Hidrozoan Denizanası Cladonema pacificum'daki Kök Benzeri Hücreler için Floresan In Situ Hibridizasyon ve 5-Etinil-2'-Deoksiüridin Etiketleme

Burada, denizanası Cladonema'daki kök benzeri çoğalan hücreleri görselleştirmek için bir protokol açıklıyoruz. Bir kök hücre belirteci ile tam montajlı floresan in situ hibridizasyon, kök benzeri hücrelerin tespit edilmesine izin verir ve 5-etinil-2'-deoksiüridin etiketlemesi, çoğalan hücrelerin tanımlanmasını sağlar. Birlikte, aktif olarak çoğalan kök benzeri hücreler tespit edilebilir.

Deniz anemonları, mercanlar ve denizanası da dahil olmak üzere Cnidarian'lar, sapsız poliplerde ve serbest yüzme medusalarında ortaya çıkan çeşitli morfoloji ve yaşam tarzları sergilerler. Hydra ve Nematostella gibi yerleşik modellerde örneklendiği gibi, kök hücreler ve / veya proliferatif hücreler cnidarian poliplerin gelişimine ve yenilenmesine katkıda bulunur. Bununla birlikte, çoğu denizanasında, özellikle medusa aşamasında, altta yatan hücresel mekanizmalar büyük ölçüde belirsizdir ve bu nedenle, spesifik hücre tiplerini tanımlamak için sağlam bir yöntem geliştirmek kritik öneme sahiptir. Bu yazıda, hidrozoan denizanası Cladonema pacificum'daki kök benzeri çoğalan hücreleri görselleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Cladonema medusae, yetişkin evreleri boyunca sürekli büyüyen ve rejeneratif kapasiteyi koruyan dallanmış dokunaçlara sahiptir ve çoğalan ve / veya kök benzeri hücreler tarafından düzenlenen hücresel mekanizmaları incelemek için eşsiz bir platform sağlar. Bir kök hücre belirteci kullanan tam montajlı floresan in situ hibridizasyon (FISH), kök benzeri hücrelerin tespit edilmesine izin verirken, bir S faz belirteci olan 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ile nabız etiketlemesi, çoğalan hücrelerin tanımlanmasını sağlar. Hem FISH hem de EdU etiketlemesini birleştirerek, sabit hayvanlar üzerinde aktif olarak çoğalan kök benzeri hücreleri tespit edebiliriz ve bu teknik, model olmayan denizanası türleri de dahil olmak üzere diğer hayvanlara geniş çapta uygulanabilir.

Cnidaria, sinir ve kasları olan hayvanları içeren temel olarak dallanan bir metazoan filum olarak kabul edilir ve onları hayvan gelişiminin ve fizyolojisinin evrimini anlamak için benzersiz bir konuma yerleştirir ^1,2. Cnidarians iki ana gruba ayrılır: Anthozoa (örneğin, deniz anemonları, mercanlar) sadece planula larvalarına ve sapsız polip aşamalarına sahipken, Medusozoa (Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa ve Cubozoa üyeleri) tipik olarak serbest yüzme medusae veya denizanası ile planula larvaları ve polipleri şeklini alır. Cnidarians genellikle yüksek rejeneratif kapasite sergiler ve altta yatan hücresel mekanizmaları, özellikle yetişkin kök hücrelere ve proliferatif hücrelere sahip olmaları, çok dikkat çekmiştir ^3,4. Başlangıçta Hydra'da tanımlanan hidrozoan kök hücreler, ektodermal epitel hücreleri arasındaki interstisyel boşluklarda bulunur ve genellikle interstisyel hücreler veya i-hücreleri³ olarak adlandırılır.

