Фаго-опосредованная генетическая манипуляция болезнью Лайма Spirochete Borrelia burgdorferi

Способность бактериофага перемещать ДНК между бактериальными клетками делает их эффективными инструментами для генетических манипуляций с их бактериальными хозяевами. Здесь представлена методология индуцирования, восстановления и использования φBB-1, бактериофага Borrelia burgdorferi, для трансдукции гетерологичной ДНК между различными штаммами спирохеты болезни Лайма.

Введение чужеродной ДНК в спирохету Borrelia burgdorferi было почти исключительно осуществлено путем трансформации с использованием электропорации. Этот процесс имеет заметно более низкую эффективность спирохеты болезни Лайма по сравнению с другими, лучше охарактеризованными грамотрицательными бактериями. Скорость успеха трансформации в значительной степени зависит от наличия концентрированных количеств высококачественной ДНК из определенных фонов и подвержена значительной изменчивости от штамма к штамму. Альтернативные средства для введения чужеродной ДНК (т.е. челночных векторов, флуоресцентных репортеров и маркеров устойчивости к антибиотикам) в B. burgdorferi могут стать важным дополнением к арсеналу полезных инструментов для генетической манипуляции спирохетой болезни Лайма. Бактериофаги были хорошо известны как естественные механизмы движения ДНК среди бактерий в процессе, называемом трансдукцией. В этом исследовании был разработан метод использования вездесущего боррелиального фага φBB-1 для трансдукции ДНК между клетками B. burgdorferi как одного, так и разного генетического происхождения. Трансдуцированная ДНК включает в себя как боррелиальную ДНК, так и гетерологичную ДНК в виде небольших челночных векторов. Эта демонстрация предполагает потенциальное использование фаговой трансдукции в качестве дополнения к электропорации для генетических манипуляций со спирохетой болезни Лайма. В настоящем отчете описываются методы индукции и очистки фага φBB-1 от B. burgdorferi, использование этого фага в анализах трансдукции, а также отбор и скрининг потенциальных трансдуктантов.

Разработка инструментов для генетической манипуляции спирохетальной бактерией Borrelia burgdorferi добавила неизмеримую ценность пониманию природы болезни Лайма 1,2,3,4. B. burgdorferi имеет необычно сложный геном, состоящий из небольшой линейной хромосомы и как линейных, так и круговых плазмид ^5,6. Спонтанная потеря плазмид, внутригенная перестройка (перемещение генов из одной плазмиды в другую в пределах одного организма) и горизонтальный перенос генов (HGT, движение ДНК между двумя организмами) привели к головокружительному количеству генетической гетерогенности среди B. burgdorferi (например, см. Schutzer et ^al.7). Полученные генотипы (или «штаммы») являются членами одного и того же вида, но имеют генетические различия, которые влияют на их способность передавать и заражать разных хозяев млекопитающих 8,9,10,11. В настоящем докладе термин «штамм» будет использоваться для обозначения B. burgdorferi с особым естественным генетическим фоном; термин «клон» будет использоваться для обозначения штамма, который был генетически модифицирован для определенной цели или в результате экспериментальных манипуляций.

Молекулярный набор инструментов, доступный для использования у B. burgdorferi, включает выбираемые маркеры, генные репортеры, векторы челноков, транспозонный мутагенез, индуцируемые промоторы и контризбираемые маркеры (для обзора см. Drektrah and Samuels¹²). Эффективное использование этих методологий требует искусственного введения гетерологичной (чужеродной) ДНК в интересующий штамм B. burgdorferi. У B. burgdorferi введение гетерологичной ДНК достигается почти исключительно с помощью электропорации, метода, который использует импульс электричества, чтобы сделать бактериальную мембрану временно проницаемой для небольших кусочков ДНК, введенных в среду¹. Большинство клеток (по оценкам, ≥99,5%) погибают от пульса, но остальные клетки имеют высокую частоту удержания гетерологичной ДНК¹³. Хотя это считается одним из наиболее высокоэффективных методов введения ДНК в бактерии, частота электропорации в B. burgdorferi очень низкая (в пределах от 1 трансформанта в 5 × 10⁴ до 5 × 10⁶ клеток)¹³. Барьеры для достижения более высоких частот трансформации, по-видимому, являются как техническими, так и биологическими. Технические барьеры для успешной электропорации B. burgdorferi включают как необходимое количество ДНК (>10 мкг), так и требование к спирохетам находиться именно в правильной фазе роста (средняя бревна, от 2 × 10⁷ клеток·мл⁻¹ до 7 × 10⁷ клеток·мл⁻¹) при получении электрокомпетентных ячеек^12,13. Однако эти технические барьеры может быть легче преодолеть, чем биологические барьеры.

Исследователи болезни Лайма признают, что клоны B. burgdorferi можно разделить на две широкие категории в отношении их способности к генетическому манипулированию^13,14. Высокопроходимые, адаптированные к лабораторным исследованиям изоляты часто легко трансформируются, но обычно теряют плазмиды, необходимые для инфекционности, ведут себя физиологически аберрантно и не способны заражать хозяина млекопитающих или сохраняться в клещевом векторе^12,13. Хотя эти клоны были полезны для препарирования молекулярной биологии спирохеты в лаборатории, они не имеют большой ценности для изучения спирохеты в биологическом контексте энзоотического цикла. С другой стороны, низкопроходимые инфекционные изоляты ведут себя физиологически, отражая инфекционное состояние, и могут завершать инфекционный цикл, но обычно непокорны к введению гетерологичной ДНК и, следовательно, трудно манипулировать для исследования^12,13. Трудность преобразования изолятов низкого прохода связана, по меньшей мере, с двумя различными факторами: (i) изоляты низкого прохода часто плотно слипаются вместе, особенно в условиях высокой плотности, необходимых для электропорации, тем самым блокируя многие клетки либо от полного применения электрического заряда, либо от доступа к ДНК в среде^13,15; и ii) B. burgdorferi кодирует по меньшей мере две различные плазмидные системы рестрикции-модификации (R-M), которые могут быть потеряны в изолятах с высоким проходом^14,16. Системы R-M эволюционировали, чтобы позволить бактериям распознавать и устранять чужеродную ДНК¹⁷. Действительно, несколько исследований b. burgdorferi показали, что эффективность трансформации увеличивается, когда источником ДНК является B. burgdorferi, а не Escherichia coli^13,16. К сожалению, приобретение необходимой высокой концентрации ДНК для электропорации у B. burgdorferi является дорогостоящей и трудоемкой перспективой. Другая потенциальная проблема при электропорации и выборе изолятов низкого прохода заключается в том, что процесс, по-видимому, благоприятствует трансформантам, которые потеряли критическую плазмиду, связанную с вирулентностью, lp25 14,18,19; таким образом, сам акт генетического манипулирования низкопроходными изолятами B. burgdorferi посредством электропорации может отбирать клоны, которые не подходят для биологически значимого анализа в энзоотическом цикле²⁰. Учитывая эти проблемы, система, в которой гетерологичная ДНК может быть электротрансформирована в высокопроходные клоны B. burgdorferi, а затем перенесена в инфекционные изоляты низкого прохода методом, отличным от электропорации, может быть желанным дополнением к растущей коллекции молекулярных инструментов, доступных для использования в спирохете болезни Лайма.

