örneklerinden kaldırılmıştır. PCA ve iyon kromatogramları, QC örneklerinin işlem sırasında kararlı olduğunu yansıtmıştır (Ek Şekil 5). Veri ön işlemesinden sonra plazma ve karaciğerde toplam 626 ve 562 özellik belirlendi. Bunlar arasında, plazma ve karaciğerdeki sırasıyla 120 ve 124 metabolit, KEGG veritabanına dayanarak tanımlanmıştır. NC, HFD ve FP_H grupları arasındaki ayrımı araştırmak için OPLS-DA analizi kullanıldı. OPLS-DA, aynı grup örneklerinin birlikte kümelendiğini ve farklı grup örneklerinin iyi ayırt edildiğini göstermiştir (Şekil 5A, B). Bu sonuçlar, HFD ve FP müdahalelerinin belirgin metabolik varyasyonlara neden olduğunu göstermiştir.

Metabolik ayrıma katkıda bulunan potansiyel diferansiyel metabolitleri tanımlamak için, sırasıyla NC'ye karşı HFD ve HFD'ye karşı FP_H'nin OPLS-DA ve t-testi analizleri yapıldı. OPLS-DA sonuçları iyi ayırt edildi ve farklı model grupları¹⁴ arasında anlamlı farklılıklar gösterdi (Ek Şekil 6). VIP (Projeksiyonda önemli değişken) >1 ve p < 0.05'e dayanarak, plazmadaki 32 metabolit NC ve HFD grubu arasında farklılaşma gösterdi ve 72 metabolit HFD ve FP_H grubu arasında farklılaşma gösterdi. Karaciğerde, 38 metabolit NC ve HFD grubu arasında farklılaşma gösterdi ve 17 metabolit HFD ve FP_H grubu arasında farklılaşma gösterdi. Son olarak, plazma ve karaciğerde FP'yi etkileyen HFD farelerinde sırasıyla toplam 16 ve 6 metabolit, diferansiyel metabolitler olarak tanımlanmıştır (Ek Şekil 7). Bu metabolitlerle ilgili bilgiler Tablo 2'de gösterilmiştir.

Üç grup arasındaki metabolitlerdeki varyasyonu görselleştirmek için, ısı haritaları MetaboAnalyst 5.0 tarafından çizildi. HFD grubunda plazma ve karaciğerdeki diferansiyel metabolitlerin tümü değişmiş ve bunların çoğu FP grubunda tersine çevrilmiştir, bu da FP müdahalesinin metabolik bozukluğu iyileştirebileceğini göstermektedir (Şekil 5C, D). Ayrıca, HFD farelerde FP'nin metabolik yollarını keşfetmek için diferansiyel metabolitler MetaboAnalyst 5.0'a aktarıldı. p < 0.05 ve yol etkisi >0.10'a dayanarak, plazmada triptofan metabolizması anlamlı olarak etkilendi ve bu yolakla ilişkili metabolitler D-triptofan ve L-kinürenin idi (Şekil 5E). Jung ve ^ark.32 , uzamış hiperlipideminin serum kinürenin seviyelerini düşürebileceğini çalışmışlardır. Karaciğerde taurin ve hipotaurin metabolizması anlamlı olarak etkilenmiş ve ilişkili metabolit taurin idi (Şekil 5F). Taurin, hayvan vücudunda önemli ve gerekli bir amino asittir; Dong ve ^ark.33 , taurinin kan lipitlerinin hasarını hafifçe azaltabileceğini ve HFD'nin neden olduğu ateroskleroz riskini azaltabileceğini çalışmıştır. Bu araştırmada FP müdahalesi, lipid düzeylerinin azalması ile pozitif ilişkili olan L-kinürenin ve taurin içeriğini arttırmış ve FP'nin hiperlipidemiye karşı etkinliğini desteklemiştir.

