Rezeke Edilen İnsan Tümör Örneklerinden Ex Vivo Organotipik Psödomiksoma Peritonei Tümör Dilimlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi

Periton yüzeylerine metastaz yapmış insan kanserlerinin üretimi, kültürü ve görselleştirilmesi için bir protokol tanımlıyoruz. Rezeke edilen tümör örnekleri bir vibratom kullanılarak kesilir ve oksijenasyon ve canlılığın artması için geçirgen ekler üzerinde kültürlenir, ardından konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak görüntüleme ve aşağı akış analizleri yapılır.

Psödomiksoma peritonei (PMP), müsinöz primer tümörün yayılması ve bunun sonucunda periton boşluğunda müsin salgılayan tümör hücrelerinin birikmesi sonucu ortaya çıkan nadir bir durumdur. PMP, apendiks, yumurtalık ve kolorektal dahil olmak üzere çeşitli kanser türlerinden kaynaklanabilir, ancak apendiks neoplazmları en yaygın etiyolojidir. PMP'nin (1) nadirliği, (2) sınırlı murin modelleri ve (3) müsinöz, asellüler histolojisi nedeniyle incelenmesi zordur. Burada sunulan yöntem, tümör mikroçevresinin (TME) bozulmadan kaldığı bir preparatta hasta kaynaklı ex vivo organotipik dilimler kullanılarak bu tümör tiplerinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine ve sorgulanmasına izin verir. Bu protokolde, ilk önce bir vibratom ve ardından uzun süreli kültür kullanarak tümör dilimlerinin hazırlanmasını tarif ediyoruz. İkincisi, tümör dilimlerinin konfokal görüntülemesini ve canlılık, kalsiyum görüntüleme ve lokal proliferasyonun fonksiyonel okumalarının nasıl izleneceğini açıklıyoruz. Kısacası, dilimler görüntüleme boyaları ile yüklenir ve konfokal mikroskop üzerine monte edilebilen bir görüntüleme odasına yerleştirilir. Hızlandırılmış videolar ve konfokal görüntüler, ilk canlılığı ve hücresel işlevselliği değerlendirmek için kullanılır. Bu prosedür aynı zamanda TME'deki translasyonel hücresel hareketi ve parakrin sinyal etkileşimlerini de araştırır. Son olarak, akış sitometri analizi için kullanılacak tümör dilimleri için bir ayrışma protokolünü tanımladık. Kantitatif akış sitometri analizi, bağışıklık manzarasında ve epitel hücre içeriğinde meydana gelen değişiklikleri belirlemek için tezgahtan başucuna terapötik testler için kullanılabilir.

Psödomiksoma peritonei (PMP^{), yılda 1} milyon kişi başına 1 insidans oranı ile nadir görülen bir sendromdur. PMP vakalarının çoğu apendiks neoplazmlarından metastazlardan kaynaklanır. Farelerin insan benzeri bir eki olmadığı göz önüne alındığında, bu tür kanserlerin modellenmesi son derece zor olmaya devam etmektedir. Primer hastalık sıklıkla cerrahi rezeksiyon ile tedavi edilebilirken, metastatik hastalık için tedavi seçenekleri sınırlıdır. Bu nedenle, bu yeni organotipik dilim modelini geliştirmenin mantığı, PMP'nin patobiyolojisini incelemektir. Bugüne kadar, sürekli olarak kültürlenebilecek apendiks organoid modelleri yoktur; Bununla birlikte, yeni bir modelin terapötik ajanların farmakolojik testleri ve immünoterapi² için yararlı olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, beyin, meme, pankreas, akciğer, yumurtalık ve diğerleri gibi diğer insan kanseri türlerinde kullanılan organotipik bir dilim kültür sistemini uyarladık ^3,4,5,6.

Apendiks neoplazmlarına ek olarak, PMP bazen yumurtalık kanserleri⁷ ve nadir durumlarda intraduktal papiller müsinöz neoplazmlar⁸ ve kolon kanseri⁹ dahil olmak üzere diğer tümör tiplerinden kaynaklanır. Ek olarak, bu tümörler yavaş büyüme eğilimindedir, hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modellerinde zayıf engraft oranları^10,11. Bu zorluklar göz önüne alındığında, PMP'nin patobiyolojisini ve bu kanser hücrelerinin periton yüzeylerine nasıl alındığını, çoğaldığını ve bağışıklık gözetiminden nasıl kaçtığını anlamaya başlamak için bu hastalığı incelemek için modeller geliştirmek için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır.