Помимо трансформации (поглощения голой ДНК), существуют два других механизма, с помощью которых бактерии регулярно поглощают гетерологичную ДНК: конъюгация, которая представляет собой обмен ДНК между бактериями, находящимися в прямом физическом контакте друг с другом, и трансдукция, которая представляет собой обмен ДНК, опосредованный бактериофагом²¹. Действительно, способность бактериофага опосредуть HGT была использована в качестве экспериментального инструмента для препарирования молекулярных процессов в ряде бактериальных систем 22,23,24. B. burgdorferi от природы не компетентен для поглощения голой ДНК, и существует мало доказательств того, что B. burgdorferi кодирует аппарат, необходимый для успешного спряжения. Однако в предыдущих докладах описывалась идентификация и предварительная характеристика φBB-1, умеренного бактериофага B. burgdorferi 25,26,27,28. φBB-1 упаковывает семейство плазмид размером 30 кб, обнаруженных в B. burgdorferi²⁵; члены этого семейства были обозначены cp32s. В соответствии с ролью φBB-1 в участии в HGT среди штаммов B. burgdorferi, Stevenson et al. сообщили об идентичном cp32, обнаруженном в двух штаммах с разрозненными cp32s, предполагая недавнее разделение этого cp32 между этими двумя штаммами, вероятно, через трансдукцию²⁹. Есть также доказательства значительной рекомбинации через HGT среди cp32s в относительно стабильном геноме 30,31,32,33. Наконец, способность φBB-1 трансдуцировать как cp32s, так и гетерологичную челночную векторную ДНК между клетками одного и того же штамма и между клетками двух разных штаммов была продемонстрирована ранее^27,28. Учитывая эти результаты, φBB-1 был предложен в качестве еще одного инструмента, который будет разработан для вскрытия молекулярной биологии B. burgdorferi.

Целью настоящего доклада является детализация метода индуцирования и очистки фага φBB-1 от B. burgdorferi, а также предоставление протокола для выполнения трансдукционного анализа между клонами B. burgdorferi и отбора и скрининга потенциальных трансдуктантов.

Все эксперименты с использованием рекомбинантной ДНК и организмов BSL-2 были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности Университета Куиннипиак.

1. Подготовка культуры Б. бургдорфери для получения φBB-1

1. Приготовить среду Барбура-Стеннера-Келли с добавлением 6,6% инактивированной теплом нормальной кроличьей сыворотки (BSK)¹⁵. Для 1 л 1x BSK смешайте компоненты, перечисленные в таблице 1 , в 900 мл воды, отрегулируйте рН до 7,6, используя 1 N гидроксида натрия, и медленно перемешайте при 4 °C в течение 2-4 ч. После завершения перемешивания проверьте и при необходимости перенастройте рН до 7,6, а затем увеличьте объем до 1 л водой. Стерилизуют среду, проходя через фильтр 0,22 мкМ (см. Таблицу материалов), и используют в свежем виде или хранят при температуре 4 °C в течение ≤2 месяцев.
2. За три-пять дней до начала протокола трансдукции инокулируют 150 мкл соответствующего клона (клонов) B. burgdorferi в 15 мл 1x BSK в плотно закрытых стерильных конических центрифужных трубках (см. Таблицу материалов). Дополнить среду соответствующей концентрацией антибиотиков или комбинацией антибиотиков для отбора и поддержания гетерологичной ДНК в клоне () B. burgdorferi (таблица 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: B. burgdorferi является организмом уровня биобезопасности 2. Принимайте все соответствующие меры предосторожности при работе с этим организмом. Выполняйте все работы с живыми культурами B. burgdorferi в сертифицированном и надлежащим образом продезинфицированном шкафу биобезопасности II класса. Правильно утилизируйте весь материал, который контактирует с B. burgdorferi и самими организмами на основе рекомендаций CDC³⁴.
3. Инкубируют культуры при 33 °C без встряхивания до тех пор, пока культуры не достигнут плотности ≥5 × 10⁷ спирохет·мл⁻¹, что занимает примерно 3-5 дней.

2. Определите плотность культуры (культур) B. burgdorferi (модифицированной от Samuels)¹⁵

1. Для плотностей, которые, как ожидается, будут выше 5 × 10⁶ клеток·мл⁻¹, определите плотность клеток с помощью спектроскопии.
   1. Переложить 1 мл культуры в микроцентрифужную трубку и центрифугу объемом 1,7 мл при 8 000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   2. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄ и 1,8 мМ KH₂PO₄). Перенесите всю клеточную суспензию в полумикро-УФ-прозрачную кювету.
   3. Определить оптическую плотность повторно суспендированного образца на длине волны 600 нм (A₆₀₀). Обнулите спектрофотометр (см. Таблицу материалов) по отношению к PBS.
   4. Чтобы рассчитать концентрацию спирохет·мл⁻¹ в исходной культуре, умножьте оптическую плотность при А₆₀₀ на 1,4 × 10⁹.
2. Для плотностей, которые, как ожидается, будут между 5 × 10⁴ ячейками·мл⁻¹ и 5 × 10⁶ клетками·мл⁻¹, определите плотность клеток с помощью счетной камеры Петроффа-Хауссера (см. Таблицу материалов) для непосредственного подсчета количества спирохет. Этот метод также может быть использован для более высоких плотностей после соответствующего разбавления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации живых спирохет требуется микроскоп, модифицированный конденсатором темного поля.
   1. Нанесите 10 мкл образца на счетную камеру и накройте соответствующим покровным стеклом. Для плотностей выше 1 × 10⁷ разбавьте образец в PBS до получения 50-100 спирохет на поле.
   2. Подсчитывайте клетки с помощью микроскопа темного поля с увеличением 200x-400x. Подсчитайте все поле из 25 групп по 16 маленьких квадратов во всех плоскостях.
   3. Умножьте число, подсчитанное на коэффициент разбавления (если таковой имеется) и 5 × 10⁴ , чтобы получить клетки·мл⁻¹ исходной культуры.

3. Индукция фага Б. бургдорфери φBB-1

ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте всю стеклянную и пластиковую посуду путем автоклавирования; стерилизуют все растворы путем автоклавирования или фильтрации через фильтр 0,22 мкМ. Приведенные ниже шаги представлены на основе объемов 15 мл, но метод масштабируется до меньших или больших объемов в зависимости от индивидуальных потребностей эксперимента.