Ağ farmakolojisi ve metabolomiğinin entegre analizi
Metabolomik ile birleştirilmiş entegre bir ağ farmakolojisi stratejisi, hastalık mekanizmalarını ve müdahale stratejilerini incelemede giderek daha vazgeçilmez hale gelmiştir. Ağ farmakolojisi ile metabolomik arasında sınırlı kanıtlarla ilişki olduğu tespit edilmiştir. FP'nin hiperlipidemiye karşı mekanizmasının kapsamlı bir görünümünü elde etmek için, ağ farmakolojisi ve metabolomiğine dayalı etkileşim ağları oluşturulmuştur. Diferansiyel metabolitler Cytoscape'teki MetScape eklentisine aktarıldı ve bileşik-reaksiyon-enzim-gen ağlarını toplamak için ağ farmakolojisinde tanımlanan hub genleriyle eşleşti (Şekil 6). Tablo 3'te gösterildiği gibi, plazma metabolitlerinde, L-kinürenin ve kortikosteron, lipid peroksidasyonunu katalize edebilen ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığını indükleyebilen CYP1A1 ile ilişkiliydi^34,35; Etkilenen yollar sırasıyla triptofan metabolizması ve steroid hormon biyosentezi idi. Asetilkolin AChE ile ilişkiliydi ve gliserofosfolipid metabolizmasını etkiledi. Karaciğer metabolitlerinde MGAM ve rafinoz galaktoz metabolizması ile ilişkiliydi. Birçok çalışma, rafinoz ailesi oligosakkaritlerinin alımının HFD farelerinde metabolik bozuklukları iyileştirebileceğini göstermiştir³⁶.

Ayrıca, bileşenler-hedefler-metabolitler-yollar ağı inşa edilmiştir (Şekil 7). Bileşenlerde, quercetin en fazla kenarı birbirine bağladı, bu da FP'nin quercetin'inin lipitleri düşürmede en önemli rolü oynadığını gösteriyor. Yukarıdaki entegre analiz, FP'nin hiperlipidemiye karşı temel hedeflerini, metabolitlerini ve yollarını ortaya koymuştur; bu, bu ilacın terapötik mekanizması ve klinik uygulamasının daha fazla çalışmasının temeli olabilir.

Moleküler kenetlenme
Seçilen bileşenler ve kilit hedefler arasındaki etkileşim olasılığını daha fazla araştırmak için, ligand-aktif bölge etkileşimlerini analiz etmek için moleküler yerleştirme kullanılmıştır. AutoDock Vina yazılımı (bkz. Malzeme Tablosu) moleküler yerleştirme gerçekleştirmek için kullanıldı ve ilk yerleştirme pozu puanlama fonksiyonunun sıralamasına göre çıktısı alındı. Yerleştirme sonuçları Şekil 8'de gösterilmiştir.

Entegre analizde, CYP1A1, AChE ve MGAM diferansiyel metabolitlerle ilişkiliydi; Hedefler ve metabolitler arasında köprüler kurdular. Hedef ve bileşenler arasındaki ilişkiyi doğrulamak için daha fazla moleküler yerleştirme yapıldı. CYP1A1 ile bileşen kenetlenmesinin sonuçları aşağıdaki gibidir: gallik asit, Asn-185, Tyr-187, Asn-219 ve His-500 amino asit kalıntıları yoluyla dört hidrojen bağı oluşturmuş ve amino asit kalıntısı Tyr-187 yoluyla π-π istifleme etkileşimi oluşturmuştur (Şekil 8A); quercetin, Asn-185, Asn-219 ve His-500 yoluyla üç hidrojen bağı, hidrofobik etkileşim ve Tyr-187 yoluyla π-π istifleme etkileşimi oluşturmuştur (Şekil 8B); beta-sitosterol, Arg-362, Ser-363, Leu-365 ve Arg-464 yoluyla dört hidrojen bağı ve Glu-369 ve Ile-439 yoluyla hidrofobik etkileşim oluşturmuştur (Şekil 8C). Bağlanma enerjileri sırasıyla 5.3, 7.0 ve 7.3 kcal / -mol idi. AChE ile etkileşimde, gallik asit Arg-237, Arg-238 ve Arg-480 ile hidrojen bağları ile stabilize edildi (Şekil 8D); quercetin, Arg-237 ve Phe-474 ile hidrojen bağları, Phe-157 ile hidrofobik etkileşim ve Tyr-478 ile π-π istifleme etkileşimi ile stabilize edildi (Şekil 8E); beta-sitosterol, Phe-157, Val-244, Ile-248, Phe-474, Ala477 ve TYR478 ile hidrofobik etkileşim ile stabilize edildi (Şekil 8F). Bağlanma enerjileri sırasıyla 5.0, 6.5 ve 8.0 kcal / - mol idi. MGAM ile etkileşimde gallik asit, Ile-1716, Gly-1747 ve Trp-1749 ile hidrojen bağları ve Tyr-1715 ve Trp-1749 ile hidrofobik etkileşim ile stabilize edildi (Şekil 8G); quercetin, Arg-1311, Thr-1726, Gln-1731 ve Trp-1752 ile hidrojen bağları, Arg-1730 ile hidrojen bağları ve His-1727 ile π-π istifleme ile stabilize edildi (Şekil 8H); beta-sitosterol, Pro-1159, Trp-1355, Phe-1427 ve Phe-1560 ile hidrofobik etkileşim ile stabilize edildi, Bağlanma enerjileri sırasıyla 5.9, 8.1 ve 6.9 kcal / mol idi. Etkileşimler ve bağlanma yakınlıkları hakkında ayrıntılı bilgi Tablo 4'te gösterilmiştir. Çoklu bağlanma bölgeleri ve yüksek bağlanma enerjileri, bileşenler ve protein hedefleri arasındaki yüksek afiniteleri açıklar ve bu bileşenlerin hiperlipidemi ile ilişkili hedeflere etki ederek lipitleri düşürme rolünü oynadığını doğrular.

