Lyme Hastalığının Faj Aracılı Genetik Manipülasyonu Spiroket Borrelia burgdorferi

Bakteriyofajın DNA'yı bakteri hücreleri arasında hareket ettirme yeteneği, onları bakteriyel konakçılarının genetik manipülasyonu için etkili araçlar haline getirir. Burada, Borrelia burgdorferi'nin bir bakteriyofajı olan φBB-1'i, Lyme hastalığı spiroketinin farklı suşları arasında heterolog DNA'yı dönüştürmek için indüklemek, iyileştirmek ve kullanmak için bir metodoloji sunulmaktadır.

Spiroket Borrelia burgdorferi'ye yabancı DNA'nın sokulması, neredeyse sadece elektroporasyon kullanılarak transformasyonla gerçekleştirilmiştir. Bu işlem, Lyme hastalığı spiroketinde diğer, daha iyi karakterize edilmiş Gram-negatif bakterilere göre önemli ölçüde daha düşük verimliliğe sahiptir. Transformasyonun başarı oranı, belirli geçmişlerden konsantre miktarlarda yüksek kaliteli DNA'ya sahip olmaya büyük ölçüde bağlıdır ve önemli gerinim-gerinim değişkenliğine tabidir. B. burgdorferi'ye yabancı DNA'yı (yani mekik vektörleri, floresan muhabirleri ve antibiyotik direnci belirteçleri) sokmak için alternatif yollar, Lyme hastalığı spiroketinin genetik manipülasyonu için yararlı araçların silahlandırılmasına önemli bir katkı olabilir. Bakteriyofaj, transdüksiyon adı verilen bir süreçte DNA'nın bakteriler arasındaki hareketi için doğal mekanizmalar olarak iyi tanınmıştır. Bu çalışmada, hem aynı hem de farklı genetik geçmişlere sahip B. burgdorferi hücreleri arasında DNA'yı dönüştürmek için her yerde bulunan borrelial faj φBB-1'i kullanmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Dönüştürülmüş DNA, hem borrelial DNA'yı hem de küçük mekik vektörleri şeklinde heterolog DNA'yı içerir. Bu gösterim, Lyme hastalığı spiroketinin genetik manipülasyonu için elektroporasyonun bir tamamlayıcısı olarak faj aracılı transdüksiyonun potansiyel bir kullanımını önermektedir. Bu rapor, B. burgdorferi'den faj φBB-1'in indüksiyonu ve saflaştırılması, bu fajın transdüksiyon tahlillerinde kullanımı ve potansiyel transdüktanların seçimi ve taranması için yöntemleri açıklamaktadır.

Spiroketal bakteri Borrelia burgdorferi'nin genetik manipülasyonu için araçların geliştirilmesi, Lyme^{hastalığının 1,2,3,4} doğasının anlaşılmasına ölçülemez bir değer katmıştır. B. burgdorferi, küçük bir doğrusal kromozomdan ve hem doğrusal hem de dairesel plazmidlerden oluşan alışılmadık derecede karmaşık bir genoma sahiptir ^5,6. Spontan plazmid kaybı, intragenik yeniden düzenleme (aynı organizma içinde genlerin bir plazmidden diğerine hareketi) ve yatay gen transferi (HGT, DNA'nın iki organizma arasındaki hareketi), B. burgdorferi arasında baş döndürücü miktarda genetik heterojenliğe yol açmıştır (örneğin, Schutzer ve ^ark.7'ye bakınız). Ortaya çıkan genotipler (veya "suşlar") aynı türün üyeleridir, ancak farklı memeli konakçılarına bulaşma ve enfekte etme yeteneklerini etkileyen genetik farklılıklara sahiptir ^8,9,10,11. Bu raporda, "suş" terimi, doğal olarak türetilmiş belirli bir genetik geçmişe sahip B. burgdorferi'ye atıfta bulunmak için kullanılacaktır; "klon" terimi, belirli bir amaç için veya deneysel manipülasyonun bir sonucu olarak genetik olarak değiştirilmiş bir suşu ifade etmek için kullanılacaktır.

B. burgdorferi'de kullanılabilen moleküler araç kutusu, seçilebilir belirteçleri, gen muhabirlerini, mekik vektörlerini, transpozon mutagenezini, indüklenebilir promotörleri ve karşı seçilebilir belirteçleri içerir (bir inceleme için bkz. Drektrah ve Samuels¹²). Bu metodolojilerin etkili kullanımı, heterolog (yabancı) DNA'nın ilgilenilen bir B. burgdorferi suşuna yapay olarak sokulmasını gerektirir. B. burgdorferi'de, heterolog DNA'nın tanıtılması neredeyse tamamen elektroporasyon yoluyla elde edilir; bu, bir bakteri zarını ortama sokulan küçük DNA parçalarına geçici olarak geçirgen hale getirmek için bir elektrik darbesi kullanan bir yöntemdir¹. Hücrelerin çoğunluğu (≥% 99.5) olduğu tahmin edilmektedir, ancak kalan hücreler heterolog DNA^13'ü tutma sıklığı yüksektir. DNA'yı bakterilere sokmanın en etkili yöntemlerinden biri olarak kabul edilmesine rağmen, B. burgdorferi'ye elektroporasyon sıklığı çok düşüktür (5 × 10⁴ ila 5 × 10⁶ hücrede 1 dönüştürücü arasında değişmektedir)¹³. Daha yüksek dönüşüm frekanslarına ulaşmanın önündeki engeller hem teknik hem de biyolojik gibi görünmektedir. B. burgdorferi'nin başarılı elektroporasyonunun önündeki teknik engeller, elektroremetuar hücreleri hazırlarken hem gerekli olan DNA miktarını (>10 μg) hem de spiroketlerin tam olarak doğru büyüme aşamasında (orta log, 2 ila 10 7 hücre · mL-1 ve⁷ ×× 10⁷ hücre · mL ^{− 1}) olma gereksinimini içerir^12,13. Bununla birlikte, bu teknik engellerin üstesinden gelmek biyolojik engellerden daha kolay olabilir.

Lyme hastalığı araştırmacıları, B. burgdorferi klonlarının genetik olarak manipüle edilme yetenekleri açısından iki geniş kategoriye ayrılabileceğini kabul etmektedir^13,14. Yüksek pasajlı, laboratuara uyarlanmış izolatlar genellikle kolayca dönüştürülür, ancak genellikle bulaşıcılık için gerekli olan plazmidleri kaybetmiş, fizyolojik olarak anormal bir şekilde davranmış ve bir memeli konağını enfekte edememiş veya bir kene vektörü^12,13 içinde devam edememiştir. Bu klonlar, spiroketin moleküler biyolojisini laboratuarda incelemek için yararlı olsa da, spiroketi enzootik döngünün biyolojik bağlamında incelemek için çok az değere sahiptir. Öte yandan, düşük pasajlı enfeksiyöz izolatlar, enfeksiyöz bir durumu yansıtan fizyolojik bir şekilde davranırlar ve enfeksiyöz döngüyü tamamlayabilirler, ancak genellikle heterolog ^DNA'nın girişine inatçıdır ve bu nedenle, çalışma^12,13 için manipüle edilmesi zordur. Düşük pasajlı izolatların dönüştürülmesindeki zorluk, en az iki farklı faktörle ilgilidir: (i) düşük pasajlı izolatlar, özellikle elektroporasyon için gerekli olan yüksek yoğunluklu koşullar altında, genellikle sıkıca bir araya toplanır, böylece birçok hücrenin elektrik yükünün tam olarak uygulanmasını veya ortamdaki DNA'ya erişimini engeller^13,15; ve (ii) B. burgdorferi, yüksek pasajlı izolatlarda kaybolabilecek en az iki farklı plazmid kaynaklı kısıtlama-modifikasyon (R-M) sistemini kodlar^14,16. R-M sistemleri, bakterilerin yabancı DNA'yı tanımasına ve ortadan kaldırmasına izin verecek şekilde evrimleşmiştir¹⁷. Gerçekten de, B. burgdorferi'de yapılan birkaç çalışma, DNA'nın kaynağı Escherichia coli^13,16 yerine B. burgdorferi olduğunda dönüşüm verimliliğinin arttığını göstermiştir. Ne yazık ki, B. burgdorferi'den elektroporasyon için gerekli yüksek konsantrasyonda DNA elde etmek pahalı ve zaman alıcı bir olasılıktır. Düşük pasajlı izolatların elektroporasyonu ve seçilmesi sırasında bir diğer potansiyel endişe, işlemin kritik virülansla ilişkili plazmidi kaybetmiş transformantları tercih ediyor gibi görünmesidir, lp25^14,18,19; Bu nedenle, düşük pasajlı B. burgdorferi izolatlarını elektroporasyon yoluyla genetik olarak manipüle etme eylemi, enzootik döngü²⁰ içinde biyolojik olarak ilgili analizler için uygun olmayan klonları seçebilir. Bu sorunlar göz önüne alındığında, heterolog DNA'nın yüksek pasajlı B. burgdorferi klonlarına elektrotransforme edilebileceği ve daha sonra elektroporasyon dışında bir yöntemle düşük pasajlı enfeksiyöz izolatlara aktarılabileceği bir sistem, Lyme hastalığı spiroketinde kullanılmak üzere mevcut moleküler araçların artan koleksiyonuna hoş bir katkı olabilir.