1. Для культуры B. burgdorferi , из которой будет получен фаг (донор), используйте концентрацию, рассчитанную любым методом на этапе 2, чтобы определить объем закваски, необходимый для получения 4 мл 2 × 10⁸ спирохет·^мл-1. Это даст конечную концентрацию 5 × 10⁷ спирохет·мл⁻¹ в 15 мл на стадии восстановления (стадия 3.6 ниже).
2. Центрифугу объема культуры рассчитывают на стадии 3.1 при 6000 х г в течение 10 мин. Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 4 мл свежего BSK. Перенесите образец в самую маленькую стерильную трубку, доступную для хранения образца с минимальным пространством головки.
3. Добавьте соответствующее количество индуцирующего агента к рекомендуемой концентрации (таблица 3) на основе объема культуры 4 мл, чтобы индуцировать производство фагов. Плотно закройте тюбик и тщательно перемешайте.
4. Инкубировать образец при 33 °C в течение 2-4 ч.
5. После инкубации перенесите образец в центрифужную трубку объемом 15 мл. Центрифугирование образца при 6 000 х г в течение 10 мин. Декант супернатанта.
6. Повторное суспендирование ячейки гранулы в 15 мл 1x BSK.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После индукции фага есть два разных способа продолжить трансдукционный анализ. Эти методы представлены на рисунке 1 , а также на шаге 4 и шаге 6.

4. Трансдукция во время кокультуры после воздействия на донора индуцирующего агента (Рисунок 1А)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть использован только в том случае, если фагопродуцирующий штамм (донор) имеет устойчивость к определенному антибиотику, а штамм, подлежащий трансдукции (реципиент), имеет устойчивость к другому антибиотику.

1. Подготовьте культуру B. burgdorferi для использования в качестве реципиента в трансдукционных анализах, как описано для донорского штамма на этапе 1 выше. Исходя из плотности, определенной как на шаге 2, рассчитайте объем, необходимый для получения 15 мл 1 × 10⁷ спирохет·мл⁻¹.
2. Центрифуга объема культуры рассчитывается на стадии 4.1 при 6000 х г в течение 10 мин. Декант супернатанта.
3. Повторно суспендировать гранулу в 1 мл культуры со стадии 3.6 (повторноуспендированный донор фагов). Добавьте повторно суспендированного реципиента обратно в язык и региональные параметры вместе с донором. Не принимайте добавки с антибиотиками. Общий объем, содержащий обе культуры, составляет 15 мл.
4. Инкубировать при 33 °C в течение 72-96 ч.
5. Выполните отбор трансдуктантов путем твердофазного покрытия после совместного культивирования, как описано в шаге 7.

5. Осаждение полиэтиленгликоля (ПЭГ) для восстановления фага для использования в трансдукционном анализе

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть использован в случаях, когда фагообразующий штамм (донор) имеет устойчивость к определенному антибиотику, а штамм, подлежащий трансдукции (реципиент), либо не имеет устойчивости к антибиотикам, либо устойчивости к другому антибиотику.

1. Дополнить культуру со стадии 3.6 соответствующим антибиотиком в концентрации, указанной в таблице 2. Инкубировать образец при 33 °C в течение 72-96 ч.
2. Подготовьте растворы для осаждения ПЭГ.
   1. Приготовьте 500 мл 5 М NaCl. Стерилизуйте путем автоклавирования и дайте остыть перед использованием. Хранить при комнатной температуре.
   2. Приготовить 500 мл 40% ПЭГ растворив 200 г ПЭГ8000 в 400 мл воды; осторожно нагревать во время перемешивания до тех пор, пока раствор не будет хорошо перемешан. Доведите объем до 500 мл водой. Чтобы полностью растворить PEG8000 и стерилизовать раствор, автоклавируйте раствор и охладите перед использованием. Хранить при комнатной температуре.
   3. Приготовьте 100 мл суспензионной среды (SM; 100 мМ NaCl, 10 мМ MgSO₄ и 50 мМ Tris-HCl [рН 7,5]). Стерилизуют автоклавированием. Хранить при температуре 4 °C.
3. Для ПЭГ-осаждения фага из донорского клона B. burgdorferi (со стадии 3.6) после 72-96 ч инкубации центрифугируют образцы при 8000 х г в течение 20 мин при 4 °C.
4. Декантировать супернатант в чистую коническую трубку объемом 50 мл; утилизируйте ячейку гранулы. Добавьте 5 М NaCl к конечной концентрации 1 М. Хорошо перемешать. Качать осторожно при комнатной температуре в течение 1 ч.
5. Центрифугирование образцов при 8 000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Декантировать супернатант в чистую коническую трубку объемом 50 мл; гранула может быть маленькой или отсутствовать. Добавьте 40% раствор ПЭГ8000 к надосадочному веществу до конечной концентрации 10%. Хорошо перемешать и поставить на лед более чем на 1 ч до ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время, по-видимому, не коррелирует со значительно увеличенным восстановлением фагов.
6. Центрифугирование образцов при 8 000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант и удалите как можно больше лишней жидкости без потери гранул, которые содержат частицы фага.
7. Повторно суспендируйте гранулу в минимальном объеме SM, используя SM для промывки боковой части бутылки и сбора любых потенциальных частиц фага. Рекомендуемое соотношение составляет 400 мкл СМ на 10 мл исходного супернатанта, но в зависимости от размера гранулы для полной повторной суспензии может потребоваться больше или меньше СМ.
8. Обработайте восстановленный образец фага равным объемом хлороформа на основе объема повторного суспензии. Хорошо перемешайте образец, а затем центрифугируйте при 8 000 х г в течение 10 мин. Удалите водный (верхний) слой в чистую трубку, избегая любого толстого пограничного слоя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: φBB-1 представляет собой бактериофаг без оболочки и не поддается обработке хлороформом²⁵. Этот шаг делается для дальнейшего разрушения любых связанных с мембраной структур (то есть клеток или блебов) и для уничтожения любых потенциальных клеточных загрязнителей. Хлороформ является летучим органическим веществом и должен использоваться только в хорошо вентилируемой вытяжке; выбрасывать материал, содержащий хлороформ, в качестве органических отходов.
9. Определите объем, восстановленный после первой обработки хлороформом, и снова обработайте образец количеством хлороформа, равным 10% от этого объема. Хорошо перемешать и центрифугировать при 8 000 х г в течение 10 мин. Удалите водный (верхний) слой, стараясь избегать любого интерфейсного или органического слоя. Переложите водный слой в чистую трубку.
10. Используйте фаг немедленно (как описано в шаге 6) или храните при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание образцов фагов φBB-1 не рекомендуется. Хотя стабильность φBB-1 при 4 °C не была тщательно исследована, образцы, хранящиеся при 4 °C в течение 1 месяца после восстановления, были успешно использованы в анализах трансдукции.