Hidrozoan i-hücreleri, çok yönlülük, yaygın olarak korunan kök hücre belirteçlerinin ekspresyonu (örneğin, Nanolar, Piwi, Vasa) ve göç potansiyeli 3,5,6,7,8 gibi ortak özellikleri paylaşır. Fonksiyonel kök hücreler olarak, i-hücreler hidrozoan hayvanların gelişimine, fizyolojisine ve çevresel tepkilerine yoğun bir şekilde katılır ve bu da yüksek rejeneratif kapasitelerini ve plastisitelerini kanıtlar³. I-hücrelerine benzer kök hücreler, hidrozoanların dışında, yerleşik model türü Nematostella'da bile tanımlanmamış olsa da, proliferatif hücreler hala somatik dokunun ve germ hattı^9'un bakımı ve yenilenmesinde rol oynamaktadır. Cnidarian gelişimi ve rejenerasyonu ile ilgili çalışmalar ağırlıklı olarak Hydra, Hydractinia ve Nematostella gibi polip tipi hayvanlar üzerinde yapıldığından, denizanası türlerinde kök hücrelerin hücresel dinamikleri ve işlevleri büyük ölçüde ele alınmamıştır.

Akdeniz ve Kuzey Amerika da dahil olmak üzere dünya çapında farklı habitatlara sahip kozmopolit bir denizanası türü olan hidrozoan denizanası Clytia hemisphaerica , çeşitli gelişimsel ve evrimsel çalışmalarda deneysel bir model hayvan olarak kullanılmıştır¹⁰. Küçük boyutu, kolay kullanımı ve büyük yumurtaları ile Clytia , laboratuar bakımı için ve yakın zamanda kurulan transgenez ve nakavt yöntemleri¹¹ gibi genetik araçların tanıtılması için uygundur ve denizanası biyolojisinin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların ayrıntılı analizi için fırsat yaratır. Clytia medusa dokunaçlarında, i-hücreleri ampul adı verilen proksimal bölgede lokalize olur ve nematoblastlar gibi progenitörler, nematositler¹² de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerine farklılaşırken distal uca göç eder.

Denizanasının oral organı olan Clytia manubriumunun yenilenmesi sırasında, gonadlarda bulunan Nanos1 ⁺ i-hücreleri, hasara yanıt olarak manubriumun kaybolduğu bölgeye göç eder ve manubrium^7'nin yenilenmesine katılır. Bu bulgular, Clytia'daki i-hücrelerinin aynı zamanda morfogenez ve rejenerasyonda rol oynayan fonksiyonel kök hücreler gibi davrandığı fikrini desteklemektedir. Bununla birlikte, i-hücrelerinin özelliklerinin Hydra ve Hydractinia ³ gibi temsili polip tipi hayvanlar arasında farklılık gösterdiği göz önüne alındığında, kök hücrelerin özelliklerinin ve işlevlerinin denizanası türleri arasında çeşitlendirilmesi mümkündür. Ayrıca, Clytia hariç, diğer denizanaları için deneysel teknikler sınırlandırılmıştır ve proliferatif hücrelerin ve kök hücrelerin ayrıntılı dinamikleri bilinmemektedir¹³.

Hidrozoan denizanası Cladonema pacificum, su pompası veya filtreleme sistemi olmadan laboratuvar ortamında tutulabilen yeni bir model organizmadır. Cladonema medusa, Cladonematidae ailesinde ortak bir özellik olan dallanmış dokunaçlara ve ampul^14'ün yakınındaki ektodermal tabakada ocellus adı verilen bir fotoreseptör organına sahiptir. Dokunaç dallanma süreci, dokunaçların adaksiyal tarafı boyunca görünen yeni bir dallanma bölgesinde meydana gelir. Zamanla, dokunaçlar uzamaya ve dallanmaya devam eder, eski dallar uç^15'e doğru itilir. Ek olarak, Cladonema dokunaçları amputasyondan sonra birkaç gün içinde yenilenebilir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, Cladonema^16,17'de dokunaç dallanmasında ve rejenerasyonunda çoğalan hücrelerin ve kök benzeri hücrelerin rolünü ortaya ^koymuştur. Bununla birlikte, geleneksel in situ hibridizasyon (ISH), Cladonema'daki gen ekspresyonunu görselleştirmek için kullanılırken, düşük çözünürlüğü nedeniyle, kök hücre dinamiklerini hücresel düzeyde ayrıntılı olarak gözlemlemek şu anda zordur.