Sistemik vasküler dolaşımdan kesilirken, tümör dilimleri hücre dışı matriks, stromal hücreler, bağışıklık hücreleri, kanser hücreleri, endotel hücreleri ve sinirler dahil olmak üzere hücresel ve asellüler bileşenler içerir. Bu yarı bozulmamış mikro ortam, sadece kanser hücrelerinden oluşan 3D organoid kültürlere kıyasla benzersiz bir şekilde avantajlı olan bu hücre tiplerinin işlevsel olarak araştırılmasına izin verir¹². Organotipik dilim kültürleri bazı açılardan avantajlı olsa da, genişletilebilen 3D organoidlere kıyasla doğal olarak düşük verime dayalı bir yaklaşımdır ve çok katlı araştırma terapötik ilaç taraması için uygundur^13,14,15. PMP durumunda, PMP türevi organoidlerin güvenilir bir şekilde kurulduğunu ve sürekli olarak geçtiğini belgeleyen hiçbir rapor bulunmamaktadır¹⁶. Bu muhtemelen PMP kaynaklı tümör hücrelerinin yavaş büyüyen doğasının yanı sıra bu müsinöz tümörlerde bulunan düşük sayıda malign epitel hücresinden kaynaklanmaktadır. PMP'yi incelemek için modeller geliştirme ihtiyacı göz önüne alındığında, organotipik dilimler bu hastalığı incelemek için benzersiz bir şekilde uygundur. İnsan örneklerinden PMP'nin hazırlanması, görüntülenmesi ve analiz edilmesi için bir protokol sunuyoruz.

Tüm dokuların tanımlanması ve edinilmesi, San Diego'daki Kaliforniya Üniversitesi'nde IRB onaylı bir protokol kapsamında gerçekleştirildi.

1. Doku işleme ve kültür için insan PMP dokularının hazırlanması

1. Tümör dokularının taşınması ve mikrodiseksiyon
   1. Taşıma ve kültür ortamını hazırlayın: %10 (v/v) Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), %10 FBS, 2 mM L-Glutamin, %1 Penisilin/Streptomisin (Pen Strep) ile tamamlayın.
   2. Doku varışında ve kurumsal IRB onaylı bir protokole göre, PMP tümör dokularını tam DMEM içeren 6 cm çapında 35 kaba aktarın.
   3. Bir neşter kullanarak tümörün katı bölgelerini sıvılaştırılmış müsinden mikro-disseke edin. Dokunun katı kısımlarına gömülü müsin nodülleri kesilebilirken, tümörün tüm sıvılaşmış bölgelerini çıkarın. Herhangi bir sıvılaştırılmış müsin veya yüksek derecede müsinöz doku bölgelerini çıkarmaya ek olarak, bir neşterle kesilmesi zor olan herhangi bir dokuyu çıkarın. Doku nodüllerini kabaca 1^cm3 büyüklüğünde daha küçük parçalara ayırın.
      NOT: Müsin ve yoğun ECM'den temizlenmiş tümör nodüllerinin elde edilmesi, vibratom kullanılarak başarılı bir kesim için gerekli olacaktır. Kalite kontrol olarak, araştırma laboratuvarına gelen tümör dokusu önce bir patolog tarafından kesilir, daha sonra UCSD biyodeposu tarafından dağıtılır. Omental kekin palyatif debulizasyonuna tabi tutulan doku donörleri, yüksek bir hastalık yükü göz önüne alındığında, bu protokol için en uygun vakalardır ve bu da araştırma için artan doku mevcudiyeti kütlesinden daha fazla dilim üretimi sağlar.
      DİKKAT: İnsan dokularıyla çalışmak, Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL2) sertifikası gerektirir. BSL2 prosedürleri hakkında eğitim almak için kuruma danışın.
2. Agaroz hazırlama ve doku gömme
   1. Doku varışının aynı gününde FBS'siz PBS'de% 5'lik bir düşük erimeli agaroz çözeltisi hazırlayın. Hızlı bir şekilde kaynama eğiliminde olduğu için agaroz çözeltisine çok dikkat edin.
      NOT: Düşük erimeli agaroz, doku parçalarının gömülmesi için gereklidir. Yüksek eriyik agaroz, daha yüksek sıcaklıklarda katılaşacak ve gömülürse doku dilimlerinin yaşayabilirliğini azaltacaktır. Ek olarak, çözünme çözeltisindeki FBS, çökeltilerin oluşmasına neden olacaktır.
   2. Elde edilen mendil parçalarını sıvı olmadan 6 cm'lik tabaklara yerleştirin. 6 cm'lik tabak başına en fazla 2-3 parça yerleştirin, böylece diğer dokuları rahatsız etmeden veya dokunmadan agaroz küpleri olarak çıkarılabilirler.
   3. Sıvı% 5 agaroz çözeltisini, 1 cm3 tümör örneklerini içeren 6^cm'lik tabaklara ekleyin. Sadece örneği örtmek için yeterli agaroz ekleyin. Eklendikten sonra, gömülü dokuları 30 dakika boyunca 4 ° C'lik bir buzdolabına yerleştirin.
3. Doku örneklerinin vibratom üzerine montajı
   1. Katılaşmış agar'ı buzdolabından çıkarın ve agaroz küplerini bir neşter kullanarak dokunun genişliğinden biraz daha büyük kesin.
   2. Vibratom aşamasına süper yapıştırıcı uygulayın ve agaroz küpünü yavaşça süper yapıştırıcının üzerine yerleştirin. Tutkalın katılaşması için 1-2 dakika bekleyin. Bu noktada, dokulu agaroz küpü sahneye sabitlenmelidir.
   3. Bıçağı vibratoma sabitleyin ve doku bölümünün istenen kalınlığını ayarlayın. Konfokal mikroskopi kullanılarak optimal aşağı akış görüntülemesi için, bölümler kabaca 150 ila 250 mikron olmalıdır. Başlat düğmesine basın ve doku tamamen kesilene kadar agaroz doku bloğunun kesilmesi yoluyla dönmeye devam edin.
      NOT: Doku kesilmiyorsa veya agaroz küpünden ayrılıyorsa, dokuyu daha yüksek konsantrasyonlu bir agaroza gömmeyi düşünün ve vibratom bıçağına kesmek veya yapışmak için çok yoğun olabilecek ek doku parçalarını kesin.
4. Geçirgen uçlar üzerinde doku dilimlerinin kültürlenmesi
   1. Geçirgen membranın üstüne 2 mL tam DMEM ortamı ve altına 3 mL ekleyerek kültür için geçirgen bir kesici uç plakası hazırlayın.
   2. İnce bir boya fırçası kullanarak doku dilimlerini vibratomun kesme odasından yavaşça kaldırın ve iki ila dört dilimi tam DMEM ortamı içeren geçirgen kültür kaplarına yerleştirin. 24 saat sonra, bir pipet kullanarak ortamı aspire edin ve ortamı taze kültür ortamıyla değiştirin.
   3. Dilimleri 37 °C/%5 CO_2'de 7 güne kadar kültürleyin ve ortamı her 24 saatte bir değiştirin. Bu zaman noktasında, farmakolojik müdahale gerçekleştirmek için kültür ortamına hücre öldürme (bortezomib) ve test edilebilir kemoterapiler 5-florurasil (5-FU) için kontroller ekleyin.
   4. 7 günlük kültürlemeden sonra, ilaçla tedavi edilmeyen koşullar altında (tam DMEM) gün 0 zaman noktasına (kesimden hemen sonra) kıyasla yaklaşık% 15 -% 25'lik bir canlılık kaybı bekleyin. Kalsein (canlı) ve propidyum İyodür (ölü) gibi canlı-ölü canlılık boyalarını kullanarak canlılığı ölçün.