Transformasyona (çıplak DNA'nın alımı) ek olarak, bakterilerin düzenli olarak heterolog DNA'yı aldıkları iki mekanizma daha vardır: birbirleriyle doğrudan fiziksel temas halinde olan bakteriler arasındaki DNA değişimi olan konjugasyon ve bir bakteriyofaj²¹ tarafından aracılık edilen DNA değişimi olan transdüksiyon. Gerçekten de, bakteriyofajın HGT'ye aracılık etme yeteneği, bir dizi bakteri sistemi içindeki moleküler süreçleri incelemek için deneysel bir araç olarak kullanılmıştır^22,23,24. B. burgdorferi, çıplak DNA'nın alımı için doğal olarak yetkin değildir ve B. burgdorferi'nin başarılı konjugasyonu teşvik etmek için gerekli aparatı kodladığına dair çok az kanıt vardır. Bununla birlikte, önceki raporlar, B. burgdorferi^{25,26,27,28'in} ılıman bir bakteriyofajı olan φBB-1'in tanımlanmasını ve ön karakterizasyonunu tanımlamıştır. φBB-1, B. burgdorferi^25'te bulunan 30 kb'lik bir plazmid ailesini paketler; bu ailenin üyeleri cp32s olarak belirlenmiştir. B. burgdorferi suşları arasında HGT'ye katılmada φBB-1'in rolüyle tutarlı olarak, Stevenson ve ark., aksi takdirde farklı cp32'lere sahip iki suşta bulunan özdeş bir cp32 bildirmiştir, bu da bu cp32'nin bu iki suş arasında, muhtemelen transdüksiyon²⁹ yoluyla yakın zamanda paylaşıldığını düşündürmektedir. Ayrıca, aksi takdirde nispeten kararlı bir genom 30,31,32,33'te ^cp32'ler arasında HGT yoluyla önemli rekombinasyon kanıtı ^vardır. Son olarak, φBB-1'in hem cp32'leri hem de heterolog mekik vektör DNA'sını aynı suşun hücreleri arasında ve iki farklı suşun hücreleri arasında dönüştürme kabiliyeti daha önce^27,28 gösterilmiştir. Bu bulgular göz önüne alındığında, φBB-1, B. burgdorferi'nin moleküler biyolojisinin diseksiyonu için geliştirilecek başka bir araç olarak önerilmiştir.

Bu raporun amacı, B. burgdorferi'den faj φBB-1'i indüklemek ve saflaştırmak için bir yöntemi detaylandırmak, ayrıca B. burgdorferi klonları arasında bir transdüksiyon testi yapmak ve potansiyel transdüktörleri seçmek ve taramak için bir protokol sağlamaktır.

Rekombinant DNA ve BSL-2 organizmalarını kullanan tüm deneyler Quinnipiac Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. φBB-1 üretimi için B. burgdorferi kültürünün hazırlanması

1. Barbour-Stoenner-Kelly besiyerini% 6.6 ısıda inaktive edilmiş normal tavşan serumu (BSK) ile desteklenmiş olarak hazırlayın ¹⁵. 1 L 1x BSK için, Tablo 1'de listelenen bileşenleri 900 mL suda birleştirin, 1 N sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 7.6'ya ayarlayın ve 2-4 saat boyunca 4 ° C'de yavaşça karıştırın. Karıştırma tamamlandıktan sonra, gerekirse pH'ı kontrol edin ve 7.6'ya yeniden ayarlayın ve hacmi suyla 1 L'ye yükseltin. 0,22 μM'lik bir filtreden geçerek ortamı sterilize edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ≤2 ay boyunca taze kullanın veya 4 °C'de saklayın.
2. Transdüksiyon protokolüne başlamadan üç ila beş gün önce, uygun B. burgdorferi klonlarının 150 μL'sini sıkıca kapatılmış steril konik santrifüj tüplerinde 15 mL 1x BSK'ya aşılayın (bkz. B. burgdorferi klon (lar) daki heterolog DNA'nın seçimi ve bakımı için ortamı uygun konsantrasyonda antibiyotik veya antibiyotik kombinasyonu ile destekleyin (Tablo 2).
   NOT: B. burgdorferi biyogüvenlik seviye 2 organizmasıdır. Bu organizma ile çalışırken tüm uygun önlemleri alın. B. burgdorferi'nin canlı kültürleri ile tüm çalışmaları sertifikalı ve uygun şekilde dezenfekte edilmiş sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. B. burgdorferi ve organizmaların kendileri ile temas eden tüm materyalleri CDC yönergeleri^34'e dayanarak uygun şekilde imha edin.
3. Kültürler ≥5 × 10⁷ spiroket · mL−1 yoğunluğa ulaşana kadar kültürleri sallamadan 33 ° ^C'de inkübe edin, bu da yaklaşık 3-5 gün sürer.

2. B. burgdorferi kültür(ler)inin yoğunluğunu belirleyin (Samuels'ten modifiye edilmiştir)¹⁵

1. 5 × 10⁶ hücre·mL^−1'in üzerinde olması beklenen yoğunluklar için, spektroskopi kullanarak hücre yoğunluğunu belirleyin.
   1. 1 mL kültürü 1,7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın.
   2. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 ve 1.8 mM KH₂PO₄) içinde yeniden askıya alın. Tüm hücre süspansiyonunu yarı mikro UV şeffaf bir küvete aktarın.
   3. Yeniden askıya alınan numunenin optik yoğunluğunu 600 nm (A₆₀₀) dalga boyunda belirleyin. Spektrofotometreyi PBS'ye karşı sıfırlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
   4. Orijinal kültürdeki spiroketlerin konsantrasyonunu hesaplamak için·mL⁻¹ , A 600'deki optik yoğunluğu₁₀ ⁹'× 1,4 ile çarpın.
2. 5 × 10⁴ hücre · mL ⁻ 1 ve 5 × 10⁶ hücre · mL ^{− 1} arasında olması beklenen yoğunluklar için, spiroket sayısını doğrudan saymak için bir Petroff-Hausser sayma odası kullanarak hücre yoğunluğunu belirleyin ( bkz. Bu yöntem, uygun seyreltmeyi takiben daha yüksek yoğunluklar için de kullanılabilir.
   NOT: Canlı spiroketlerin görselleştirilmesi, karanlık alan kondenseri ile modifiye edilmiş bir mikroskop gerektirir.
   1. Sayım odasına 10 μL numune uygulayın ve uygun kapak camı ile örtün. 1 × 10^7'den daha yüksek yoğunluklar için, numuneyi PBS'de seyrelterek alan başına 50-100 spiroket elde edin.
   2. Karanlık alan mikroskobu kullanarak hücreleri 200x-400x büyütmede sayın. Tüm düzlemlerde 16 küçük karelik 25 grubun tüm alanını sayın.
   3. Orijinal kültürün hücreleri · mL − 1 elde etmek için seyreltme faktörü (varsa) ve 5 × ^{10 4} ile sayılan sayıyı çarpın.

3. B. burgdorferi fajının indüksiyonu φBB-1

NOT: Tüm cam eşyaları ve plastik eşyaları otoklavlama ile sterilize edin; 0,22 μM filtre ile otoklavlama veya filtreleme yoluyla tüm çözeltileri sterilize edin. Aşağıdaki adımlar 15 mL'lik hacimlere göre sunulmuştur, ancak yöntem, deneyin bireysel ihtiyaçlarına bağlı olarak daha küçük veya daha büyük hacimlere ölçeklenebilir.