Bu yazıda Cladonema'daki kök benzeri hücrelerin FISH ile görselleştirilmesi ve hücre proliferasyonunun bir belirteci olan EdU ile birlikte boyanması için bir yöntem açıklanmaktadır¹⁸. Bir kök hücre belirteci^olan 5,17 olan Nanos1'in ekspresyon paternini, tek hücre düzeyinde kök benzeri hücre dağılımının tanımlanmasına izin veren FISH tarafından görselleştiriyoruz. Ek olarak, Nanos1 ekspresyonunun EdU etiketlemesi ile birlikte boyanması, aktif olarak çoğalan kök benzeri hücrelerin ayırt edilmesini mümkün kılar. Hem kök benzeri hücreleri hem de proliferatif hücreleri izlemek için kullanılan bu yöntem, dokunaç dallanması, doku homeostazı ve Cladonema'da organ rejenerasyonu dahil olmak üzere çok çeşitli araştırma alanlarına uygulanabilir ve benzer bir yaklaşım diğer denizanası türlerine de uygulanabilir.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Prob sentezi

1. RNA ekstraksiyonu
   1. Yapay deniz suyunda (ASW) kültürlenmiş üç canlı Cladonema medusae'yi, ucu kesilmiş 3,1 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve mümkün olduğunca fazla ASW'yi çıkarın.
      NOT: ASW, mineral tuzların bir karışımını musluk suyunda klor nötrleştirici ile çözerek hazırlanır; nihai özgül ağırlık (S.G.) 1.018 veya bin başına parça (ppt) ~ 27'dir.
   2. RNaz aktivitesini inhibe etmek için 1,5 mL tüpleri sıvı azotta dondurun. 2-merkaptoetanolün (1 μL/100 μL lizis tamponu) eklendiği toplam RNA izolasyon kitinden 30 μL lizis tamponu ekleyin ve bir homojenizatör kullanarak lizis tamponundaki numuneleri homojenleştirin.
      NOT: Tamponun ve numunenin tüplerden taşmasını önlemek için, az miktarda lizis tamponu ile homojenizasyon önerilir.
   3. 570 μL lizis tamponu ekleyin ve toplam RNA izolasyon kitinin protokolünü takiben toplam RNA'yı çıkarın (Şekil 1).
   4. Ekstrakte edilen RNA'nın konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
2. cDNA sentezi
   1. Bir kit kullanarak, medusadan ekstrakte edilen toplam RNA'yı bir şablon olarak kullanarak cDNA'yı sentezleyin (Şekil 1 ve Tablo 1).
   2. 5 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
   3. Buz üzerinde hızla soğutun.
   4. Adım 1.2.1'den itibaren karışımla cDNA sentezi yapın (Tablo 1). Pipetleme ile iyice karıştırın ve 60 dakika boyunca 42 °C'de inkübe edin.
   5. 5 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin.
   6. Buz üzerinde hızla soğutun.
   7. Sentezlenen cDNA'nın konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün ve kullanıma kadar -20 ° C'de veya altında saklayın.
3. PCR ürün sentezi
   1. Bir PCR şablonu oluşturmak için, Primer-BLAST kullanarak belirli astarı tasarlayın. Referans dizisini NCBI verilerinden veya RNA-seq verilerinden elde edin.
      NOT: Bu protokolde kullanılan astarlar için Malzeme Tablosuna bakınız.
   2. Hedef diziyi yükseltmek için, kısıtlama enzimlerinin kullanılmasını gerektirmeyen TA klonlaması yapın. 3' ucunda bir adenin eklendiği bir PCR ürünü elde etmek için aşağıdaki ayarları kullanın: 2 dakika boyunca 98 °C; 10 s için 98 °C'lik 35 döngü, 30 s için 55-60 °C, 1 dakika boyunca 72 °C. Reaksiyonlar için Taq DNA polimeraz kullanın (Tablo 1).
      NOT: PCR koşullarını belirlemek için, genellikle önerilen tavlama sıcaklığı ve uzatma süresini sağlayan kullanılacak DNA polimerazına eşlik eden protokolü izleyin.
   3. PCR ürününü %1'lik bir agaroz jelinden geçirin ve ilgilendiğiniz bandı kesin. PCR ürünlerini bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak kesilmiş jellerden çıkarın.
4. Ligasyon
   1. Reaktifleri karıştırarak (Tablo 1) ve 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe ederek PCR ürününü vektöre 3' timin çıkıntıları ile bağlayın (Şekil 1).