6. Анализ трансдукции после осаждения ПЭГ φBB-1 (Рисунок 1B)

1. Подготовьте культуры B. burgdorferi для использования в качестве реципиента в анализах трансдукции, как описано для донорского штамма на этапе 1 выше. Исходя из плотности, определяемой как на шаге 2, рассчитывают объем культуры реципиента, необходимый для получения 15 мл 1 × 10⁷ спирохет·мл⁻¹.
2. Центрифуга объема культуры рассчитана на стадии 6,1 при 6000 х г в течение 10 мин. Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте гранулы в 14,5 мл свежего БСК.
3. Добавьте ≤500 мкл осажденного ПЭГ образца фага (с этапа 5) в культуру клона-реципиента. Хорошо перемешать и инкубировать при 33 °С в течение 72-96 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество фагов, извлеченных во время осаждения ПЭГ, может быть переменным в зависимости от ряда факторов. Однако из 15 мл культуры индуцированного штамма B. burgdorferi CA-11.2A, 500 мкл обычно содержит 50-1000 жизнеспособных фагов²⁸. Объемы извлечения фагов ≥500 мкл отрицательно влияют на рост B. burgdorferi , вероятно, из-за увеличения соотношения SM к BSK.
4. Выполняют отбор трансдуктантов твердофазным покрытием после смешивания с ПЭГ-осажденным фагом, как описано на этапе 7.

7. Подбор трансдуктантов

ПРИМЕЧАНИЕ: Твердофазное покрытие потенциальных трансдуктантов выполняется с использованием однослойной модификации протокола, впервые описанного Сэмюэлсом¹⁵. Колонии B. burgdorferi растут внутри агара, поэтому для отбора трансдуктантов путем твердофазного покрытия образцы необходимо добавлять в среду во время заливки пластин. Альтернативный метод отбора трансформаторов методом разрежения в 96-луночных плитах также был описан ранее³⁵. Этот метод также может быть эффективным для выбора трансдуктантов, но еще не был опробован для этой цели.

1. Определите количество пластин, необходимых для выбора трансдуктантов, на основе количества образцов из анализов трансдукции и контрольных элементов, подлежащих покрытию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, на образец заливают две пластины, одна из которых эквивалентна приблизительно 10% объема культуры, а другая включает оставшуюся часть культуры. Кроме того, заливайте пластины, которые служат отрицательным контролем, чтобы индивидуально проверить, что фаговый препарат и / или родительские клоны, используемые в качестве донора и реципиента, не растут в присутствии антибиотика (ов), используемого во время отбора. Также рекомендуется подготовить гальванический материал по крайней мере для двух дополнительных пластин. Например, если количество образцов и элементов управления, подлежащих покрытию, составляет восемь, приготовьте достаточное количество гальванической смеси на 10 пластин.
2. Подготовьте растворы для нанесения покрытий, как описано ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая пластина будет 30 мл, состоящая из 20 мл 1,5x BSK для покрытия и 10 мл 2,1% агарозы (соотношение 2:1). Это даст пластину с конечными концентрациями 1x BSK и 0,7% агарозы. Например, для 10 пластин приготовьте общую гальваническую смесь 300 мл, состоящую из 200 мл 1,5x BSK и 100 мл 2,1% агарозы.
   1. Подготовьте 1 л 1,5x BSK, как описано для 1x BSK на шаге 1.1, используя количества каждого компонента, указанного для 1,5x BSK в таблице 1. Хранить так, как описано для 1x BSK.
   2. Готовят 2,1% агарозы в воде и автоклаве. Используйте раствор агарозы в свежем виде или храните при комнатной температуре. При хранении при комнатной температуре разверните микроволновую печь с крышкой до полного расплавления перед нанесением покрытия.
   3. Определить объем антибиотика (ов), необходимый для достижения соответствующей концентрации (таблица 2), на основе всей смеси покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если общий объем окончательного раствора для нанесения покрытия составляет 300 мл, смешайте 200 мл 1,5x BSK и достаточно антибиотика, чтобы убедиться, что все 300 мл имеют правильную конечную концентрацию антибиотика. Если и донор, и реципиент в трансдукционном анализе имеют разные гены устойчивости к антибиотикам, гальваническая смесь должна содержать оба антибиотика. Если осажденный ПЭГ фаг от донора (подготовленный на этапе 5) кодирует маркер устойчивости к антибиотикам, а у реципиента его нет, гальваническая смесь должна содержать только один антибиотик.
3. В зависимости от количества пластин, которые нужно налить, переложите соответствующее количество в 1,5 раза BSK и антибиотика (ов) в стерильный флакон, достаточно большой, чтобы вместить всю гальваническую смесь. Уравновешивайте на водяной бане при 56 °C в течение ≥15 мин.
4. Уравновешивайте расплавленную агарозу из автоклава или микроволновой печи на водяной бане при температуре 56 °C в течение ≥15 мин.
5. После уравновешивания добавляют в флакон определенное количество 2,1% агарозы с 1,5x BSK (с антибиотиком) и ставят гальванический раствор обратно на водяную баню при 42 °C в течение 10-15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие температуры могут повредить или убить спирохеты³⁶. Если вы используете ту же водяную баню, что и выше, охладите водяную баню до 42-45 °C перед запуском таймера для равновесия. Не позволяйте гальваническому раствору уравновешиваться при 42 °C более 20 минут, иначе он начнет затвердевать при заливке тарелок.
6. Во время уравновешивания подготовьте образцы B. burgdorferi к покрытию. Перенесите количество, подлежащее покрытию, в стерильную коническую центрифужную трубку объемом 50 мл (см. Таблицу материалов).
   1. При покрытии в количестве менее 1,5 мл (<5% от конечного объема пластины в 30 мл) перенесите образец в новую пробирку и добавьте гальваническую смесь непосредственно в образец во время гальванического покрытия.
   2. Для больших объемов переложите нужный объем культуры в новую трубку, а затем центрифугу при 6000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Декантируйте все, кроме 100-500 мкл супернатанта, и используйте оставшуюся часть для полного повторного суспендирования гранулы до нанесения покрытия.
   3. Для контрольных пластин после кокультуры добавляют ≥10⁷ клеток донорских или реципиентных клонов в стерильные конические центрифужные трубки объемом 50 мл. Если объем превышает 1,5 мл, центрифугируют и повторно суспендируют гранулу, как показано на этапе 7.6.2. Если трансдукционный анализ проводили с использованием осажденного ПЭГ фага, то в дополнение к клону реципиента добавляют 100-250 мкл образца фага в стерильную коническую трубку объемом 50 мл для нанесения покрытия.
7. После того, как гальванический раствор уравновешен при 42-45 °С в течение 10-15 мин, переложить 30 мл гальванического раствора в пробирку с соответствующим образцом; немедленно распределите гальваническую смесь и образец в маркированную тарелку. Повторите со свежей пипеткой для каждого образца, который должен быть покрыт.
8. Дайте пластинам затвердеть в течение 15-20 минут, а затем поместите их в инкубатор с температурой 33 °C, дополненный 5% CO₂. Не переворачивайте пластины в течение как минимум 48 ч после заливки.
9. В зависимости от фона клона-реципиента, проверьте, появляются ли колонии в пределах агарозы на селекционных пластинах после 10-21 дня инкубации. Соберите не менее 5-10 колоний, которые растут на пластине в присутствии обоих антибиотиков, используя стерилизованную хлопковую 5,75 в боросиликатной пипетке (см. Таблицу материалов) и привите их в 1,5 мл 1x BSK соответствующим антибиотиком (антибиотиками).
10. Выращивайте привитые колонии при 33 °C, как на стадии 1,3 в течение 3-5 дней или до тех пор, пока они не достигнут плотности примерно 20-40 спирохет на поле при 200-кратном увеличении с использованием микроскопии темного поля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После просеивания (см. этап 8) спирохеты могут быть заморожены для длительного хранения при −80 °C путем смешивания равного объема культуры со смесью 60% глицерина и 40% 1x BSK стерилизованы фильтрацией через фильтр 0,22 мкм.