2. Canlı insan doku dilimlerinin konfokal görüntülenmesi

NOT: Organotipik tümör dilimleri hazırlandıktan sonra, etkili ve optimize edilmiş bir aşağı akış analizi gerçekleştirmek için doku canlılığını belirlemek önemlidir. Tümör örneklerinin 150-250 μm kalınlığında olduğu göz önüne alındığında, konfokal veya iki foton mikroskopisi, in situ çalışmaları belirlemek için geniş alan mikroskoplarına göre şiddetle tavsiye edilir. Akış sitometrisi, canlılığı ve hücresel popülasyonları belirlemek için de kullanılabilir (yöntemler aşağıdadır). Bununla birlikte, akış sitometri analizi sırasında uzamsal çözünürlük kaybolur ve tümör dilimlerini mekanik ve kimyasal yöntemlerle ayırma ihtiyacı göz önüne alındığında canlılık muhtemelen hafife alınmaktadır.

1. Reaktif hazırlama ve deney kurulumu
   1. Konfokal görüntüleme analizi için tümör dilimlerini,% 1 FBS içeren PBS içeren 12 delikli bir kabın tek bir kuyucuğuna yerleştirin. Kalsiyum görüntüleme deneyleri için, PBS yerine, dilimleri aşağıdaki gibi hazırlanmış hücre dışı kalsiyum çözeltisinde inkübe edin: 125 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl₂, 25 mM HEPES,% 0.1 BSA, pH 7.4, 3 mM glikoz, steril filtrelenmiş. Bu çözümü önceden hazırlayın ve 4 °C'de 1 aya kadar saklayın (bkz. bölüm 2.1.8).
   2. Üretici tarafından önerilen konsantrasyonları ve protokolleri takiben, doku dilimlerinin yaşayabilirliğini belirlemek için görüntüleme boyaları ile numuneleri lekeleyin (bkz. Canlılık boyasını ekledikten sonra 10 dakika-1 saat boyunca görüntü.
   3. İnkübasyondan sonra, dilimleri konfokal bir görüntüleme cihazında görüntüleme için kullanılmak üzere% 1 FBS içeren PBS içeren optik olarak berrak, cam tabanlı bir Petri kabına aktarın.
      NOT: Konfokal görüntüleme için Nikon A1R Konfokal platformu kullanılmıştır.
   4. Konfokal görüntüleme yazılımını açın. Görüntülemeye 10x'te başlayın ve XYZ görüntüleme modunu seçin. Ardından, alma ayarlarını aşağıdaki gibi yapılandırın.
      1. Aşağıdaki lazerleri açın: 488 nm ve 561 nm. Kazancı% 1'de lazer gücüyle 100'e ayarlayın. Görüntü yakalama sırasında lazer gücünü ve kazancı gerektiği gibi ayarlayın. İstenen görüntü kalitesine bağlı olarak, daha yüksek çözünürlük için 512 x 512 piksel veya 1024 x 1024 piksel seçeneğini belirleyin.
   5. Kilidi Kaldır'ı seçin ve ardından görüntülemeyi başlatmak için Tara'yı seçin.
   6. Kalsiyum görüntüleme için, doku dilimlerini ışıktan korunan 1 saat boyunca Fluo-4-ile inkübe edin. DMSO'da Fluo-4-'yi çözmek için üreticinin protokolünü takip edin. 1 saat sonra, dilimleri hücre dışı kalsiyum çözeltisi ile 3x yıkayın ve 2.1.4-2.1.5 adımlarında görüntüleme protokolünü izleyin.
   7. Fluo-4-kullanan kalsiyum görüntüleme deneyleri için XYZT'yi seçin ve edinme hızını artırmak için 561 nm lazerin seçimini kaldırın. Ek olarak, görüntüleme hızını daha da artırmak için rezonans tarayıcısını kullanın.