      NOT: Vektör:PCR'nin moleküler oranı 1:>3 olmalıdır. pTA2 vektör boyutu yaklaşık 3 kb'dir. PCR ürünü (kesici uç) A (kb) ve B (ng/μL) ise, alınacak kesici ucun hacmi ([50 ng vektör × A kb kesici uç])/(3 kb vektör × [1/3 ]) = 50· Bir ng kesici uç. Kesici uç konsantrasyonu B ng / μL ise, alınan hacim 50 · A/B μL kesici uç.
5. Dönüşüm ve kaplama
   1. Dönüşüm için, yetkin hücreleri buz üzerinde çözün ve her biri 20 μL alikotlara dağıtın. PCR ürününü içeren plazmidlerin 1 μL'sini (yetkili hücre hacminin% 5'inden az) ve 1 s için vorteksi ekleyin. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve daha sonra 45 s için 42 ° C'de ve 1 s için vortekste inkübe edin.
   2. Yetkili hücrelere 180 μL Süper Optimal et suyu ile Katabolit bastırma (SOC) ortamı (besleyici açıdan zengin bir bakteri kültürü ortamı) ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 30 dakika sonra, yetkin hücreleri ampisilin, 5-bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D-galakto-piranosid (X-gal) ve izopropil-β-d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) içeren bir agar plakasına yayın ve 12-16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin (Şekil 1).
      NOT: X-gal ve IPTG, mavi ve beyaz kolonileri seçmek için kullanılır.
6. Sıvı kültür
   1. Plakadaki beyaz ve mavi kolonilerden beyaz bir koloni seçin. Ampisilin ile 3-5 mL LB ortamına ekleyin ve 37 ° C'de 12-16 saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin (Şekil 1).
7. Miniprep
   1. Plazmidi LB ortamından bir plazmid miniprep kullanarak çıkarın (Şekil 1).
   2. Plazmid konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün.
8. Diziyi okuyun.
   1. Plazmidin DNA dizisini okumak için, plazmidi Sanger dizilimi için gönderin ve ardından hedef dizinin uygun şekilde sentezlenip sentezlenmediğini doğrulamak ve hedef dizinin plazmidin içine hangi yönde yerleştirildiğini değerlendirmek için genom / transkriptom dizisi ile hizalamak için yazılım kullanın (5' ila 3' veya 3' ila 5').
      NOT: Hedef dizi, 3' ucuna yakın RNA polimeraz bağlanma bölgesinden 5' ila 3' yönünde plazmid içine yerleştirilirse, in vitro transkripsiyon ile bir antisens probu üretilebilir. Hedef dizi ters 3' ila 5' yönünde yerleştirilirse, bir duyu probu (negatif kontrol) oluşturulabilir. pTA2 gibi vektörler kullanılıyorsa, amaca bağlı olarak iki transkripsiyon bağlama bölgesi kullanılabilir.
9. İn vitro transkripsiyon
   1. Plazmiddeki RNA polimeraz bağlanma bölgesinin dışındaki primerleri (örneğin, T7 / T3 bağlanma bölgeleri) kullanarak PCR yaparak oluşturulan plazmidden DNA şablonunu hazırlayın (Şekil 1).
      NOT: M13-20 ileri astar ve M13 ters astar gibi üniversal primerler, RNA polimeraz bağlanma bölgelerini içeren bir DNA şablonu hazırlamak için kullanılabilir.
   2. PCR amplifikasyonundan sonra bir jel / PCR ekstraksiyon kiti kullanarak şablonu saflaştırın.
   3. Aşağıda gösterilen reaktifleri karıştırın ve transkripsiyon reaksiyonunu 3 saat boyunca 37 ° C'de gerçekleştirin (Şekil 1 ve Tablo 1).
   4. 1,5 μL DNaz ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   5. 10 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve bir temizleme sütunu kullanarak probu transkripsiyon reaksiyon çözeltisinden arındırın.
   6. % 1'lik bir agaroz jeli üzerine 1 μL yükleyerek sentezlenmiş RNA'nın boyutunu kontrol edin ve bir spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu belirleyin.
      NOT: Sentezlenmiş RNA probları en az 100 ng/μL konsantrasyona sahip olmalıdır.
   7. −20 °C'de veya altında depolamak için 30 μL formamid ekleyin.