1. Fajın üretileceği B. burgdorferi kültürü için (donör), 2 × 10⁸ spiroket · mL^−1'in 4 mL'sini vermek için gereken başlangıç kültürünün hacmini belirlemek için adım 2'deki her iki yöntemle hesaplanan konsantrasyonu kullanın. Bu, iyileşme aşamasında 15 mL'de 5 × 10⁷ spiroket · mL ⁻ 1 nihai konsantrasyonunu verecektir (aşağıdaki adım 3.6).
2. Adım 3.1'de hesaplanan kültür hacmini 10 dakika boyunca 6.000 x g'de santrifüj edin. Süpernatantı boşaltın ve peleti 4 mL taze BSK'da yeniden askıya alın. numuneyi, numuneyi minimum kafa boşluğu ile tutmak için mevcut en küçük steril tüpe aktarın.
3. Faj üretimini indüklemek için 4 mL'lik bir kültür hacmine dayanarak önerilen konsantrasyona (Tablo 3) uygun miktarda indükleyici ajan ekleyin. Tüpü sıkıca kapatın ve iyice karıştırın.
4. Numuneyi 2-4 saat boyunca 33 ° C'de inkübe edin.
5. Kuluçkadan sonra, numuneyi 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi 10 dakika boyunca 6.000 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı dekant.
6. Hücre peletini 15 mL'lik 1x BSK'da yeniden askıya alın.
   NOT: Fajın indüklenmesinden sonra, transdüksiyon testine devam etmenin iki farklı yolu vardır. Bu yöntemler Şekil 1'de ve adım 4 ve adım 6'da sunulmuştur.

4. Donörün indükleyici ajana maruz kalmasını takiben ko-kültür sırasında transdüksiyon (Şekil 1A)

NOT: Bu protokol yalnızca faj üreten suşun (donör) belirli bir antibiyotiğe direnci olduğunda ve dönüştürülecek suşun (alıcı) başka bir antibiyotiğe direnci olduğunda kullanılabilir.

1. Yukarıdaki adım 1'de donör suşu için açıklandığı gibi, transdüksiyon tahlillerinde alıcı olarak kullanılmak üzere bir B. burgdorferi kültürü hazırlayın. Adım 2'de olduğu gibi belirlenen yoğunluğa dayanarak, 10⁷ spiroket · mL⁻1 15 mL'lik 15 mL'lik × gereken hacmi hesaplayın.
2. Adım 4.1'de hesaplanan kültür hacmini 10 dakika boyunca 6.000 x g'de santrifüj edin. Süper natantı dekant.
3. Peleti 1 mL kültürde adım 3.6'dan (yeniden askıya alınmış faj donörü) yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan alıcıyı donörle birlikte kültüre geri ekleyin. Antibiyotik takviyesi yapmayın. Her iki kültürü de içeren toplam hacim 15 mL'dir.
4. 72-96 saat boyunca 33 ° C'de inkübe edin.
5. Adım 7'de açıklandığı gibi ko-kültürden sonra katı faz kaplaması ile transdüktanların seçimini gerçekleştirin.

5. Transdüksiyon testinde kullanılmak üzere fajı geri kazanmak için polietilen glikol (PEG) çökeltisi

NOT: Bu protokol, faj üreten suşun (donör) belirli bir antibiyotiğe karşı direnci olduğu ve dönüştürülecek suşun (alıcı) antibiyotik direncinin veya başka bir antibiyotiğe direncinin olmadığı durumlarda kullanılabilir.

1. Kültürü, adım 3.6'dan itibaren, Tablo 2'de belirtilen konsantrasyonda uygun antibiyotik ile destekleyin. Numuneyi 72-96 saat boyunca 33 ° C'de inkübe edin.
2. PEG çökeltmesi için çözümler hazırlayın.
   1. 500 mL'lik 5 M NaCl hazırlayın. Otoklavlama ile sterilize edin ve kullanmadan önce soğumaya bırakın. Oda sıcaklığında saklayın.
   2. 200 g PEG8000'i 400 mL suda çözerek 500 mL% 40 PEG hazırlayın; Çözelti iyice karışana kadar karıştırırken hafifçe ısıtın. Hacmi suyla 500 mL'ye kadar getirin. PEG8000'i tamamen çözmek ve çözeltiyi sterilize etmek için, çözeltiyi otoklav edin ve kullanmadan önce soğutun. Oda sıcaklığında saklayın.
   3. 100 mL süspansiyon ortamı hazırlayın (SM; 100 mM NaCl, 10 mM MgSO₄ ve 50 mM Tris-HCl [pH 7.5]). Otoklavlama ile sterilize edin. 4 °C'de saklayın.
3. Donör B. burgdorferi klonundan (adım 3.6'dan itibaren) fajın PEG çökeltilmesi için, 72-96 saatlik inkübasyondan sonra, numuneleri 4 ° C'de 20 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj edin.
4. Süpernatantı temiz bir 50 mL konik tüpe boşaltın; hücre peletini atın. 1 M'lik son konsantrasyona 5 M NaCl ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca yavaşça sallayın.
5. Numuneleri 8.000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı temiz bir 50 mL konik tüpe boşaltın; pelet küçük veya hiç olmayabilir. Süpernatanta% 40 PEG8000 çözeltisini% 10'luk bir nihai konsantrasyona ekleyin. İyice karıştırın ve gece boyunca 1 saatten fazla buz üzerinde ayarlayın.
   NOT: Daha uzun süreler, önemli ölçüde artmış faj geri kazanımı ile ilişkili görünmemektedir.
6. Numuneleri 8.000 x g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve faj parçacıklarını içeren herhangi bir pelet kaybetmeden mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın.
7. Pelet, şişenin kenarını yıkamak ve potansiyel faj parçacıklarını toplamak için SM'yi kullanarak minimum SM hacminde yeniden askıya alın. Önerilen oran, 10 mL orijinal süpernatan başına 400 μL SM'dir, ancak peletin boyutuna bağlı olarak, tam süspansiyon için az ya da çok SM gerekebilir.
8. Geri kazanılan faj numunesini, resüsitasyon hacmine bağlı olarak eşit miktarda kloroform ile tedavi edin. Numuneyi iyice karıştırın ve ardından 10 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın. Sulu (üst) tabakayı temiz bir tüpe çıkarın ve kalın arayüz katmanlarından herhangi birini önleyin.
   NOT: φBB-1 zarfsız bir bakteriyofajdır ve kloroform tedavisine duyarlı değildir²⁵. Bu adım, membrana bağlı herhangi bir yapıyı (yani hücreler veya blebler) daha da bozmak ve potansiyel hücresel kirleticileri öldürmek için yapılır. Kloroform uçucu bir organiktir ve sadece iyi havalandırılan bir duman davlumbazında kullanılmalıdır; kloroform içeren malzemeyi organik atık olarak atın.
9. İlk kloroform işleminden sonra geri kazanılan hacmi belirleyin ve numuneyi tekrar bu hacmin% 10'una eşit miktarda kloroform ile tedavi edin. İyice karıştırın ve 10 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın. Sulu (üst) tabakayı çıkarın, herhangi bir arayüz veya organik tabakadan kaçınmaya dikkat edin. Sulu tabakayı temiz bir tüpe aktarın.
10. Fajı hemen kullanın (adım 6'da açıklandığı gibi) veya 4 ° C'de saklayın.
    NOT: φBB-1 faj numunelerinin dondurulması önerilmez. φBB-1'in 4 ° C'deki stabilitesi titizlikle araştırılmamış olmasına rağmen, geri kazanımdan sonra 1 aya kadar 4 ° C'de saklanan örnekler transdüksiyon tahlillerinde başarıyla kullanılmıştır.