8. Проверка потенциальных трансдуктантов

ПРИМЕЧАНИЕ: Скрининг клонов, которые растут на пластинах в присутствии двух антибиотиков, чтобы убедиться, что они представляют истинные трансдуктанты в ожидаемом (реципиентном) фоне. Эти методы основаны на амплификации и потенциальном секвенировании определенных областей полимеразной цепной реакцией. Подробные протоколы и методы проведения ПЦР у B. burgdorferi описаны в другом месте (недавний пример см. в Seshu et ^al.37). Выберите праймеры, используемые для скрининга трансдуктантов, на основе используемых штаммов. Некоторые предложения относительно того, как подходить к скринингу трансдуктантов, описаны ниже.

1. Подготовьте лизаты B. burgdorferi для ПЦР-скрининга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол используется для получения промытых лизатов B. burgdorferi из культивируемых клеток, выращенных на этапе 7.9, для немедленного анализа ДНК с помощью ПЦР. Этот метод предназначен для минимизации интерференции потенциальных ингибиторов в BSK, но не рекомендуется для получения высококачественной ДНК для секвенирования или хранения. Для этого используйте протокол или комплект для полного извлечения генома (см. Таблицу материалов). Настоятельно рекомендуется, чтобы лизаты из родительских клонов (как донорских, так и реципиентных штаммов) также были подготовлены одновременно для включения в каждый анализ.
   1. Перенесите 500 мкл каждого выбранного и культивируемого потенциального трансдуктивного вещества, как на этапе 7.10, в чистую микроцентрифужную трубку.
   2. Центрифугировать культуры в течение 10 мин при 8 000 х г при комнатной температуре.
   3. Удалить супернатант и повторно суспендировать каждую гранулу в 500 мкл TE (10 мМ Tris Cl, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Центрифуга в течение 5 мин при 8 000 х г при комнатной температуре.
   4. Удалите супернатант и повторно суспендируйте каждую гранулу в 50 мкл воды качества ПЦР. Варить образцы в течение 10 мин. Дайте им ненадолго остыть, а затем центрифугируйте при 8000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
   5. Для каждой ПЦР немедленно используйте 2 мкл сверху центрифугированного образца; не нарушайте гранулу.
2. Скрининг потенциальных трансдуктантов для конкретных генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам, с помощью ПЦР. См. Таблицу 4 для праймеров для скрининга маркеров устойчивости к антибиотикам, обычно используемых в анализах трансдукции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это редкость в нашем опыте, спонтанная мутация в аминогликозидные антибиотики, используемые для отбора гетерологичной ДНК у B. burgdorferi , может произойти.
3. Проверьте потенциальные трансдуктанты также с помощью другого штамма или маркера клона, чтобы подтвердить, что фон является фоном получателя. Включите в эти анализы как донора, так и родительского клона реципиента. Скрининг на специфические для деформации маркеры с использованием последовательностей, основанных на используемых штаммах и отдельных лабораторных протоколах для определения целостности деформации.
4. При попытке трансдукции в вирулентные клоны для использования в клещевом векторе или хозяине млекопитающих или для прямого сравнения с другим клоном, определите полное содержание плазмид трансдуктантов и родительских клонов. Это делается для обеспечения того же содержания плазмид, что и у сравнительного штамма, или наличия генетических элементов, необходимых для размножения в энзоотическом цикле, как описано в другом месте 18,19,37,38,39.

Использование бактериофага для перемещения ДНК между более легко трансформируемыми штаммами B. burgdorferi или клонами, которые непокорны электротрансформации, представляет собой еще один инструмент для продолжения молекулярного исследования детерминант болезни Лайма. Трансдукционный анализ, описанный в настоящем описании, может быть модифицирован по мере необходимости для облегчения перемещения ДНК между любыми интересующими клонами с использованием одного или двух антибиотиков для отбора потенциальных трансдуктантов. Ранее была продемонстрирована трансдукция как ДНК профага, так и гетерологичных векторов E. coli/B. burgdorferi между клоном штамма CA-11.2A с высоким проходом и клоном штамма B31 с высоким проходом и вирулентным клоном штамма 297 с низким проходом. Результаты, представленные ниже, демонстрируют движение ДНК профага между двумя высокопроходными, авирулентными клонами. Донорский клон, c1673, представляет собой клон штамма B. burgdorferi CA-11.2A, который кодирует ген устойчивости к канамицину на ДНК профага ^27,28. Реципиент является клоном штамма B. burgdorferi B31, обозначенного c1706, который кодирует маркер резистентности к гентамицину на хромосоме²⁸. Анализ трансдукции проводили, как показано на рисунке 1B; осажденный ПЭГ фаг, извлеченный из супернатантов c1673, подвергшихся воздействию 5% этанола, смешивали с c1706, как описано на этапе 6 протокола.

После смешивания примерно 20% фага, извлеченного путем осаждения ПЭГ из супернатантов этанола, подвергшихся воздействию c1673 (кодирующего устойчивость к канамицину), с c1706 (кодирующей устойчивость к гентамицину), смесь покрывали в присутствии обоих антибиотиков; колониеобразующие единицы (КОЕ), которые способны расти в присутствии как канамицина, так и гентамицина, свидетельствуют о событиях трансдукции (рисунок 2)^27,28. Количество КОЕ сообщается как частота трансдукции на начальную ячейку-реципиента. В этом репрезентативном эксперименте приблизительно 275 трансдуктантов были восстановлены после инкубации фага с 1 × 10⁷ клетками-реципиентами, что дало частоту трансдукции 2,75 × 10−5 КОЕ на клетку-реципиент.

После восстановления потенциальных трансдуктантов ПЦР-амплификация генов, кодирующих канамицин и резистентность к гентамицину, была выполнена на 10 клонах, причем два репрезентативных образца показаны на рисунке 3. Ген устойчивости к канамицину может быть амплифицирован от донора (c1673) и потенциальных трансдуктантов, но не реципиентов (c1706). Аналогичным образом, ген ген гентамицин-резистентности может быть амплифицирован от реципиента (c1706) и потенциальных трансдуктантов, но не от донора. Таким образом, восстановленные клоны специфически кодируют оба гена устойчивости к антибиотикам и представляют собой события трансдукции, а не спонтанные мутанты.