2. EdU kuruluşu ve tespiti

1. Cladonema medusae'yi (tüp başına 5-10 hayvan) 3,5 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak 1,5 mL'lik tüplere yerleştirin ve toplam 500 μL hacme kadar ASW ekleyin. 7,5 μL 10 mM EdU stok çözeltisi ekleyin ve numuneleri 22 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin (Şekil 2). EdU nihai konsantrasyonu 150 μM'dir.
   NOT: Üçüncü dal oluşumunu izlemek için 5-7 günlük medusae kullanın (Şekil 3A). Medusae'nin polipten ayrıldığı gün 1. gün olarak sayılır ve 5. günde, medusae tipik olarak ana dokunaçlarında üçüncü bir dal sergilemeye başlar.
2. 1 saat sonra, mümkün olduğunca çok EdU içeren ASW'yi çıkarın.
3. Medusayı anestezik etmek için,_H2 O'ya% 7 MgCl₂ekleyin ve 5 dakika boyunca inkübe edin.
4. _H2 O'da% 7 MgCl 2'yi çıkarın ve medusae'yi ASW'de% 4 paraformaldehit (PFA) ile% 4 ° C'de gece boyunca (O.N.) sabitleyin (Şekil 2).
   NOT: EdU dahil edilmeden FISH yapılırken, numuneler anesteziden sonra EdU ile tedavi edilenlere benzer şekilde sabitlenebilir (adım 2.3-2.4).