6. φBB-1'in PEG çökelmesini takiben transdüksiyon testi (Şekil 1B)

1. Yukarıdaki adım 1'de donör suşu için açıklandığı gibi, transdüksiyon tahlillerinde alıcı olarak kullanılmak üzere B. burgdorferi kültürlerini hazırlayın. Adım 2'de olduğu gibi belirlenen yoğunluğa dayanarak, 10⁷ spiroket · mL⁻1'in 15 mL'sini 15 mL'lik × için gereken alıcı kültür hacmini hesaplayın.
2. Adım 6.1'de hesaplanan kültür hacmini 10 dakika boyunca 6.000 x g'de santrifüj edin. Süpernatantı boşaltın ve peleti 14.5 mL taze BSK'da yeniden askıya alın.
3. Alıcı klonun kültürüne ≤500 μL PEG çökeltilmiş faj örneği (adım 5'ten itibaren) ekleyin. İyice karıştırın ve 72-96 saat boyunca 33 ° C'de inkübe edin.
   NOT: PEG çökelmesi sırasında geri kazanılan faj miktarı, bir dizi faktöre bağlı olarak değişebilir. Bununla birlikte, indüklenmiş B. burgdorferi suşu CA-11.2A'nın 15 mL kültüründen, 500 μL tipik olarak 50-1.000 canlı faj²⁸ içerir. Faj geri kazanım hacimleri ≥500 μL, muhtemelen SM'nin BSK'ya oranının artması nedeniyle B. burgdorferi büyümesini olumsuz yönde etkiler.
4. Transdüktanların seçimini, adım 7'de açıklandığı gibi PEG çökeltilmiş faj ile karıştırdıktan sonra katı faz kaplaması ile gerçekleştirin.

7. Transdüktörlerin seçimi

NOT: Potansiyel transdüktanların katı faz kaplaması, ilk olarak Samuels¹⁵ tarafından tanımlanan protokolün tek katmanlı bir modifikasyonu kullanılarak gerçekleştirilir. B. burgdorferi kolonileri agar içinde büyür, bu nedenle katı faz kaplama ile transdüktanların seçimi için, plakalar dökülürken numuneler ortama eklenmelidir. 96 delikli plakalarda bir seyreltme yöntemi kullanılarak transformantların seçimi için alternatif bir yöntem de daha önce³⁵ olarak tanımlanmıştır. Bu teknik, transdüktanların seçiminde de etkili olabilir, ancak bu amaç için henüz denenmemiştir.

1. Transdüktör seçimi için gerekli plaka sayısını, transdüksiyon tahlillerinden ve kaplanacak kontrollerden alınan numune sayısına göre belirleyin.
   NOT: Tipik olarak, numune başına biri kültür hacminin yaklaşık% 10'una eşdeğer ve diğeri kültürün geri kalanını içeren iki plaka dökülür. Ek olarak, donör ve alıcı olarak kullanılan faj preparatının ve / veya ebeveyn klonlarının, seçim sırasında kullanılan antibiyotik (ler) in varlığında büyümediğini bireysel olarak test etmek için negatif kontroller görevi gören plakaları dökün. En az iki ekstra plaka için kaplama malzemesi hazırlanması da önerilir. Örneğin, kaplanacak numune ve kontrol sayısı sekiz ise, 10 plaka için yeterli kaplama karışımı hazırlayın.
2. Aşağıda açıklandığı gibi kaplama için çözümler hazırlayın.
   NOT: Her plaka, kaplama için 20 mL 1,5x BSK ve 10 mL% 2,1 agarozdan (2:1 oranında) oluşan 30 mL olacaktır. Bu, son konsantrasyonları 1x BSK ve% 0.7 agaroz olan bir plaka verecektir. Örneğin, 10 plaka için, 200 mL 1.5x BSK ve 100 mL% 2.1 agarozdan oluşan toplam 300 mL'lik bir kaplama karışımı hazırlayın.
   1. Tablo 1'de 1,5x BSK için listelenen her bileşenin miktarlarını kullanarak adım 1.1'de 1x BSK için açıklandığı gibi 1,5x BSK'nın 1 L'sini hazırlayın. 1x BSK için açıklandığı gibi saklayın.
   2. Suda% 2.1 agaroz ve otoklav hazırlayın. Agaroz çözeltisini taze kullanın veya oda sıcaklığında saklayın. Oda sıcaklığında saklanırsa, kaplamadan önce tamamen eriyene kadar kapağı gevşek bir şekilde açık mikrodalga fırında pişirin.
   3. Tüm kaplama karışımına bağlı olarak uygun konsantrasyonu elde etmek için gereken antibiyotik (ler) hacmini belirleyin (Tablo 2).
      NOT: Son kaplama çözeltisinin toplam hacmi 300 mL ise, 300 mL'nin tamamının doğru nihai antibiyotik konsantrasyonuna sahip olduğundan emin olmak için 200 mL 1.5x BSK ve yeterli antibiyotik karıştırın. Transdüksiyon tahlilindeki hem donör hem de alıcı farklı antibiyotik direnci genlerine sahipse, kaplama karışımı her iki antibiyotiği de içermelidir. Donörden gelen PEG çökeltilmiş faj (adım 5'te hazırlandığı gibi) bir antibiyotik direnci belirtecini kodlarsa ve alıcıda hiç yoksa, kaplama karışımı sadece bir antibiyotik içermelidir.
3. Dökülecek plaka sayısına bağlı olarak, uygun miktarda 1,5x BSK ve antibiyotik (ler) i tüm kaplama karışımını tutacak kadar büyük steril bir şişeye aktarın. 56 °C'de bir su banyosunda ≥15 dakika boyunca dengeleyin.
4. Erimiş agarozu otoklav veya mikrodalgadan 56 ° C'lik bir su banyosunda ≥15 dakika boyunca dengeleyin.
5. Dengelemeden sonra, belirlenen miktar% 2.1 agarozu şişeye 1.5x BSK (antibiyotikli) ile ekleyin ve kaplama çözeltisini 10-15 dakika boyunca 42 ° C'de su banyosuna geri koyun.
   NOT: Daha yüksek sıcaklıklar spiroketlere zarar verebilir veya onları öldürebilir³⁶. Yukarıdaki gibi aynı su banyosunu kullanıyorsanız, denge için zamanlayıcıyı başlatmadan önce su banyosunu 42-45 ° C'ye soğutun. Kaplama çözeltisinin 42 ° C'de 20 dakikadan fazla dengelenmesine izin vermeyin, aksi takdirde plakaları dökerken katılaşmaya başlayacaktır.
6. Dengeleme sırasında, kaplanacak B. burgdorferi örneklerini hazırlayın. Kaplanacak miktarı steril 50 mL konik santrifüj tüpe aktarın (bkz.
   1. 1,5 mL'den (son 30 mL'lik plaka hacminin %<5'i) daha az bir miktar kaplanıyorsa, numuneyi yeni boruya aktarın ve kaplama sırasında kaplama karışımını doğrudan numuneye ekleyin.
   2. Daha büyük hacimler için, istenen kültür hacmini yeni tüpe aktarın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 6.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantın 100-500 μL hariç hepsini boşaltın ve geri kalanını kaplamadan önce peleti tamamen askıya almak için kullanın.
   3. Ko-kültürü takip eden kontrol plakaları için, steril 50 mL konik santrifüj tüplerine donör veya alıcı klonlarının ≥10⁷ hücrelerini ekleyin. Hacim 1,5 mL'nin üzerindeyse, peleti 7.6.2. adımda olduğu gibi santrifüj edin ve yeniden askıya alın. PEG-çökeltilmiş faj kullanılarak bir transdüksiyon testi yapılmışsa, alıcı klonuna ek olarak, faj örneğinin 100-250 μL'sini kaplama için steril bir 50 mL konik tüpe ekleyin.
7. Kaplama çözeltisi 10-15 dakika boyunca 42-45 ° C'de dengelendikten sonra, kaplama çözeltisinin 30 mL'sini uygun numune ile bir tüpe aktarın; hemen kaplama karışımını ve numuneyi etiketli bir plakaya dağıtın. Kaplanacak her numune için taze bir pipetle tekrarlayın.
8. Plakaların 15-20 dakika boyunca katılaşmasına izin verin ve% 5 CO₂ ile desteklenmiş 33 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Döküldükten sonra plakaları en az 48 saat ters çevirmeyin.
9. Alıcı klonun arka planına bağlı olarak, kolonilerin 10-21 günlük inkübasyondan sonra seçim plakalarındaki agaroz içinde görünüp görünmediğini kontrol edin. Borosilikat pipetinde sterilize pamuk tıkaçlı 5.75 kullanarak her iki antibiyotik varlığında plakada yetişen en az 5-10 koloni seçin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları uygun antibiyotik (ler) ile 1.5 mL 1x BSK'ya aşılayın.
10. Aşılanmış kolonileri, 3-5 gün boyunca adım 1.3'te olduğu gibi 33 ° C'de veya karanlık alan mikroskobu kullanarak 200x büyütmede alan başına yaklaşık 20-40 spiroket yoğunluğuna ulaşana kadar büyütün.
    NOT: Elendikten sonra (bkz. adım 8), spiroketler 0,22 μm'lik bir filtreden filtrasyonla sterilize edilmiş %60 gliserol ve %40 1x BSK karışımı ile eşit hacimli bir kültür karışımı karıştırılarak -80 °C'de uzun süreli depolama için dondurulabilir.