Чтобы продемонстрировать, что кассета с канамицин-резистентностью была трансдуцирована φBB-1 от донора в реципиента, фон трансдуктантов определяли с помощью специфических для штамма маркеров, как описано ранее²⁸. Это особенно важно, если трансдуктанты были сгенерированы методом кокультуры трансдукции. Вкратце, ранее опубликованные праймеры²⁸ использовались для усиления определенных областей различных боррелиальных плазмид, генерируя профиль, который может быть использован для идентификации фона клона (фиг.4). Клон c1673 в фоновом режиме CA-11.2A кодирует определенные ампликоны 4, 5 и 6, в то время как c1706, который имеет высокий проходной фон B31, этого не делает. Аналогично, в двух трансдукантах отсутствуют ампликоны 4, 5 и 6; таким образом, эти клоны имеют фон c1706 и приобрели ген устойчивости к канамицину от c1673.

Таблица 1: БСК для выращивания и селекции клонов B. burgdorferi для трансдукционных анализов. Рецептура и приготовление 1x BSK для культивирования B. burgdorferi и 1,5x BSK для твердофазного отбора клонов B. burgdorferi, описанные здесь, основаны на Samuels¹⁵. Различные составы BSK (или MKP)37,40,41, которые поддерживают рост B. burgdorferi, еще не были протестированы с использованием трансдукционного анализа.

Таблица 2: Потенциальные антибиотики и концентрации, которые будут использоваться для отбора и поддержания гетерологичной ДНК у B. burgdorferi. Этот список основан на современных устойчивых к антибиотикам маркерах, обычно используемых в Borrelia burgdorferi 42,43,44,45. Канамицин, гентамицин и стрептомицин готовят в воде, фильтруют-стерилизуют через фильтр 0,22 мкМ и хранят при −20 °C. Эритромицин готовят в 95% этаноле и хранят при −20 °C. Многие лаборатории сообщают об успешном использовании канамицина для селекции в концентрации 200 мкг·мл⁻¹; при использовании как гентамицина, так и канамицина для селекции в трансдукционных анализах используется 400 мкг·мл⁻¹ канамицина. Ген aadA придает устойчивость как к стрептомицину, так и к спектиномицину⁴⁴. Для селекции конструкций, содержащих ген aadA в E. кишечная палочка, 100 мкг·мл⁻¹ спектиномицин. Отметим, что аминогликозиды (канамицин, гентамицин и стрептомицин) клинически не актуальны при лечении болезни Лайма; однако эритромицин применяют клинически в определенных ситуациях⁴⁶. Хотя естественная резистентность к этому антибиотику у B. burgdorferi была зарегистрирована⁴⁷, этот маркер резистентности до сих пор не использовался в анализах трансдукции, о которых сообщается здесь.

Таблица 3: Потенциальные индуцирующие агенты и концентрации, используемые для индукции φBB-1 от B. burgdorferi. Было продемонстрировано, что N-метил-N'-нитро-N-нитросогуанидин (MNNG), митомицин С и этанол, а также метанол и изопропанол индуцируют φBB-1 выше конститутивных уровней у штамма B. burgdorferi CA.11-2A 25,26,28. MNNG представляет собой предполагаемый канцероген и опасность для окружающей среды; использовать с осторожностью, растворить в горючем растворителе и сжечь для утилизации. Митомицин С является подозреваемым канцерогеном и потенциальной опасностью для окружающей среды; используйте с осторожностью под химическим вытяжным кожухом и утилизируйте должным образом. Хотя опубликованные данные свидетельствуют о том, что MNNG является наиболее эффективным агентом для индуцирования φBB-1²⁶, опасности работы с этим химическим веществом и трудности в его приобретении затрудняют его использование⁴⁸, особенно со студентами. Индукция с этанолом последовательно лучше, чем с метанолом или изопропанолом²⁸, и чаще всего используется в анализе трансдукции.

Таблица 4: Праймеры, применяемые для предварительного анализа трансдукции маркеров антибиотикорезистентности. Праймеры, указанные здесь, предназначены для обнаружения генов устойчивости к антибиотикам, обычно используемых в анализах трансдукции. Эти праймеры используются в ПЦР со следующими условиями, повторяющимися в течение 28 циклов: денатурация при 92 °C в течение 15 с, отжиг грунтовки при 56 °C в течение 15 с и расширение целевой ДНК при 72 °C в течение 30 с.