3. Akış sitometrisi için canlı dilimlerin ayrılması

NOT: Canlı doku dilimlerinin ayrışması, immünotipleme, canlılığın değerlendirilmesi ve farmakolojik müdahaleden sonra hücre popülasyonlarındaki değişikliklerin sorgulanması dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir. Ayrışma işlemi sırasında doku kalitesinin ve hücre canlılığının korunmasını sağlayacak adımlar atılmalıdır.

1. 1 dakika boyunca pipetleme yaparak güçlü mekanik ayrışmaya izin vermek üzere açıklığı genişletmek için 1 mL'lik pipet ucunun ucundan küçük bir parça kesin.
2. Yüksek glikozlu DMEM, %10 nazik kollajenaz/hyaluronidaz (GCH), %10 FBS ve %10 DNaseI (1 mg/mL stok) içeren 1 mL sindirim tamponunda 5-15 dakika rotasyonla 37 °C'de dilimleri inkübe edin.
   NOT: Kollajenaz / hyaluronidazın partiye bağlı değişiklikleri sıklıkla bulunur.
3. İnkübasyon sırasında 2-3 kez mekanik ayrışma kullanarak dokunun kuvvetli bir şekilde bozulmasını gerçekleştirin. Tam sindirim kanıtı için her 5 dakikada bir sindirimi gözle kontrol ettiğinizden emin olun. Gerekirse, adım 3.1.4'e geçerek enzimatik sindirimi durdurun.
4. Sindirildikten sonra, dilimleri ve sindirim ortamını 50 mL'lik bir konik tüpün üzerine yerleştirilen 70 μm'lik bir filtrenin üzerine pipetleyin. Steril forseps veya pipet kullanarak daha büyük parçalar seçin.
5. Plastik 5 mL'lik bir şırınganın künt arka ucunu kullanarak, daha büyük ayrışmamış dilimleri ezin ve% 2 FBS içeren 4 mL PBS ile yıkayın.
6. İlişkisiz hücre süpernatantını 50 mL'lik bir konik tüpte alın ve 5-10 dakika boyunca 300 x g'de döndürün. Süpernatantı çıkarın ve peleti% 2 FBS içeren 1 mL PBS ile yıkayın.
7. Numuneyi akış sitometrisine hazırlamak için, 50 μL insan Fc-bloğu içeren bloke edici tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. %2 FBS içeren 50 μL PBS'de ilgili antikorları kullanarak hücre dışı boyama yapın.
   NOT: Birçok akış sitometri sistemi vardır. Numune akış sitometrisi için hazırlandıktan sonra, cihazın çalışması için üreticinin protokolüne başvurun.

4. Canlılık ve proliferasyon analizi için canlı doku dilimleri kullanılarak farmakolojik müdahale

NOT: Organotipik tümör dilimleri hazırlandıktan sonra, ilaç testi, siRNA ve canlı doku dilimlerinin viral enfeksiyonu da dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak girişimsel yaklaşımlar gerçekleştirilebilir. Burada uyuşturucu testlerinin yanı sıra yerel proliferasyon kullanılarak canlılık analizini içeren aşağı akış fonksiyonel okumalarını tartışacağız.