Şekil 1: Entegre stratejinin şematik akış şeması. Hub bileşenleri ve genleri ağ farmakolojisi ile ekstrakte edildi (Bölüm 1). FP'nin hiperlipidemiye karşı diferansiyel metabolitleri plazma ve karaciğer metabolomikleri ile analiz edildi (Bölüm 2). Anahtar hedefler, metabolitler ve yollar, Bölüm 1 ve Bölüm 2'nin (Bölüm 3) entegre bir analizine dayanarak tanımlanmış ve bağlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: FP'nin hiperlipidemiye karşı etkisinin hedef taraması, ağ yapımı ve zenginleştirme analizi. (A) FP-hiperlipidemi hedeflerinin Venn diyagramı. (B) Potansiyel aktif ilaç-bileşenler-hedefler-hastalık ağı: burada belirtildiği gibi farklı renk sembolleri: hastalık (kırmızı), ilaç (mavi), bileşenler (yeşil) ve hedefler (sarı). (C) STRING tarafından PPI ağı. (D) GO yol zenginleştirme analizi. (E) KEGG yol zenginleştirme analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: HFD'ye bağlı hiperlipidemili farelerde FP'nin plazma lipid düzeyleri ve karaciğer indeksi üzerine etkisi (n = 6). (A) TC Seviyeleri. (b) LDL-C seviyeleri. (C) HDL-C seviyesi. (D) TG seviyesi. (E) LDL-C/HDL-C oranı. (F) Karaciğer indeksleri.*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. İstatistiksel olarak anlamlı farklılıklar, tek yönlü bir ANOVA kullanılarak değerlendirildi ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi veya post hoc analizi yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: HFD'ye bağlı hiperlipidemi (H&E boyama) olan farelerde FP'nin karaciğer dokusu üzerindeki etkisi. (A,B) NC grubu, (C,D) HFD grubu, (E,F) FP_L grubu, (G,H) FP_H grubu, (I,J) PC grubu (n=6). Ölçek çubuğu: (A,C,E = 200 μm; B,D,F = 50 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: OPLS-DA skor grafikleri, ısı haritaları ve diferansiyel metabolitlerin metabolik yolakları. OPLS-DA, plazma (A) ve karaciğerdeki (B) HFD farelerde FP skoru grafikleri. Plazma (C) ve karaciğerdeki (D) diferansiyel metabolitlerin ısı haritaları. Plazma (E) ve karaciğerdeki (F) diferansiyel metabolitlerin metabolik yolakları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Anahtar metabolitlerin ve hedeflerin bileşik-reaksiyon-enzim-gen ağları. Düşük dereceli düğümler kaldırıldı. Kırmızı altıgenler, mavi daireler, yuvarlak yeşil dikdörtgenler ve gri elmaslar sırasıyla aktif bileşikleri, genleri, proteinleri ve reaksiyonları temsil eder. Anahtar hedefler ve metabolitler büyütüldü. Beyaz arka plana sahip yollar plazmada önemli ölçüde düzenlenir. Gri arka plana sahip yol karaciğerde önemli ölçüde düzenlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: İçerikler-hedefler-metabolitler-yollar ağı. Renk ne kadar koyu olursa, bağlı kenarlar o kadar fazla olur, düğümü belirtmek bu ağda daha önemlidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: FP bileşenlerinin etkileşim diyagramları ve temel hedefler . (A) CYP1A1 üzerinde etkili olan gallik asit. (B) CYP1A1 üzerinde etkili olan Quercetin. (C) CYP1A1 üzerinde etkili olan beta-sitosterol. (D) AChE'ye etki eden gallik asit. (E) AChE'ye etki eden Quercetin. (F) AChE üzerinde beta-sitosteroling etkisi. (G) MGAM üzerinde etkili olan Gallik asit. (H) MGAM'a etki eden Quercetin. (I) MGAM üzerinde etkili olan beta-sitosterol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Hiperlipidemi sonucuna karşı FP'ye genel bakış. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: FP sulu ekstraktın seçilmiş bileşenleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: Üç grup arasındaki diferansiyel metabolitler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: Anahtar hedefler, metabolitler ve yollar hakkındaki bilgiler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 4: FP bileşenleri ve hedef proteinler arasındaki bağlanma bölgeleri ve etki kuvvetleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1: FP sulu ekstraktının pozitif ve negatif iyon kromatogramları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: BATMAN-TCM tarafından FP bileşen-hedef-yol-hastalık ağı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Ağ farmakolojisinde hub genlerinin frekans analizi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: Plazma ve karaciğer QC örneklerinin iyon kromatogramları. Plazma QC örneklerinin temsili pozitif (A) ve negatif (B) iyon kromatogramları. Karaciğer QC örneklerinin temsili pozitif (C) ve negatif (D) iyon kromatogramları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 5: Plazma (A) ve karaciğer (B) QC örneklerinin PCA skor grafikleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 6: Plazma (A ve B) ve karaciğer (C ve D) örneklerinin OPLS-DA skor grafikleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 7: Plazma (A) ve karaciğer (B) örneklerindeki diferansiyel metabolitlerin Venn diyagramları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Son yıllarda, hiperlipidemi insidansı oranı, esas olarak uzun süreli sağlıksız beslenme alışkanlıkları nedeniyle artmaktadır. TCM ve kimyasal bileşenleri, son yıllarda yaygın olarak çalışılan çeşitli farmakolojik aktivitelere sahiptir^37,38. FP, hem ilaç hem de gıda olarak kullanılan bir tür meyve kaynağıdır ve hiperlipidemi tedavisinde önemli bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, FP'nin hiperlipidemiye karşı potansiyel terapötik mekanizması daha fazla çalışmaya ihtiyaç duymaktadır.