Рисунок 1: Трансдукционный анализ для мониторинга фагопосредованного движения (трансдукции) ДНК. Анализ трансдукции может быть выполнен с использованием либо (А) метода кокультуры, либо (В) фага, извлеченного из супернатанта культуры путем осаждения ПЭГ. Для метода кокультуры (А) индуцированный клон B. burgdorferi (донор), кодирующий ген устойчивости к антибиотикам на ДНК, трансдуцируемой φBB-1 (зеленый круг), культивируют с помощью неиндуцированного клона B. burgdorferi (реципиент), который кодирует второй ген устойчивости к антибиотикам на хромосоме или другом стабильном генетическом элементе (красный круг). Этот метод требует использования двух различных маркеров устойчивости к антибиотикам (в данном примере гены, кодирующие канамицин и гентамициновую резистентность). Для использования очищенного фага в трансдукционном анализе (В) частицы фага, извлеченные путем осаждения ПЭГ супернатанта от индуцированного донора, смешивают с реципиентом. Хотя здесь показано использование двух разных антибиотиков, этот метод может быть выполнен с использованием только одного маркера устойчивости к антибиотикам, закодированного на ДНК профага φBB-1, как было ранее продемонстрировано²⁷. После инкубации трансдуктанты подбирают твердофазным покрытием в присутствии обоих антибиотиков; если метод В используется только с одним маркером устойчивости к антибиотикам, закодированным на ФАГОВОЙ ДНК, то отбор производится с использованием только этого антибиотика во время твердофазного покрытия. Трансдуктанты будут содержать как маркеры устойчивости к антибиотикам, так и иметь фон реципиента. Эта цифра перепечатана из Eggers et ^al.28 с разрешения издательства Oxford University Press. В смоделированном эксперименте c1673 и c1650 представляют собой два разных клона CA-11.2A; c1673 несет профаг φBB-1, кодирующий резистентность к канамицину, а c1650 кодирует маркер резистентности к гентамицину в нефаговой локации²⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Колониеобразующие единицы, выбранные твердофазным покрытием после анализа трансдукции. Колонии, которые растут в присутствии обоих антибиотиков после смешивания фага из c1673 с c1706, представляют собой потенциальные трансдуктанты. Никакие колонии не должны расти на контрольных пластинах, содержащих индивидуальные донорские и реципиентные клоны или образец фаговой подготовки (не показан). Минимальное количество продуктивных фагов в исходном образце может быть определено путем подсчета количества КОЕ и умножения на коэффициент разбавления. В этом случае 20% образца фага PEG-осажденного из 15 мл культуры донора дали приблизительно 275 колоний. Таким образом, первоначальная концентрация продуктивного фага, извлеченного путем осаждения ПЭГ, составляла ≥1,3 × 10³ вирионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: ПЦР-амплификация генов, придающих устойчивость к канамицину и гентамицину от двух потенциальных трансдукантов. ПЦР с использованием праймеров для генов резистентности к канамицину и гентамицину (таблица 4) проводили для скрининга лизатов, образующихся из двух колоний (трансдуктант 1 и трансдуктант 2). Эти колонии были отобраны на пластине, содержащей как канамицин, так и гентамицин после смешивания c1673 (донор) и c1706 (реципиент). Ампликоны растворяли на 1% агарозном геле, электрофорезированном в течение 60 мин при 120 В в 1-кратном буфере трис-ацетат-ЭДТА (TAE) и окрашивали 0,5 мкг·мл⁻¹ бромида этидия. Цифры обозначают маркеры размера в парах килобазов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Подтверждение фона трансдуктантов. Области специфических генетических элементов были амплифицированы из c1673, c1706 и двух трансдуктантов, как описано ранее²⁸, чтобы подтвердить, что фон трансдукантов был таковым у клона-реципиента, c1706. Выбранные области были основаны на последовательностях генов на конкретных линейных или круговых плазмидах (lp или cp, соответственно) в пределах штамма типа B. burgdorferi , B31⁶. 1 = BBA60 (lp54), 2 = BBB19 (cp26), 3 = BBE22 (lp25), 4 = BBG13 (lp28-2), 5 = BBI28 (lp28-4), 6 = BBK12 (lp36), 7 = BBS41 (cp32) и 8 = ген fla (хромосома). Ампликоны разрешали на 1% агарозном геле электрофорезе в течение 60 мин при 120 В в 1x TAE буфере и окрашивали 0,5 мкг·мл⁻¹ бромида этидия. Цифры обозначают маркеры размера в парах килобазов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Использование трансдукции может представлять собой один из методов преодоления, по меньшей мере, некоторых биологических и технических барьеров, связанных с электротрансформацией B. burgdorferi 1,4,13,37. Во многих системах бактериофаг может перемещать ДНК хозяина (непрофага) между бактериальными клетками путем генерализованной или специализированной трансдукции 22,23,24,49,50. При специализированной трансдукции несколько генов-хозяев всегда упакованы в фаговой капсид вместе с ДНК профага^49,50. Например, φBB-1 всегда упаковывает те части cp32, которые являются бактериальными по происхождению, потому что они неразрывно связаны на плазмиде с частями cp32, которые являются геномом фага. В обобщенной трансдукции механизм упаковки бактериофага, как полагают, цепляется за гомологичные нефаговые последовательности и «случайно» упаковывает случайную ДНК хозяина вместо ФАГОВОЙ ДНК; эти кусочки ДНК затем могут быть введены в другую клетку ^49,50. Мало что известно о генерализованной трансдукции фагом у B. burgdorferi; однако в более характеризуемых бактериальных системах до 1% бактериофага, высвобождаемого из клетки, может содержать случайные бактериальные гены вместо фаговой ДНК⁵¹. До сих пор не наблюдалось трансдукции хромосомных маркеров между различными клонами B. burgdorferi, но предыдущая демонстрация того, что как cp32s, так и небольшие гетерологичные векторы шаттла могут быть упакованы и трансдуцированы φBB-1, указывает на то, что этот фаг может участвовать как в специализированной, так и в обобщенной трансдукции²⁸. Поэтому предлагается вариант использования трансдукции в лаборатории, в котором электротрансформация, генерирующая хромосомную мутацию, все еще осуществляется на фоне интереса; однако введение челночных векторов для комплементации в трансе или для экспрессионных исследований с использованием репортерных конструкций в штаммы, непокорные электротрансформации, может быть осуществлено путем трансдукции между более трансформируемым клоном с высоким проходом и менее трансформируемыми штаммами. Если будущие исследования продемонстрируют способность φBB-1 также упаковывать и перемещать хромосомные локусы, то способы, описанные в настоящем описании, также могут оказаться полезными при перемещении модифицированной хромосомной ДНК между более легко трансформируемыми штаммами и штаммами, которые в противном случае трудно электротрансформировать. Cp32-подобные плазмиды распространены среди всех штаммов B. burgdorferi и подавляющего большинства других спирохет болезней Лайма^52,53; имеются также данные о гомологах у других видов borrelia, включая B. mayonii, B. miyamotoi и те, которые вызывают рецидивирующую лихорадку 54,55,56. Являются ли гомологи у других видов Боррелий также профагами, пока неизвестно, но если это так, то трансдукция также может быть инструментом для молекулярного рассечения этих видов, некоторые из которых еще предстоит успешно генетически манипулировать.

Здесь были представлены два метода трансдукции ДНК: совместное культивирование клонов донора и реципиента перед отбором (рисунок 1A) или ПЭГ-осажденный фаг от донора и смешивание только этого фага с реципиентом (рисунок 1B). Количество событий трансдукции на клетку-реципиента выше после ко-культуры, чем при использовании осажденного ПЭГ фага²⁸, но кокультура требует, чтобы и донор, и реципиент несли разные маркеры устойчивости к антибиотикам и чтобы фон любых потенциальных трансдукантов был тщательно проверен. Поскольку профаг φBB-1 вездесущ среди Borrelia^52,53, существует теоретическая вероятность того, что при смешивании активно растущих клонов маркер устойчивости к антибиотикам или другая гетерологичная ДНК может перемещаться от реципиента к донору (а не от донора к реципиенту, как предполагалось). Использование ПЭГ-осажденного фага в трансдукционном анализе исключает эту возможность, поскольку донор не присутствует в смеси фаг/реципиент. Кроме того, ПЭГ-осаждение фага требуется, если фаг и его геномное содержимое должны использоваться как для анализа (т.е. структурного анализа, количественной оценки, идентификации упакованного материала и т.д.), так и для трансдукции. Несмотря на эти преимущества, использование ПЭГ-осажденного фага имеет свои потенциальные недостатки; в дополнение к тому, что осаждение ПЭГ не дает столько трансдукантов, сколько при совместной культуре, может занимать много времени, может привести к значительным потерям фагов и приводить к получению образцов с загрязняющими веществами, которые могут мешать последующим применениям^57,58.

К настоящему времени трансдукция была продемонстрирована из трех штаммов B. burgdorferi: CA-11.2A, клона B31 с высоким проходом, и клона 297 с низким проходом²⁸. Из этих трех штамм B. burgdorferi CA-11.2A производит наибольшее количество фага после индукции 25,26,28; однако даже после индукции количество фагов, извлеченных из B. burgdorferi, по-прежнему на порядки ниже, чем фагов, восстановленных в более характерных системах, таких как колифаж λ 25,28,59. Таким образом, одной из проблем, которая может возникнуть при использовании трансдукции через кокультуру или смешивание фагов после осаждения ПЭГ, является небольшое количество бактериофагов, которые высвобождаются из B. burgdorferi, даже при воздействии индуцирующих агентов. Кроме того, вариации в производстве фагов от партии к партии значительны, даже когда все условия, компоненты среды и методы кажутся согласованными между экспериментами. По этой причине важно определить, что, по крайней мере, минимальное количество фагов производится из данного клона или при данном условии. Традиционные анализы для определения количества фагов в образце требуют смешивания небольшого количества образца, содержащего фаг, с разрешающим бактериальным хозяином, в котором бактериофаг является литическим; количество продуктивных фаговых частиц в образце определяется количеством литических событий, которые происходят на этом фоне, в результате чего образуются бляшки на лужайке бактерий^60,61. Количество фагов сообщается как бляшеобразующие единицы (PFU)⁶¹. Количественная оценка количества продуктивных φBB-1, высвобождаемых после индукции с использованием анализа бляшек, затруднена невозможностью выращивания Borrelia burgdorferi на плотном газоне и текущим отсутствием понимания механизмов, которые контролируют переключение между лизогенными и литическими циклами репликации φBB-1. Действительно, в то время как анекдотические сообщения о лизированных культурах B. burgdorferi многочисленны, до сих пор не было опубликовано ни одного исследования, коррелирующего наблюдение лизиса всей культуры с производством фага. Исходя из опыта, только небольшое количество клеток в данной культуре, по-видимому, спонтанно производят фаг, предположительно путем лизиса, и это производство может быть лишь незначительно увеличено с воздействием известных индуцирующих агентов 25,28,62. Таким образом, анализ бляшек в настоящее время невозможен для количественной оценки φBB-1 от B. burgdorferi.