8. Potansiyel transdüktanların doğrulanması

NOT: Beklenen (alıcı) arka planda gerçek transdüktanları temsil ettiklerini doğrulamak için iki antibiyotik varlığında plakalar üzerinde büyüyen klonları tarayın. Bu yöntemler, polimeraz zincir reaksiyonu ile belirli bölgelerin amplifikasyonuna ve potansiyel olarak dizilenmesine dayanır. B. burgdorferi'de PCR gerçekleştirmenin ayrıntılı protokolleri ve uygulamaları başka bir yerde açıklanmıştır (yakın tarihli bir örnek için bakınız Seshu ve ^ark.37). Kullanılan suşlara göre transdüktanları taramak için kullanılan primerleri seçin. Transdüktörlerin taranmasına nasıl yaklaşılacağına dair bazı öneriler aşağıda açıklanmıştır.

1. PCR taraması için B. burgdorferi lizatlarını hazırlayın.
   NOT: Aşağıdaki protokol, PCR ile DNA'nın derhal analizi için adım 7.9'da olduğu gibi yetiştirilen kültürlenmiş hücrelerden yıkanmış B. burgdorferi lizatları üretmek için kullanılır. Bu yöntem, BSK'daki potansiyel inhibitörlerin girişimini en aza indirmek için tasarlanmıştır, ancak dizileme veya depolama için yüksek kaliteli DNA üretmek için önerilmez. Bu amaçla, toplam genom ekstraksiyonu için bir protokol veya kit kullanın (bakınız Malzeme Tablosu). Ana klonlardan (hem donör hem de alıcı suşları) lizatların da her analize dahil edilmek üzere aynı anda hazırlanması şiddetle tavsiye edilir.
   1. Adım 7.10'da olduğu gibi seçilen ve kültürlenen her potansiyel transdüktörün 500 μL'sini temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   2. Kültürleri oda sıcaklığında 8.000 x g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
   3. Süpernatantı çıkarın ve her peleti 500 μL TE (10 mM Tris Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA, pH 8.0) içinde yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 8.000 x g'da 5 dakika santrifüj.
   4. Süpernatantı çıkarın ve her peleti 50 μL PCR kalitesinde suda yeniden askıya alın. Numuneleri 10 dakika kaynatın. Kısa bir süre soğumaya bırakın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın.
   5. Her PCR için, santrifüjlü numunenin üstünden hemen 2 μL kullanın; peleti rahatsız etmekten kaçının.
2. PCR kullanarak antibiyotik direncini kodlayan spesifik genler için potansiyel transdüktanları tarayın. Transdüksiyon tahlillerinde yaygın olarak kullanılan antibiyotik direnci belirteçlerinin taranması için primerler için Tablo 4'e bakınız.
   NOT: Deneyimlerimize göre nadir olmakla birlikte, B. burgdorferi'de heterolog DNA seçimi için kullanılan aminoglikozit antibiyotiklerine spontan mutasyon meydana gelebilir.
3. Arka planın alıcınınki olduğunu doğrulamak için başka bir gerinim veya klon işaretçisi kullanarak potansiyel transdüktörleri de tarayın. Bu analizlere hem donör hem de alıcı ebeveyn klonlarını dahil edin. Kullanılan suşlara dayalı diziler ve gerinim bütünlüğünü belirlemek için bireysel laboratuvar protokollerini kullanarak gerinime özgü belirteçlerin taranması.
4. Kene vektörü veya memeli konağı içinde kullanılmak üzere veya başka bir klonla doğrudan karşılaştırmak için virülan klonlara dönüştürülmeye çalışılırsa, transdüktanların ve ana klonların tam plazmid içeriğini belirleyin. Bu, karşılaştırmalı suşunkiyle aynı plazmid içeriğini veya enzootik döngü içinde yayılım için gerekli genetik elementlerin varlığını sağlamak için yapılır, başka bir yerde açıklandığı gibi 18,19,37,38,39.

DNA'yı daha kolay dönüştürülebilir B. burgdorferi suşları veya elektrotransformasyona inatçı klonlar arasında hareket ettirmek için bakteriyofajın kullanılması, Lyme hastalığının belirleyicilerinin devam eden moleküler araştırması için başka bir aracı temsil eder. Burada tarif edilen transdüksiyon testi, potansiyel transdüktanların seçimi için bir veya iki antibiyotik kullanılarak DNA'nın ilgili klonlar arasındaki hareketini kolaylaştırmak için gerektiğinde değiştirilebilir. Hem profaj DNA'sının hem de heterolog E. coli / B. burgdorferi mekik vektörlerinin yüksek pasajlı bir CA-11.2A klonu ile hem yüksek pasajlı bir suş B31 klonu hem de düşük pasajlı virülan bir suş 297 klonu arasındaki transdüksiyonu daha önce^{gösterilmiştir 28}. Aşağıda sunulan sonuçlar, profaj DNA'sının iki yüksek pasajlı, avirulan klon arasındaki hareketini göstermektedir. Donör klonu, c1673, profaj DNA'sı 27,28 üzerinde bir kanamisin-direnç genini kodlayan bir B. burgdorferi suşu CA-11.2A klonudur. Alıcı, kromozom²⁸ üzerinde bir gentamisin-direnç belirtecini kodlayan c1706 olarak adlandırılan B. burgdorferi suşu B31'in bir klonudur. Transdüksiyon testi Şekil 1B'de gösterildiği gibi gerçekleştirilmiştir; % 5 etanol'e maruz kalan c1673'ün süpernatantlarından elde edilen PEG çökeltilmiş faj, protokolün 6. adımında açıklandığı gibi c1706 ile karıştırıldı.

Etanol maruziyetine maruz kalan c1673'ün (kanamisin'e kodlama direnci) süpernatantlarından PEG çökeltmesiyle geri kazanılan fajın yaklaşık% 20'sini c1706 (gentamisin'e karşı kodlama direnci) ile karıştırdıktan sonra, karışım her iki antibiyotiğin varlığında kaplandı; Hem kanamisin hem de gentamisin varlığında büyüyebilen koloni oluşturan birimler (CFU'lar) transdüksiyon olaylarının göstergesidir (Şekil 2)^27,28. CFU'ların sayısı, ilk alıcı hücre başına iletim frekansı olarak bildirilir. Bu temsili deneyde, fajın 1 × 10 7 alıcı hücre ile inkübasyonundan sonra yaklaşık²⁷⁵ transdüktan, alıcı hücre başına 2.75 × 10⁻⁵ CFU transdüksiyon frekansı elde edildi.

Potansiyel transdüktanların geri kazanılmasını takiben, klonların 10'unda kanamisin ve gentamisin direncini kodlayan genlerin PCR amplifikasyonu gerçekleştirildi ve Şekil 3'te iki temsili örnek gösterildi. Kanamisin direnci geni, donörden (c1673) ve potansiyel transdüktanlardan güçlendirilebilir, ancak alıcılardan (c1706) yükseltilemez. Benzer şekilde, gentamisin-direnç geni, alıcıdan (c1706) ve potansiyel transdüktan, ancak donörden değil, güçlendirilebilir. Böylece, geri kazanılan klonlar spesifik olarak hem antibiyotik direnci genlerini kodlar hem de spontan mutantları değil, transdüksiyon olaylarını temsil eder.

Kanamisin-direnç kasetinin φBB-1 tarafından donörden alıcıya dönüştürüldüğünü göstermek için, transdüktanların arka planı, daha önce açıklandığı gibi gerinim-spesifik belirteçler kullanılarak belirlendi²⁸. Bu, transdüktanlar ko-kültür transdüksiyon yöntemiyle üretilmişse özellikle önemlidir. Kısaca, daha önce yayınlanmış primerler²⁸ , çeşitli borrelial plazmidlerin belirli bölgelerini yükseltmek için kullanıldı ve klonun arka planını tanımlamak için kullanılabilecek bir profil oluşturdu (Şekil 4). CA-11.2A arka planındaki c1673 klonu, belirli amplikler 4, 5 ve 6'yı kodlarken, yüksek geçişli B31 arka planına sahip c1706 kodlamaz. Benzer şekilde, iki transdüktanda amplicons 4, 5 ve 6 eksiktir; Böylece, bu klonlar c1706 arka planına sahiptir ve c1673'ten kanamisin-direnç genini edinmişlerdir.