Ağ farmakolojisi, ilaç polifarmakolojik etkilerini moleküler düzeyde değerlendirir ve ana mekanizmayı belirlemek için doğal ürünlerin ve proteinlerin etkileşimini öngörür³⁹. İlk adım, ilacın aktif bileşenlerini ve temel hedeflerini seçmektir. Bu araştırmada, dokuz aktif bileşen ve 62 hub geni bulundu. FP'nin hiperlipidemi üzerindeki moleküler mekanizmasını daha iyi anlamak için, ağ farmakolojisi analizine dayanarak PPI ve bileşen-hedef ağları oluşturulmuştur. Temel bileşenlerin ve hedeflerin kapsamını daraltmak için, hiperkolesterolemi ve koroner ateroskleroz ile ilgili üç temel bileşen (gallik asit, kuersetin ve beta-sitosterol) BATMAN-TCM tarafından kurulmuştur. Tüm bu bileşenler LDL-C seviyelerini azaltabilir veya HDL-C seviyelerini artırabilir, FP'nin hiperlipidemi üzerindeki spesifik etkilerini doğrulayabilir. Ayrıca KEGG zenginleştirme analizine göre FP'nin hiperlipidemi üzerindeki işlevi lipid ve ateroskleroz yolunun aktivitesi ile ilişkilidir. Bu yöntem veritabanına çok fazla bağlı olmasına ve deneysel doğrulamadan yoksun olmasına rağmen, teorik değere sahiptir ve sonraki deneysel doğrulama araştırmaları için fikirler sağlar.

Daha fazla deneysel doğrulama için, fareler hiperlipidemi indüklemek için 8 hafta boyunca yağ takviyeli bir diyetle beslendi. Sonuçlar, plazma TC, LDL-C ve TG düzeylerinin anlamlı olarak arttığını göstermiştir. HDL-K düzeyi anlamlı olarak azalmasına rağmen, LDL-K'nın HDL-K'ya oranı anlamlı olarak artmıştır. Histopatolojik gözlemler, HFD farelerinin karaciğer dokusunun ciddi şekilde hasar gördüğünü, ancak karaciğer indeksinde anlamlı bir artış olmadığını gösterdi; Vücut ağırlığındaki ve viseral ağırlıktaki değişikliklerin daha uzun sürmesi olabilir. Lipidler ve karaciğer değişiklikleri FP'nin hiperlipidemi üzerine girişim etkisini yeterince göstermiştir. Bununla birlikte, müdahale etkisinin iç mekanizması hala daha fazla araştırmaya ihtiyaç duymaktadır.