1. %10 FBS, 2 mM L-Glutamin, %1 Pen Strep ile 10 mL %10 v/v tam DMEM hazırlayın.
2. Kontrol ve tedavi koşulları için Aliquot 5 mL komple ortam. Kalan 5 mL ortama, pozitif bir kontrol olarak tümör dilimlerinde hücre ölümünü indüklemek için bortezomib (2 μM) ekleyin.
   NOT: Bortezomib, yüksek konsantrasyonlarda, hücre ölümüne neden olan sitotoksik bir ilaçtır. Diğer sitotoksik ilaçlar hücre öldürme için pozitif kontrol olarak kullanılabilir.
3. Geçirgen tabakların üzerine kaplanmış iki ila dört doku dilimi kullanarak, adım 4.2'de hazırlanan ortamı yemeğe ekleyin, ayrıca adım 2.1.2'de açıklandığı gibi konfokal mikroskopi kullanılarak aşağı akış canlılığı CANLI / ÖLÜ analizi için kullanılacak ek kombinasyon terapilerini ekleyin veya sıralı olarak eşleşen dilimleri kullanarak ticari bir ışıldayan canlılık analizi kullanın.
   NOT: Sıralı dilim eşleştirme, ışıldayan canlılık testinin hücresel ATP içeriğine dayandığı göz önüne alındığında, ışıldayan canlılık analizi için gereklidir. Hücre lizisi sırasında iç kontroller kaybedildiğinden, sonuçlar canlı hücrelerin başlangıç sayısına bağlı olduğundan benzer büyüklükteki dilimler gereklidir (yani, dengesiz dilimler dengesiz sonuçlara neden olur). Kullanıcı sıralı dilimler elde etmezse, ışıldayan canlılık analizi mümkün değildir ve bu nedenle başka bir canlılık değerlendirme yöntemi gerekecektir (akış sitometrisi veya konfokal görüntüleme tabanlı canlı hücre analizi).
4. Tam DMEM içeren kültürde doku dilimlerini 2-5 gün bekletin, her gün bortezomib ve 5-FU'yu değiştirin.
5. Işıldayan canlılık analizi için, 12 delikli bir kaba 500 μL PBS ekleyin ve sırayla eşleşen doku dilimlerini bir boya fırçası kullanarak PBS çözeltisine aktarın veya bunları aktarmak için nazikçe 1 mL'lik bir pipetin emiş gücünü kullanın.
6. PBS'yi çıkarın ve hazırlanan ışıldayan canlılık analizi çözeltisini ekleyin. Reaktifin hazırlanması için kullanım kılavuzuna bakın.
7. Koşul başına 500 μL ışıldayan canlılık çözeltisi ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde yavaş bir dönüşle inkübe edin. Bir lüminesans plaka okuyucu kullanarak lüminesansı okuyun.

Kısacası, PMP'den insan tümör örnekleri IRB onaylı bir protokol altında elde edilir. Doku hazırlanır, mikro-disseke edilir ve bir vibratom kullanılarak kesilmek üzere bir agaroz kalıbında katılaşır (Şekil 1A; Video 1). Kesildikten sonra, doku dilimleri geçirgen uç membranlara yerleştirilir ve kültürlenir (Şekil 1B), bu da in situ görüntüleme tahlillerinin yanı sıra akış sitometrisi, konfokal görüntüleme analizi ve sitotoksisite testleri kullanılarak hücresel ve fonksiyonel sorgulama için kullanılabilir. İnsan PMP doku dilimlerinin kültürü ve işlenmesinin temsili bir iş akışı Şekil 1C'de gösterilmiştir. İlk görüntüleme analizi ışık mikroskobu ile yapılabilir (Şekil 2A-B). Doku dilimlerinde müsin boyanması, Periyodik asit-Schiff (PAS) boyaması (Şekil 2C) ve müsine özgü antikorlar (Şekil 2D) kullanılarak görselleştirildi. Canlılığı değerlendirmek için, farklı bölgelerden kesilen dilimler, sağlıklarını ve canlılıklarını belirlemek için kalsein ve propidyum iyodür içinde inkübe edilir (Şekil 2E-F). Çoğu hücre (kabaca% 85) yaşayabilir (kalsein +; yeşil), bazı hücreler ise ilk kesimden sonra konfokal mikroskopi ile görselleştirildiğinde ölüdür (propidium iyodür; kırmızı). Hücre dışı matris, 180 ° 'lik açısal bir konumda bir insidans beyaz ışığı kullanılarak görselleştirilebilir. Ameliyattan önce kemoterapi ile tedavi edilen tümörler genellikle daha fazla PI sinyali gösterir. Doku dilimlerinin çoğalması, dilim kültürü ortamına eklenen EdU kullanılarak izlenebilir. Tespit için, ticari bir hücre proliferasyon tahlil kiti kullanıldı ve tahlil, 72 saatlik kültürden sonra sabit dilimler üzerinde gerçekleştirildi. Kültürde aktif olarak çoğalan hücreler FITC kanalında (yeşil) ölçülebilir. Hücre çekirdekleri (DAPI), kültür sırasında çoğalmış (EdU +) hücrelerle örtüşecektir (Şekil 2G). Bu sonuçlar, tümör dilimi içindeki çoğalan hücrelerin (DAPI+ çekirdekleri) sayısını belirlemek için nicelleştirilir (Şekil 2H). Burada gösterilen sonuçlar, kültürlü dilimlerin dilim kültürü sırasında canlı ve proliferatif olduğunu göstermektedir.