Tablo 1: Transdüksiyon tahlilleri için B. burgdorferi klonlarının yetiştirilmesi ve seçimi için BSK. Burada açıklanan B. burgdorferi klonlarının katı faz seçimi için B. burgdorferi ve 1.5x BSK'nın kültürlenmesi için 1x BSK'nın formülasyonu ve hazırlanması Samuels^15'e dayanmaktadır. BSK (veya MKP)37,40,41'in B. burgdorferi'nin büyümesini destekleyen farklı formülasyonları^, transdüksiyon testi kullanılarak henüz test edilmemiştir.

Tablo 2: B. burgdorferi'de heterolog DNA'nın seçimi ve sürdürülmesinde kullanılacak potansiyel antibiyotikler ve konsantrasyonlar. Bu liste, Borrelia burgdorferi^{42,43,44,45'te} yaygın olarak kullanılan mevcut antibiyotiğe dirençli belirteçlere dayanmaktadır. Kanamisin, gentamisin ve streptomisin suda hazırlanır, 0.22 μM'lik bir filtreden filtreyle sterilize edilir ve -20 ° C'de depolanır. Eritromisin% 95 etanol içinde hazırlanır ve -20 ° C'de depolanır. Birçok laboratuvar, kanamisinin 200 μg · mL⁻¹ konsantrasyonunda seçim için başarılı bir şekilde kullanıldığını bildirmektedir; Transdüksiyon tahlillerinde seçim için hem gentamisin hem de kanamisin kullanıldığında, 400 μg · mL⁻¹ kanamisin kullanılır. AadA geni hem streptomisin hem de spektinomisin^{44'e direnç kazandırır}. E'de aadA genini içeren yapıların seçimi için. coli, 100 μg·mL⁻¹ spektinomisin kullanılır. Aminoglikozitlerin (kanamisin, gentamisin ve streptomisin) Lyme hastalığının tedavisinde klinik olarak ilgili olmadığını unutmayın; Bununla birlikte, eritromisin bazı durumlarda klinik olarak kullanılır⁴⁶. B. burgdorferi'de bu antibiyotiğe karşı doğal direnç^{bildirilmiş olmasına rağmen 47}, bu direnç belirteci burada bildirilen transdüksiyon tahlillerinde şimdiye kadar kullanılmamıştır.

Tablo 3: B. burgdorferi'den φBB-1'in indüksiyonu için kullanılan potansiyel indükleyici ajanlar ve konsantrasyonlar. N-metil-N′-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), mitomisin C ve etanolün yanı sıra metanol ve izopropanolün, B. burgdorferi suşu CA.11-2A^25,26,28'de φBB-1'i kurucu seviyelerin üzerinde indüklediği gösterilmiştir. MNNG, şüpheli bir kanserojen ve çevresel tehlikedir; dikkatli kullanın, yanıcı bir çözücü içinde çözün ve bertaraf için yakın. Mitomisin C şüpheli bir kanserojen ve potansiyel çevresel tehlikedir; kimyasal bir duman davlumbazının altında dikkatli kullanın ve uygun şekilde atın. Yayınlanan veriler, MNNG'nin φBB-1^26'yı indüklemek için en etkili ajan olduğunu öne sürse de, bu kimyasalla çalışmanın tehlikeleri ve onu elde etmedeki zorluklar, özellikle öğrencilerle kullanımını karmaşık^{hale getirmektedir 48}. Etanol ile indüksiyon, metanol veya izopropanol^28'den sürekli olarak daha iyidir ve transdüksiyon testinde en yaygın olarak kullanılmıştır.

Tablo 4: Antibiyotik direnç belirteçlerinin transdüksiyonunun ön analizinde kullanılan primerler. Burada belirtilen primerler, transdüksiyon tahlillerinde yaygın olarak kullanılan antibiyotik direnci genlerinin tespiti içindir. Bu primerler PCR'de 28 döngü boyunca tekrarlanan aşağıdaki koşullarla kullanılır: 15 s için 92 ° C'de denatürasyon, 15 s için 56 ° C'de astar tavlama ve 30 s için 72 ° C'de hedef DNA uzantısı.