Metabolomik, metabolik hastalıkların mekanizmasını ve terapötik ilaçların etkisini araştırmayı amaçlayan potansiyel metabolitlerin ve ilgili yolakların bir listesini sağlar⁴⁰. Metabolomiklerin sonucu, numunenin türünden etkilenebilir. Bu araştırmada hiperlipideminin patojenik özellikleri göz önünde bulundurularak metabonomik analiz için plazma ve karaciğer örnekleri seçilmiştir. OPLS-DA sonuçlarına göre, NC, HFD ve FP_H gruplarının metabolitleri iyi ayırt edildi. Plazmada toplam 16 diferansiyel metabolit, karaciğerde ise 6 diferansiyel metabolit bulundu. Plazmada karaciğerden daha fazla etkilenen metabolitler vardı, bu da kanın hiperlipidemi tarafından indüklenen metabolik bozukluğun ana yeri olduğunu kanıtladı. FP müdahalesi, HFD'nin etkisi altında bu metabolitlerin değişimini tersine çevirebilir. Ayrıca, bu diferansiyel metabolitler KEGG veritabanına aktarıldı. Plazmadaki diferansiyel metabolitlerin önemli metabolik yolları triptofan metabolizmasıydı ve karaciğerde taurin ve hipotaurin metabolizmasıydı. Bu araştırmada, FP müdahalesi, triptofan metabolizmasının L-kinüreninin içeriğini ve taurin ve hipotaurin metabolizmasının taurin içeriğini arttırmıştır, bu da FP'nin metabolik bozuklukların ve hiperlipideminin olumlu ayarlanmasında etkili olabileceği anlamına gelir. Metabolomik analiz, hangi metabolitlerin hiperlipidemi veya FP müdahalesi ile ilişkili olduğunu ortaya koydu ve FP etkisinin aşağı akış mekanizmasını belirledi.

Ağ farmakolojisinin sonucunu metabolomik ile birleştirerek, bileşik-reaksiyon-enzim-gen ağlarında üç anahtar hedef (CYP1A1, AChE ve MGAM) tanımlanmıştır. Moleküler kenetlenme analizine göre, bu hedefler FP bileşenleri (gallik asit, quercetin ve beta-sitosterol) ile yüksek afiniteler gösterdi. Dört metabolit (L-kinürenin, kortikosteron, asetilkolin ve rafinoz) ve dört ilişkili yol (triptofan metabolizması, steroid hormon biyosentezi, gliserofosfolipid metabolizması ve galaktoz metabolizması) anahtar metabolitler ve metabolik yollar olarak tanımlanmıştır. Bunlar arasında, quercetin en çok hedefle ilişkiliydi ve triptofan metabolizması hem metabonomiklerde hem de entegre sonuçlarda ortaya çıktı. FP'nin hiperlipidemiye karşı terapötik etkisinde en önemli rolü oynarlar. Moleküler yerleştirme sonucu, CYP1A1, AChE ve MGAM'ın bileşenlerle yüksek afinitelere sahip olduğunu göstermiştir. Yukarıdaki sonuçlar, taranan bu hedeflerin FP'nin terapötik etkisi ile yakından ilişkili olduğunu kanıtlamaktadır.

Bu araştırmada, gallik asit, kuersetin ve beta-sitosterol, anti-hiperlipidemiye yönelik FP aktif bileşenleri olarak tanımlanmıştır ve triptofan metabolizması, HFD farelerde FP tedavisinin ana metabolik yoludur. Sonucun genel görünümü Şekil 9'da gösterilmiştir. Bu araştırma, mekanizmaların daha ileri çalışmaları için veri ve teorik destek sundu ve FP tıbbının klinik uygulaması için bir temel oluşturdu. Ayrıca, doğal gıdaların klinik uygulamada büyük umutlarla umut verici bir seçenek olabileceğini kanıtladı. Ancak, bu araştırmada hala bazı eksiklikler var. Aktif bileşenin tek başına hiperlipidemi üzerindeki terapötik etkisi doğrulanmamıştır. Ek olarak, kilit hedeflerin yolu çalışılmamıştır; Ayrıca, doğru mekanizmayı doğrulamak için daha fazla sistematik moleküler biyoloji deneyine ihtiyaç duyar.

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu araştırma, TCM Sağlık Koruma ve Rehabilitasyon Ürün Geliştirme ve İnovasyon Ekibi (2022C005) ve "Sağlığın Korunması ve Rehabilitasyonu +" nın Yeni İş Sınır Ötesi Entegrasyonu Araştırması tarafından desteklenmiştir.