3. Floresan in situ hibridizasyon

1. Proteinaz tedavisi ve fiksasyon sonrası
   1. PFA'yı çıkarın ve numuneleri 3 x 10 dakika boyunca %0,1 Ara-20 (PBST) içeren PBS ile yıkayın. Yıkama başına 300-500 μL PBST kullanın.
      NOT: Bu adımdan hibridizasyonun sonuna kadar, deney eldiven ve maske takılarak RNase içermeyen bir ortamda gerçekleştirilmelidir. Bu adımdaki 1x PBS, DEPC ile arıtılmış su ile yapılmalıdır. Hibridizasyondan sonra, DEPC arıtımı olmadan su ile yapılan 1x PBS kullanılabilir. Bazı ISH ve FISH protokolleri, metanol adımlarını kullanarak numuneleri kurutur, bu da sabit numunelerin kullanıma kadar -20 ° C'de saklanmasını mümkün kılar. Gereksiz işlerden kaçınmak için, özellikle numuneler PBST'de birkaç güne kadar tutulabildiğinden, dehidrasyon işlemi bu protokolden çıkarılmıştır.
   2. Fiksasyondan sonra, numuneyi anti-DIG-POD antikoru O.N. inkübasyon adımı (adım 3.4.2) hariç, bir çalkalayıcı üzerindeki 1.5 mL tüplere yerleştirin. Yıkadıktan sonra, PBST'ye 10 mg / mL Proteinaz K stok çözeltisi ekleyin ve medusae'yi 10 dakika boyunca 37 ° C'de Proteinaz K (son konsantrasyon: 10 μg / mL) ile inkübe edin.
   3. Proteinaz K çözeltisini çıkarın ve numuneleri PBST ile 2 x 1 dakika yıkayın.
   4. Medusae'yi postfix etmek için, 1x PBS'ye% 4 PFA ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   5. PFA çözeltisini çıkarın ve numuneleri PBST ile 2 x 10 dakika yıkayın.
      NOT: Hedef gen düşük arka plan sinyaliyle yüksek oranda ifade edilirse, 3.1.2-3.1.5 adımları atlanabilir.
2. Hibridizasyon
   1. PBST'yi çıkarın ve Hibridizasyon Arabelleği ekleyin (HB Arabelleği, Tablo 1). HB Buffer'daki numuneleri oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca inkübe edin. Başarılı bir hibridizasyon için yeterli hacim sağlayan 300-400 μL HB Arabelleği kullanın.
      NOT: HB Buffer, Wash Buffer 1 ve Wash Buffer 2, 20x SSC stoğu ile hazırlanmıştır. HB Arabelleği -20 °C'de veya altında depolanır ve kullanılmadan önce RT'ye getirilmelidir.
   2. HB Arabelleğini çıkarın ve yeni HB Arabelleği ekleyin. Bir hibridizasyon inkübatöründe en az 2 saat boyunca 55 ° C'de ön hibridize edin.
   3. HB Arabelleğini çıkarın ve adım 1.9.7'de depolanan probları içeren HB Arabelleği ile inkübe edin (son prob konsantrasyonu: HB Arabelleğinde 0,5-1 ng/μL). Bir hibridizasyon inkübatöründe 18-24 saat boyunca 55 °C'de hibridize edin (Şekil 2).
      NOT: FISH sinyal yoğunluğu ve özgüllüğü, hedef gen ekspresyonunun yanı sıra prob uzunluğu ve özgüllüğü nedeniyle değişebilir. Yoğunluğu arttırmak için hibridizasyon süresi (18-72 saat) ve sıcaklık (50-65 °C) gibi parametreler ayarlanabilir ve farklı problar test edilebilir. Spesifik olmayan sinyallerden kaçınmak için, Proteinaz K tedavisi (konsantrasyon ve süre) değiştirilebilir¹⁹.
3. Prob çıkarma
   1. HB Arabelleği içeren probları çıkarın ve ardından Yıkama Arabelleği 1'i ekleyin (Tablo 1). Numuneleri Yıkama Tamponu 1 ile 55 °C'de 2 x 15 dakika boyunca yıkayın. 300-400 μL yıkama tamponu kullanın.
      NOT: HB Buffer içeren problar, yaklaşık on defaya kadar tekrar tekrar kullanılabilir. Atmak yerine, kullanılan HB Buffer içeren probları -20 ° C'de veya altında saklayın. Kullanmadan önce Yıkama Tamponu 1, Yıkama Tamponu 2, 2x SSC ve PBST'yi 55 °C'de önceden ısıtın.
   2. Yıkama Tamponu 1'i çıkarın ve ardından Yıkama Tamponu 2'yi ekleyin (Tablo 1). Numuneleri Yıkama Tamponu 2 ile 55 °C'de 2 x 15 dakika boyunca yıkayın.
   3. Yıkama Arabelleği 2'yi çıkarın ve ardından 2x SSC ekleyin. Numuneleri 55 °C'de 2 x 15 dakika boyunca 2x SSC ile yıkayın.