Şekil 1: DNA'nın faj aracılı hareketini (transdüksiyonunu) izlemek için transdüksiyon testi. Transdüksiyon testi, (A) ko-kültür yöntemi veya (B) PEG çökeltmesi ile kültür süpernatantından geri kazanılan faj kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ko-kültür yöntemi (A) için, φBB-1 (yeşil daire) tarafından dönüştürülecek DNA üzerinde bir antibiyotik direnci genini kodlayan indüklenmiş bir B. burgdorferi klonu (donör), kromozom veya diğer kararlı genetik element (kırmızı daire) üzerinde ikinci bir antibiyotik direnci genini kodlayan indüklenmemiş bir B. burgdorferi klonu (alıcı) ile kültürlenir. Bu yöntem, iki farklı antibiyotik direnci belirtecinin kullanılmasını gerektirir (bu örnekte, kanamisin ve gentamisin direncini kodlayan genler). Transdüksiyon testinde (B) saflaştırılmış fajı kullanmak için, süpernatantın indüklenen donörden PEG çökeltilmesi ile geri kazanılan faj parçacıkları alıcı ile karıştırılır. Burada iki farklı antibiyotik kullanılarak gösterilirken, bu yöntem daha önce gösterildiği gibi φBB-1 profaj DNA'sı üzerinde kodlanmış sadece bir antibiyotik direnci belirteci kullanılarak gerçekleştirilebilir²⁷. İnkübasyonu takiben, transdüktanlar her iki antibiyotik varlığında katı faz kaplama ile seçilir; Eğer B yöntemi faj DNA'sı üzerinde kodlanmış sadece bir antibiyotik direnç belirteci ile kullanılıyorsa, katı faz kaplaması sırasında sadece bu antibiyotik kullanılarak seçim yapılır. Transdüktanlar hem antibiyotik direnci belirteçleri içerecek hem de alıcının arka planına sahip olacaktır. Bu rakam Oxford University Press'in izniyle Eggers ve ^ark.28'den yeniden basılmıştır. Modellenen deneyde, c1673 ve c1650 iki farklı CA-11.2A klonunu temsil eder; c1673, kanamisin direncini kodlayan bir φBB-1 profaj taşır ve c1650, faj olmayan bir konumda 28 bir gentamisin-direnç belirtecini^kodlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Transdüksiyon testini takiben katı faz kaplaması ile seçilen koloni oluşturan birimler. Fajın c1673'ten c1706 ile karıştırılmasını takiben her iki antibiyotiğin varlığında büyüyen koloniler potansiyel transdüktanları temsil eder. Bireysel donör ve alıcı klonlarını veya bir faj hazırlığı örneğini içeren kontrol plakalarında hiçbir koloni büyümemelidir (gösterilmemiştir). Orijinal numunedeki minimum üretken faj sayısı, CFU'ların sayısının sayılması ve seyreltme faktörü ile çarpılması ile belirlenebilir. Bu durumda, donörün 15 mL'lik bir kültüründen çökeltilen faj örneğinin% 20'si yaklaşık 275 koloni vermiştir. Böylece, PEG çökelmesi ile geri kazanılan orijinal üretken faj konsantrasyonu, 10 3 viryon ≥^1.3 × idi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İki potansiyel transdüktörden kanamisin direnci ve gentamisin direnci sağlayan genlerin PCR amplifikasyonu. İki koloniden (transdüktan 1 ve transdüktan 2) üretilen lizatları taramak için kanamisin ve gentamisin-direnç genleri için primerler kullanılarak PCR (Tablo 4) yapıldı. Bu koloniler, c1673 (donör) ve c1706'nın (alıcı) karıştırılmasını takiben hem kanamisin hem de gentamisin içeren bir plaka üzerinde seçildi. Amplikonlar, 1x Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponunda 120 V'ta 60 dakika boyunca elektroforezlenmiş %1'lik bir agaroz jeli elektroforezi üzerinde çözüldü ve 0.5 μg·mL⁻¹ ethidyum bromür ile boyandı. Sayılar, boyut işaretleyicilerini kilobaz çiftleri olarak gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Transdüktörlerin arka planını doğrulama. Belirli genetik elementlerin bölgeleri, c1673, c1706 ve iki transdüktan, daha önce açıklandığı gibi,^28'den güçlendirilerek, transdüktanların arka planının alıcı klonununki olduğunu doğrulamak için c1706. Seçilen bölgeler, B. burgdorferi tipi suş B31⁶ içindeki spesifik doğrusal veya dairesel plazmidler (sırasıyla lp veya cp) üzerindeki gen dizilerine dayanıyordu. 1 = BBA60 (lp54), 2 = BBB19 (cp26), 3 = BBE22 (lp25), 4 = BBG13 (lp28-2), 5 = BBI28 (lp28-4), 6 = BBK12 (lp36), 7 = BBS41 (cp32) ve 8 = fla geni (kromozom). Amplikonlar, 1x TAE tamponunda 120 V'ta 60 dakika boyunca elektroforezlenmiş %1'lik bir agaroz jeli üzerinde çözüldü ve 0.5 μg·mL⁻¹ ethidyum bromür ile boyandı. Sayılar, boyut işaretleyicilerini kilobaz çiftleri olarak gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Transdüksiyonun kullanımı, B. burgdorferi^{1,4,13,37'nin} elektrotransformasyonu ile ilişkili biyolojik ve teknik engellerin en azından bir kısmının üstesinden gelmenin bir yöntemini temsil edebilir. Birçok sistemde, bakteriyofaj, konakçı (profaj olmayan) DNA'yı, genelleştirilmiş veya uzmanlaşmış transdüksiyon^{22,23,24,49,50} ile bakteri hücreleri arasında hareket ettirebilir. Özel transdüksiyonda, birkaç konakçı gen her zaman faj DNA'sı^49,50 ile birlikte faj kapsidinde paketlenir. Örneğin, φBB-1 her zaman cp32'nin bakteriyel kökenli kısımlarını paketler, çünkü plazmid üzerinde cp32'nin faj genomu olan kısımlarına ayrılmaz bir şekilde bağlanırlar. Genelleştirilmiş transdüksiyonda, bakteriyofajın paketleme mekanizmasının homolog faj olmayan dizilere tutunduğuna ve "yanlışlıkla" faj DNA'sı yerine rastgele konakçı DNA'sını paketlediğine inanılmaktadır; Bu DNA parçaları daha sonra^49,50 başka bir hücreye sokulabilir. B. burgdorferi'de faj tarafından genelleştirilmiş transdüksiyon hakkında henüz çok az şey bilinmektedir; Bununla birlikte, daha iyi karakterize edilmiş bakteri sistemlerinde, bir hücreden salınan bakteriyofajın% 1'i kadarı, faj DNA'sı⁵¹ yerine rastgele bakteri genleri içerebilir. Şimdiye kadar, farklı B. burgdorferi klonları arasında hiçbir kromozomal belirteçlerin transdüke edildiği gözlenmemiştir, ancak hem cp32'lerin hem de küçük heterolog mekik vektörlerinin φBB-1 tarafından paketlenip dönüştürülebileceğinin önceki gösterimi, bu fajın hem uzmanlaşmış hem de genelleştirilmiş transdüksiyon^28'e katılabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, laboratuvarda transdüksiyon için bir kullanım durumu önerilmektedir, burada kromozomal bir mutasyon üreten elektrotransformasyon hala ilgili arka planda yapılmaktadır; Bununla birlikte, transta tamamlama için mekik vektörlerinin tanıtılması veya muhabir yapılarını elektrotransformasyona inatçı suşlar halinde kullanan ekspresyon çalışmaları için tanıtılması, daha dönüştürülebilir bir yüksek pasajlı klon ve daha az dönüştürülebilir suşlar arasındaki transdüksiyon yoluyla yapılabilir. Gelecekteki çalışmalar φBB-1'in kromozomal lokusları da paketleme ve hareket ettirme yeteneğini gösterirse, burada açıklanan yöntemler, modifiye kromozomal DNA'yı daha kolay dönüştürülebilir suşlar ve aksi takdirde elektrotransforme edilmesi zor olan suşlar arasında hareket ettirmede de yararlı olabilir. cp32 benzeri plazmidler tüm B. burgdorferi suşları arasında yaygındır ve diğer Lyme hastalıklarının büyük çoğunluğu spiroketler^52,53; B. mayonii, B. miyamotoi ve tekrarlayan ateşe neden olanlar da dahil olmak üzere diğer Borrelia türlerinde homologlar için kanıtlar vardır^54,55,56. Diğer Borrelia türlerindeki homologların da profaj olup olmadığı henüz bilinmemektedir, ancak eğer öyleyse, transdüksiyon, bazıları henüz genetik olarak başarılı bir şekilde manipüle edilmemiş olan bu türlerin moleküler diseksiyonu için bir araç olabilir.

DNA'yı dönüştürmek için iki yöntem burada sunulmuştur: donör ve alıcı klonlarının seçimden önce birlikte kültürlenmesi (Şekil 1A) veya donörden PEG-çökeltici faj ve sadece bu fajın alıcıyla karıştırılması (Şekil 1B). Alıcı hücre başına transdüksiyon olaylarının sayısı, ko-kültürü takiben, PEG ile çökeltilmiş faj²⁸ kullanmaktan daha yüksektir, ancak ko-kültür, hem donörün hem de alıcının farklı antibiyotik direnci belirteçleri taşımasını ve herhangi bir potansiyel transdüktanların arka planının dikkatlice taranmasını gerektirir. φBB-1 profajı Borrelia^52,53 arasında her yerde bulunduğundan^, aktif olarak büyüyen klonları karıştırırken, bir antibiyotik direnci belirtecinin veya diğer heterolog DNA'nın alıcıdan donöre (amaçlandığı gibi donörden alıcıya değil) hareket edebileceği teorik bir şans vardır. Transdüksiyon tahlilinde PEG çökeltilmiş fajın kullanılması, donör faj / alıcı karışımında bulunmadığından bu olasılığı ortadan kaldırır. Ek olarak, faj ve genomik içeriği hem analiz (yani yapısal analiz, niceliklendirme, paketlenmiş malzemenin tanımlanması vb.) hem de transdüksiyon için kullanılacaksa, fajın PEG çökeltilmesi gereklidir. Bu avantajlara rağmen, PEG çökeltilmiş faj kullanmanın potansiyel dezavantajları vardır; ko-kültürde olduğu kadar çok transdüktör vermemenin yanı sıra, PEG çökeltisi zaman alıcı olabilir, önemli faj kaybına neden olabilir ve aşağı akış uygulamalarına müdahale edebilecek kirleticilere sahip numunelerle sonuçlanabilir^57,58.

Şimdiye kadar üç B. burgdorferi suşundan transdüksiyon gösterilmiştir: CA-11.2A, yüksek pasajlı bir B31 klonu ve düşük pasajlı 297 klon²⁸. Bu üçünden B. burgdorferi suşu CA-11.2A, indüksiyon^25,26,28'i takiben en yüksek miktarda faj üretir; Bununla birlikte, indüksiyondan sonra bile, B. burgdorferi'den kurtarılan faj sayısı, kolifaj λ^25,28,59 gibi daha iyi karakterize edilmiş sistemlerde geri kazanılan fajdan daha düşük büyüklük sırasına sahiptir. Bu nedenle, PEG çökelmesini takiben ortak kültür veya faj karışımı yoluyla transdüksiyonun kullanımında ortaya çıkabilecek bir sorun, indükleyici ajanlara maruz kalsa bile, B. burgdorferi'den salınan az sayıda bakteriyofajdır. Ek olarak, faj üretimindeki partiden partiye varyasyon, tüm koşullar, ortam bileşenleri ve yöntemler deneyler arasında tutarlı görünse bile önemlidir. Bu nedenle, belirli bir klondan veya belirli bir koşul altında en az minimum sayıda fajın üretildiğinin belirlenmesi önemlidir. Bir numunedeki faj sayısını belirlemek için yapılan geleneksel tahliller, faj içeren az miktarda numunenin, bakteriyofajın litik olduğu izin verilen bir bakteri konakçısı ile karıştırılmasını gerektirir; numunedeki üretken faj parçacıklarının sayısı, bu arka planda meydana gelen litik olayların sayısı ile belirlenir ve bu da bakterilerin bir çiminde plakların oluşmasına neden olur^60,61. Faj sayısı plak oluşturan birimler (PFU) olarak bildirilmiştir ⁶¹. Bir plak testi kullanarak indüksiyondan sonra salınan üretken φBB-1 sayısının ölçülmesi, Borrelia burgdorferi'nin yoğun bir çimde yetiştirilememesi ve φBB-1'in lizojenik ve litik replikasyon döngüleri arasındaki geçişi kontrol eden mekanizmaların mevcut anlaşılmaması nedeniyle engellenmektedir. Gerçekten de, B. burgdorferi'nin lizsed kültürlerinin anekdot raporları çok sayıda olsa da, şimdiye kadar, bütün bir kültürün parçalanmasının gözlemlenmesini faj üretimi ile ilişkilendiren yayınlanmış hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Deneyimlere göre, belirli bir kültürdeki sadece az sayıda hücre, muhtemelen lizis yoluyla kendiliğinden faj üretiyor gibi görünmektedir ve bu üretim, bilinen indükleyici ajanlara maruz kalma ile ancak mütevazı bir şekilde arttırılabilir^25,28,62. Bu nedenle, B. burgdorferi'den φBB-1'i ölçmek için bir plak testi şu anda mümkün değildir.