İmmün hücre fonksiyonelliğini tanımlamak için canlı tümör dilimleri üzerinde Ca²⁺ görüntüleme çalışmaları yapılmıştır (Şekil 3; Video 2). Bu yaklaşım kullanılarak direkt ve parakrin sinyal mekanizmaları tanımlanabilir. Lokal immün hücreleri etiketlemek için, in situ sittoetiketleme, Fluo-4-ile birlikte CD11b-PE konjuge antikoru olan dilimlerin inkübe edilmesiyle gerçekleştirildi (Şekil 3A). Hücre içi^Ca2+ seviyelerini gösteren psödocolor ölçekli görüntüler, hücre içi^Ca2+ seviyelerinin diferansiyel seviyelerinin daha iyi görselleştirilmesine olanak tanır (Şekil 3B). Spontan aktivite izlendi ve vurgulanan (beyaz noktalı daire kutusu; Şekil 3A,B) CD11b+ immün hücre. CD11b immün hücresindeki (kırmızı) Ca²⁺ yanıtlarının ham izleri, diğer duyarlı (siyah) ve yanıt vermeyen hücrelerle (mavi) birlikte gösterilmiştir (Şekil 3F). Yanıt vermeyen hücrenin (mavi; Şekil 3F) nicelleştirilmiştir (Şekil 3G). Bu sonuçlar, canlı hücre fonksiyonel takibinin bu canlı doku dilimleme platformu kullanılarak gerçekleştirilebileceğini göstermektedir.

Akış sitometrisi kullanılarak yapılan aşağı akış analizi, immünotiplemenin yanı sıra terapötik ajanlara yanıt olarak hücresel profillerdeki değişiklikleri araştırmak için de kullanılabilir. Sonuçlar doğrudan sinyalleme veya dolaylı (parakrin) sinyalleme nedeniyle olabilir. Bir hasta tümör örneğinin PMP ile immünotiplendirilmesinin temsili sonuçları Şekil 4A'da gösterilmiştir. Tümör immüno-profili ölçüldü ve donör örnek 337'nin yüksek düzeyde M2-makrofajlara sahip olduğu bulundu (Şekil 4B). Bu sonuçlar, PMP kaynaklı doku dilimlerinin kullanılmasının, araştırmacıların hasta tümör örneklerinin benzersiz donör hücresel manzarasını sorgulamasına izin verdiğini göstermektedir. Moleküler, hücresel ve genomik manzaranın daha fazla analizi ve sorgulanması, hasta sonuçları için yararlı olabilecek bir tezgahtan başucuna terapötik yaklaşımı stratejize etmek için gereklidir.

PMP insan dokularından alınan doku dilimlerinin farmakotiplenmesi ve aşağı akış analizi, kemodirenci ve ilaç duyarlılığını ölçmek için doğrudan bir yöntemdir (Şekil 5). Sonuçlar, sitotoksisite analizi ve sitotoksik ilaç bortezomib (2 μM) ve 5-fluorourasil (5-FU; 2 μM) 'ye yanıt olarak TUNEL konfokal görüntüleme ile doğrulanan tümör dilimlerinin hücre öldürmesini göstermektedir (Şekil 5A-C). Tümör öldürme yanıtları oldukça heterojen olduğundan, tekrarlanan kemoterapinin tümör hücrelerini in vivo ve ex vivo^17,18 ablate etmek için etkisiz bir yöntem olduğu gösterildiğinden, verileri tümör derecesine ve önceki HİPEK'e göre katmanlaştırmak önemlidir. TUNEL analizine ek olarak, sıralı olarak eşleştirilen dilimler kullanılarak ışıldayan canlılık analizi yapılmıştır (Şekil 5D). Sitotoksisite testleri yapılırken sıralı olarak eşleşen tümör dilimlerinin kullanılması esastır, çünkü eşsiz dilimler güvenilmez sonuçlara yol açacaktır.