Для количественной оценки количества продуктивных фагов, полученных после индукции B. burgdorferi, анализ трансдукции, описанный в этом отчете, может быть выполнен с использованием разрешающего клона B. burgdorferi с антибиотиком, отличным от того, который упакован бактериофагом. Этот анализ приводит к колониям, которые возникают в результате трансдукции, причем каждая колония представляет собой подтвержденный фаг. Таким образом, минимальное количество фагов в образце может быть сообщено как КОЕ, а не КАК ПФУ. Это число, вероятно, (намного) ниже, чем фактическое общее количество фагов, полученных из-за неэффективности, присущей восстановлению фага осаждением ПЭГ (если используется), прикреплению и инъекции ДНК фагом и твердофазному покрытию B. burgdorferi.

Одним из потенциальных методов определения общего количества ПРОФАГОВОЙ ДНК в супернатантах культур B. burgdorferi является количественная ПЦР (qPCR), но протоколы qPCR для ДНК cp32 от B. burgdorferi недостаточно представлены в литературе, и qPCR еще не является методологией, широко используемой для этой цели. Чтобы качественно определить, что в данном образце имеется, по крайней мере, умеренный уровень ФАГОВОЙ ДНК, общая ДНК может быть извлечена из осажденных ПЭГ супернатантов культур B. burgdorferi после обработки ДНКазой до экстракции; ФАГОВАЯ ДНК будет защищена неповрежденным фаговым капсидом²⁵. Восстановленная ДНК затем растворяется в агарозном геле и визуализируется с помощью пятна ДНК; этот протокол обычно дает слабую полосу 30 кб, представляющую линейную ДНК, упакованную внутри фаговой головки²⁵. Исходя из чувствительности пятна и интенсивности правильно размерной полосы ДНК фагов относительно маркера, приблизительное количество всего восстановленного фага можно определить^25,27. Сильная положительная корреляция уровней общей фаговой ДНК, извлеченной из супернатанта, с количеством трансдуктантов, восстановленных после анализа трансдукции, была продемонстрирована ранее²⁸.

Выбор донорского и реципиентного штаммов имеет решающее значение для успеха использования трансдукции в качестве молекулярного инструмента. Наше понимание cp32s как профага φBB-1 осложняется как распространенностью cp32s в спирохетах болезни Лайма^52,53, так и тем, что отдельная клетка B. burgdorferi может содержать несколько гомологов этих плазмид. Все cp32 в клетке, по-видимому, упакованы в фаговые головки в фагообразующих штаммах, которые были исследованы²⁷. Однако неясно, могут ли все штаммы B. burgdorferi, содержащие cp32s, продуцировать бактериофаг, и штаммы должны быть проверены на эту способность перед использованием. Точно так же ничего не известно о рецепторах, позволяющих конкретному штамму трансдуцироваться φBB-1, хотя повсеместное распространение плазмиды профага по всему роду предполагает высокую вероятность того, что конкретный штамм может быть трансдуцирован. Как можно заключить из наличия нескольких плазмид cp32 в отдельной клетке B. burgdorferi, по-видимому, не существует никакого фагового иммунитета⁶³, придаваемого присутствием существующего профага; штаммы CA.11-2A, B31 и 297 использовались в трансдукционных анализах и оба производят и могут быть трансдуцированы φBB-1^27,28. В то время как в предыдущих отчетах указывалось, что трансдукция возможна только в ограниченное число штаммов с использованием осажденного ПЭГ фага²⁷, это, возможно, было связано с техническими трудностями с этим методом, поскольку все штаммы, испытанные на сегодняшний день, были успешно трансдуцируемыми с использованием метода²⁸ совместной культивирования.

При разработке эксперимента с использованием трансдукционного анализа основными соображениями при выборе донорского штамма должны быть генетический фон, его способность легко трансформироваться с помощью электропорации и его способность производить фаг. Хотя исчерпывающее исследование высокопроходных клонов каждого штамма не было сделано, штамм CA-11.2A конститутивно производит фаг на обнаруживаемых уровнях даже при отсутствии индукции. Аналогичным образом, высокопроходные клоны B31, первого штамма B. burgdorferi, который был полностью секвенирован⁵, и обычно используемого штамма в молекулярных исследованиях, также конститутивно производят обнаруживаемые количества φBB-1 и, как правило, имеют высокую трансформацию ^{1,4,25,27,37,64} . Если исследования требуют других штаммов, рекомендуется, чтобы клоны этого штамма с высоким проходом сначала проверяли на их трансформируемость путем введения плазмиды, содержащей маркер устойчивости к антибиотикам, с помощью электропорации, а затем оценивали их способность трансдуцироваться путем выполнения трансдукционного анализа с разрешающим реципиентом, таким как CA-11.2A или B31, кодирующим другой маркер устойчивости к антибиотикам. Аналогичным образом, чтобы гарантировать, что штамм-реципиент или клон допустимо к трансдукции, фаг-продуцирующий штамм, такой как CA-11.2A, несущий профаг, кодирующий устойчивость к антибиотику, может быть смешан с интересующим клоном, чтобы обеспечить трансдукцию.

Многое еще предстоит понять о молекулярной биологии φBB-1 и его роли в HGT в B. burgdorferi, особенно когда он проходит энзоотический цикл. Способность φBB-1 экспериментально трансдуцировать как фаговую, так и гетерологичную ДНК в лаборатории, однако, дает возможность добавить еще один инструмент для молекулярного рассечения B. burgdorferi и его роль в патогенезе болезни Лайма.

Автору нечего раскрывать.

Автор хотел бы поблагодарить Шону Рид, Д. Скотта Сэмюэлса и Патрика Секора за их полезную дискуссию и Вареона (Пэм) Чонвиравонга за их техническую помощь. Эта работа была поддержана Департаментом биомедицинских наук и исследовательскими грантами факультета Кристиану Х. Эггерсу из Школы наук о здоровье в Университете Куиннипиак.