B. burgdorferi'nin indüksiyonunu takiben üretilen üretken faj sayısını ölçmek için, bu raporda açıklandığı gibi transdüksiyon testi, bakteriyofaj tarafından paketlenenden farklı bir antibiyotiğe sahip izin verilen bir B. burgdorferi klonu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu tahlil, transdüksiyondan kaynaklanan kolonilerle sonuçlanır ve her koloni doğrulanmış bir fajı temsil eder. Böylece, bir numunedeki minimum faj sayısı PFU yerine CFU olarak bildirilebilir. Bu sayı, muhtemelen (kullanılıyorsa), DNA'nın faj tarafından bağlanması ve enjeksiyonu ve B. burgdorferi'nin katı faz kaplaması ile fajın geri kazanılmasında bulunan verimsizlikler nedeniyle üretilen gerçek toplam faj sayısından (çok) daha düşüktür.

B. burgdorferi kültürlerinin süpernatantları içindeki toplam profaj DNA miktarını belirlemek için potansiyel bir yöntem kantitatif PCR'dir (qPCR), ancak B. burgdorferi'den cp32 DNA'sı için qPCR protokolleri literatürde iyi temsil edilmemektedir ve qPCR henüz bu amaç için yaygın olarak kullanılan bir metodoloji değildir. Belirli bir örnekte en az orta düzeyde bir faj DNA'sı olduğunu kalitatif olarak belirlemek için, toplam DNA, ekstraksiyondan önce DNaz tedavisini takiben B. burgdorferi kültürlerinin PEG çökeltilmiş süpernatantlarından ekstrakte edilebilir; Faj DNA'sı sağlam bir faj kapsid²⁵ ile korunacaktır. Geri kazanılan DNA daha sonra bir agaroz jelinde çözülür ve bir DNA lekesi ile görselleştirilir; Bu protokol tipik olarak faj kafası²⁵ içinde paketlenmiş lineer DNA'yı temsil eden soluk bir 30 kb bant verir. Lekenin hassasiyetine ve doğru boyutta faj DNA bandının bir belirtece göre yoğunluğuna bağlı olarak, geri kazanılan toplam faj sayısının yaklaşık sayısı^25,27 olarak belirlenebilir. Transdüksiyon testini takiben geri kazanılan transdüktanların sayısı ile süpernatanttan elde edilen toplam faj DNA'sı seviyelerinin güçlü bir pozitif korelasyonu daha önce²⁸ gösterilmiştir.

Donör ve alıcı suşların seçimi, transdüksiyonun moleküler bir araç olarak kullanılmasının başarısı için kritik öneme sahiptir. cp32'leri φBB-1'in bir profajı olarak anlamamız, hem Lyme hastalığı spiroketleri 52,53'teki^{cp32'lerin yaygınlığı hem de} bireysel bir B. burgdorferi hücresinin bu plazmidlerin çoklu homologlarını içerebilmesi nedeniyle karmaşıktır. Bir hücre içindeki tüm cp32'ler, incelenen faj üreten suşlardaki faj kafaları içinde paketlenmiş gibi görünmektedir²⁷. Bununla birlikte, cp32 içeren tüm B. burgdorferi suşlarının bakteriyofaj üretip üretemeyeceği açık değildir ve suşlar kullanımdan önce bu yetenek için test edilmelidir. Benzer şekilde, belirli bir suşun φBB-1 tarafından dönüştürülmesine izin veren reseptörler hakkında hiçbir şey bilinmemektedir, ancak profaj plazmidinin cins boyunca her yerde bulunması, belirli bir suşun dönüştürülebilme olasılığının yüksek olduğunu göstermektedir. Bireysel bir B. burgdorferi hücresi içinde çoklu cp32 plazmidlerinin varlığından çıkarılabileceği gibi, mevcut bir profajın varlığıyla verilen herhangi bir faj bağışıklığı⁶³ yoktur; CA.11-2A, B31 ve 297 suşları transdüksiyon tahlillerinde kullanılmıştır ve φBB-1^27,28 tarafından hem üretilir hem de dönüştürülebilir. Önceki raporlar, PEG çökeltilmiş faj²⁷ kullanılarak sadece sınırlı sayıda suşa transdüksiyonun mümkün olduğunu göstermesine rağmen, bugüne kadar test edilen tüm suşlar ko-kültür yöntemi²⁸ kullanılarak başarılı bir şekilde dönüştürülebildiği için, bu yöntemle ilgili teknik zorluklardan kaynaklanmış olabilir.

Transdüksiyon testini kullanmak için bir deney tasarlarken, donör suşunun seçimi için göz önünde bulundurulması gereken en önemli hususlar genetik arka plan, elektroporasyon yoluyla kolayca dönüştürülebilme kabiliyeti ve faj üretme kabiliyeti olmalıdır. Her suşun yüksek pasajlı klonlarının kapsamlı bir araştırması yapılmamış olmasına rağmen, CA-11.2A suşu indüksiyon yokluğunda bile tespit edilebilir seviyelerde yapısal olarak faj üretir. Benzer şekilde, tamamen sıralanmış ilk B. burgdorferi suşu olan B31'in yüksek pasajlı klonları⁵ ve moleküler çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir suş da yapısal olarak φBB-1'in tespit edilebilir miktarlarını üretir ve genellikle yüksek oranda dönüştürülebilir 1,4,25,27,37,64 . Araştırmalar başka suşlar gerektiriyorsa, bu suşun yüksek pasajlı klonlarının ilk önce elektroporasyon yoluyla bir antibiyotik direnci belirteci içeren bir plazmid sokularak dönüştürülebilirlikleri açısından test edilmeleri ve daha sonra CA-11.2A veya B31 gibi izin verilen bir alıcıyla transdüksiyon testi yapılarak dönüştürülebilme yeteneklerinin değerlendirilmesi önerilir. Benzer şekilde, bir alıcı suşunun veya klonunun transdüksiyona izin verildiğinden emin olmak için, bir antibiyotiğe karşı profaj kodlama direnci taşıyan CA-11.2A gibi bir faj üreten suş, transdüksiyonun gerçekleşmesini sağlamak için ilgili klonla karıştırılabilir.

φBB-1'in moleküler biyolojisi ve B. burgdorferi içindeki HGT'deki rolü hakkında, özellikle de enzootik döngüyü geçerken anlaşılması gereken çok şey var. Bununla birlikte, φBB-1'in laboratuvar içinde hem faj hem de heterolog DNA'yı deneysel olarak dönüştürme yeteneği, B. burgdorferi'nin moleküler diseksiyonu ve Lyme hastalığının patogenezindeki rolü için başka bir araç ekleme fırsatı sunmaktadır.

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Yazar, yararlı tartışmaları için Shawna Reed, D. Scott Samuels ve Patrick Secor'a ve teknik yardımları için Vareeon (Pam) Chonweerawong'a teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma, Biyomedikal Bilimler Bölümü ve Quinnipiac Üniversitesi Sağlık Bilimleri Fakültesi'nden Christian H. Eggers'a fakülte araştırma hibeleri ile desteklenmiştir.