Şekil 1: Psödomiksoma peritonei ex vivo organotipik dilim kültürü platformunun temsili doku dilimleri ile şematik gösterimi. İmmünotipleme için organotipik dilim kültürlerinin hazırlanması ve apendiks kökenli psödomiksoma tümörlerinin fonksiyonel özelliklerinin araştırılması için temsili bir iş akışı. (A) Bir psödomiksoma peritonei (PMP) neoplazmından canlı monte edilmiş bir tümör nodülünün görüntüsü. Tümör nodülü, süper yapıştırıcı kullanılarak bir vibratoma sabitlenen agaroza gömülüdür. (B) Tümör dilimlerinin kesilmesinin temsili dağılımı ve trans-well kültür kabında düzenlenmesi. (C) Dilim kültürünün iş akışını ve tümör dilimlerinin sorgulanmasını temsil eden şema. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Canlı doku dilimlerinin konfokal görüntüleme ve fonksiyonel analizi. (A) Parlak alan görüntüsü Apendiks kökenli psödomiksoma peritonei olan bir hastadan kesilen temsili bir doku diliminin 2 kat büyütülmesi. (B) A. (C) PSÖDOMIKSOMA PERITONEI'li bir hastadan bir dokunun PAS boyaması bölümünde gösterilen temsili doku diliminin 10 kat büyütülmesi. Ölçek çubuğu 1 mm. (D) MUC2 antikoru (yeşil), EPCAM (kırmızı) ve DAPI (mavi) kullanılarak immünofloresan görüntüleme. Ölçek çubuğu 50 μm. (E) Donör 39'dan canlı (kalsein; yeşil) ve ölü (propidyum iyodür; kırmızı) boyaların kullanıldığı immünofloresan görüntüleme. Ölçek çubuğu 50 μm. (F) İlk doku kesimi sırasında donör 39'dan üç ayrı dilim kullanılarak canlılık analizinin ölçülmesi. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasıdır. (G) EdU (yeşil) kullanılarak proliferasyonun immünofloresan görüntülemesi. Hücre çekirdekleri DAPI (mavi) ile etiketlenir. (H) 1.000 hücre başına EdU pozitif hücre sayısının ölçülmesi. N = Donör 39'dan 3 temsili dilim. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Canlı doku dilimlerinin kalsiyum görüntülemesini kullanarak canlı hücre takibi. (A) Donör 292'den canlı bir doku diliminin yerinde sitodaması. CD11b etiketli makrofajlar kırmızı renkle gösterilmiştir. Kalsiyum görüntüleme boyası Fluo-4-(yeşil). CD11b ve Fluo-4-ile birlikte etiketlenmiş makrofaj, beyaz renkle vurgulanır. (B) Canlı doku diliminin psödorenk ölçeği (A'da gösterilmiştir). A. 100 μm gösteren Ölçek çubuğundaki gibi beyaz renkle vurgulanan makrofaj, ortalama gri değerler olarak gösterilen A. Pseudocolor ölçek çubuğuna uygulanır. (C-E) Fluo-4-'nin (C) öncesinde, sırasında (D) ve (E) kalsiyum aktivasyonundan sonra yüksek büyütmeli görüntüsü. (F) Ham izlerle gösterilen kalsiyum seviyelerinin miktarı. A-E'de vurgulanan CD11b + makrofaj kırmızı renkle vurgulanır. Yanıt vermeyen bir hücre mavi renkle vurgulanır. Diğer yanıt veren hücre izleri siyah renkle gösterilir. (G) CD11b+ makrofaj ile yanıt vermeyen bir hücre arasında gösterilen eğri altında normalleştirilmiş alanın nicelleştirilmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Psödomiksoma peritonei'den canlı insan tümör dilimlerinin immünotiplenmesi. (A) Apendiks kökenli psödomiksoma tümörlerinden immün hücre profillerinin akış sitometri karakterizasyonunu gerçekleştirmek için temsili şema. (B) Bağışıklık hücresi alt kümelerinin yüzdesi, renk kodlu ve aynı zamanda donör ortalama çubuğunun çizilmesidir. Yukarıdaki renk işaretçileri, pasta grafiklerdeki bağışıklık hücresi alt kümeleri için sağlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Organotipik dilim kültürü kullanılarak farmakolojik müdahale için temsili analiz. (A) İşlem yapılmamış dilimler (sol sütun), 5-FU (2 μM; orta sütun) veya Bortezomib (2 μM; sağ sütun) ile muamele edilmiş dilimler üzerinde TUNEL analizinden elde edilen temsili görüntülerin immünofloresansı. (B) TUNEL immünofloresansının donör 339'dan alınan TUNEL pozitif DAPI+ hücrelerinin yüzdesi olarak ölçülmesi. (C) Donör 339'dan alınan TUNEL pozitif PanCK+ hücrelerinin yüzdesi olarak TUNEL immünofloresansının ölçülmesi. (D) Ardışık olarak eşleşen 2-3 biyolojik replikadan toplanan donör 339'dan ışıldayan canlılık analizi kullanılarak ilaçla muamele edilmiş dilimlerin miktarının belirlenmesi. CTL, denetimi belirtir. Kontrol için konsantrasyon, 5-FU (2 μM) ve Bortezomib (2 μM). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Metastatik müsinöz tümör nodüllerinden canlı insan dokusu dilimlerinin kesilmesi. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2: Psödomiksoma peritonei'den canlı organotipik tümör dilimlerinin kalsiyum görüntülemesi. Saat 00:00'da Fluo-4-ile yüklü canlı bir doku diliminin konfokal görüntülerinden maksimum projeksiyonun sahte renkli görüntüleri. Ölçek çubuğu 50 μm'dir (sağ altta). Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu makalede, insan psödomiksoma peritonei (PMP) tümör örneklerini kültürlemek, sorgulamak ve analiz etmek için kullanılabilecek bir teknik açıklanmaktadır. Tümör immün mikro çevresini sorgulamak için çok sayıda aşağı akış fonksiyonel tahlili ve tezgahtan başucu testi için bir platform kullandık.

Yöntem ellerimizde oldukça verimli olsa da, bir vibratom kullanarak tümör örneklerini kesmek için biraz pratik gerektirecektir. Yani, yüksek derecede müsinöz örneklerin yanı sıra kesilemeyen iskeleleri (karın duvarı, asit, çeşitli ECM proteinleri) çıkarmak için yanlış mikrodiseke edilmiş örneklerden kaynaklanan problemlerle karşılaştık. Bu nedenle, aşırı müsini çıkarmak için PMP dokusunun mikrodiseksiyonu bu protokolün kritik bir adımıdır. Daha önce bildirildiği gibi solid nodüllü hastalarda %80 başarı oranı bildirilmiştir. Yüksek dereceli numunelerin^18'i kesmesi teknik olarak daha az zordu. Ayrıca, agarozun hazırlanması (FBS olmadan) ve agarozda dokunun katılaşması da doku dilimleri üretmek için bu protokol için önemlidir. Ek olarak, araştırmacının doku koşulları ve numunenin cerrahi parametreleri (metastazın yeri, önceden işlenmiş örnekler) ile ilgili bilgilerin farkında olması önemli olacaktır, çünkü bunlar yeni içgörülere yardımcı olacak ve potansiyel sorun giderme sorunlarının çözülmesine yardımcı olacaktır. Bu protokoldeki bir diğer kritik adım da tümör hücresi fonksiyonel analizidir. Burada, etkinliği değerlendirmek için fonksiyonel bir okuma (apoptoz, proliferasyon) ile birlikte bir epitel belirteci (sitokeratin boyaması gibi) kullanmak esastır. Bu, bu özel tümör tipinde gereklidir, çünkü birçok PMP tümörü, tümör hücreleri 18 olarak hücresel bileşimin%^10'undan daha azına sahiptir. Bu nedenle, akış sitometrisi veya konfokal görüntüleme tercih edilen analiz yöntemidir. Bununla birlikte, lüminesans bazlı görüntüleme kullanılarak yapılan yüksek verim testleri, daha yüksek tümör hücresi içeriğine sahip tümörlerde veya terapötiklerin TME üzerindeki rolünün değerlendirilmesi durumunda uygun olabilir.

Güçlü bir araç olmasına rağmen, organotipik dilim kültürünün bazı sınırlamaları vardır. Örneğin, bu tekniğin bir zorluğu, tümörler içindeki hücresel heterojenitedir. Tümör heterojenitesini hesaba katmak için, benzer tümör bölgelerinden sıralı olarak kesilmiş dilimler, tedavi ve hücre canlılığı analizi için gruplar arasında eşleştirilmelidir. Dilimlerin kesilmesi ve hazırlanması, kesilemeyen tümör iskelelerinin mikrodiseksiyonu için pratik gerektirir. Bu beceriler, deneysel önyargıları sınırlamak için doku dilimlerinin başarılı bir şekilde kesilmesi ve optimizasyonu için gereklidir. Diğer bir sınırlama ise dilim kültürü sırasında doku canlılığıdır. ^19,20 kültürlerinde beyin veya kalp dilimlerini aylarca korumak mümkün olsa da, PMP'den dilim kültürleri şu anda kültür^18'de sadece yaklaşık 1 hafta boyunca test edilmiştir, bu da kronik ilaç tedavisi ve genetik manipülasyon da dahil olmak üzere uzun vadeli deneysel araştırmaları önler. PMP dilim kültürlerinin ömrünü uzatmak için takviyeler ve büyüme faktörleri eklemek gibi kültür yöntemlerinde iyileştirmeler gerekli olabilir.

Organotipik dilim kültürü, beyin, böbrek ve karaciğer dahil olmak üzere çeşitli organları incelemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. PMP sırasında kullanılmak üzere bu tekniği benimsedik ve bize bildiğimiz kadarıyla PMP tümör mikroçevresini yarı sağlam bir preparatta inceleyen ilk model olan alternatif bir model sistemi sağladık. 3D hasta kaynaklı organoidler ve eksplant kültürleri ile birlikte, bu teknik, tedavi etkinliğini hızlı bir şekilde değerlendirmek ve yeni tedavilerin tezgahtan başucuna anında çevrilmesine izin vermek için sağlam ve esnek bir platform sunar.

Yazarlar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Yazarlar, UCSD İhtisas Kanser Destek Merkezi P30 hibesi 2P30CA023100 mikroskoplarıyla ilgili yardım için Moores Kanser Merkezi görüntüleme çekirdek tesisinden Kersi Pestonjamasp'a teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ayrıca bir JoVE yayın hibesi (JRW) ve Elisabeth ve Ad Creemers, Euske Aile Vakfı, Gastrointestinal Kanser Araştırma Fonu ve Peritoneal Metastaz Araştırma Fonu (AML) mülklerinden cömert hediyeler ile desteklenmiştir.