   4. 2x SSC'yi kaldırın ve önceden ısıtılmış PBST'yi ekleyin. Numuneleri RT'de PBST ile 1 x 15 dakika yıkayın.
4. Anti-DIG antikor inkübasyonu
   1. PBST'yi kaldırın ve% 1 engelleme arabelleği ekleyin. Bir rocker üzerinde yavaşça sallanırken numuneleri RT'de en az 1 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: %5 bloke edici tampon stoğunu seyrelterek %1 bloke edici tamponu taze olarak hazırlayın (Tablo 1). Bir sonraki antikor reaksiyonundan önce numuneleri kontrol edin, çünkü numune sallanmanın bir sonucu olarak kapağın arkasına veya duvara yapışma eğilimindedir.
   2. Bloke ettikten sonra,% 1 bloke edici tamponu çıkarın, anti-DIG-POD çözeltisi ekleyin (1:500,% 1 bloke edici tamponda) ve numuneleri 4 ° C'de inkübe edin (Şekil 2).
      NOT: Spesifik olmayan sinyallerin algılanmasını önlemek için kuluçka süresini 12-16 saat içinde tutmaya dikkat edin.
5. DIG etiketli probun algılanması
   1. Anti-DIG-POD çözümünü kaldırın ve Tris-NaCl-Tween Arabelleği ekleyin (TNT, Tablo 1). Numuneleri TNT ile RT'de 3 x 10 dakika yıkayın.
      NOT: tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) tekniğinin kullanılması, yaban turpu peroksidaz etiketli reaktiflere (örneğin, anti-DIG-POD) karşı daha iyi çözünürlüklü bir görüntü sağlar.
   2. Aktif Cy5-tiramid çözeltisini yapmak için amplifikasyon seyreltici tamponunda floresan boya konjuge tiramid (Cy5-tiramid) stok çözeltisini (1:50) seyreltin (Şekil 2).
   3. Mümkün olduğunca çok TNT'yi çıkarın ve ardından aktif Cy5-tiramid çözeltisini ekleyin. Örnekleri karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin.
   4. Numuneleri karanlıkta 3 x 10 dakika boyunca PBST ile yıkayın.
6. EdU'nun Tespiti
   NOT: EdU kiti, dahil edilmiş EdU'yu floresan sinyaller olarak algılar (Şekil 2).
   1. EdU algılama kokteylini hazırlamak için, bileşenleri Tablo 1'de gösterildiği gibi karıştırın. Her numune için 100 μL EdU algılama kokteyli kullanın.
      NOT: 10x Reaksiyon Tamponu katkı maddesini ultra saf su ile seyrelterek 1x Reaksiyon Tamponu katkı maddesi hazırlayın.
   2. PBST'yi kaldırın ve ardından EdU algılama kokteylini ekleyin. 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya yatın.
   3. PBST ile karanlıkta 3 x 10 dakika yıkayın.
7. DNA boyama
   1. Hoechst çözeltisini hazırlamak için PBST'de Hoechst 33342'yi (1:500) seyreltin. PBST'yi kaldırın ve Hoechst çözümünü ekleyin. Örnekleri karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin (Şekil 2).
   2. Numuneleri karanlıkta 3-4 x 10 dakika boyunca PBST ile yıkayın.
8. Montaj
   1. Numunenin ezilmesini önlemek için cam kaydırağın üzerine bir banka açın. Cam slayda vinil bant uygulayın ve ortayı oyun.
   2. Medusae'yi, ucu kesilmiş 3,1 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak sürgülü camdaki bankaya aktarın.
      NOT: Dokunaçların üst üste binmesine izin vermemeye dikkat edin.
   3. Herhangi bir PBST'yi P200 pipetle çıkarın ve ardından montaj ortamı olarak yavaşça% 70 gliserol ekleyin (Şekil 2).
      NOT: Floresanın solmasını önlemek için% 70 gliserol yerine, solmaya karşı önleyici montaj ortamı kullanılabilir.
   4. Medusae üzerine forseps ile yavaşça bir örtü parçası yerleştirin ve kapak kaymasının yan tarafını şeffaf oje ile kapatın.
   5. Hemen mikroskopi gözlemi yapmamak için slaytları karanlıkta 4 ° C'de tutun.
9. Görüntüleme
   1. Görüntü elde etmek için lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın. Tek hücreli çözünürlük için, 40x yağlı lens veya daha yüksek büyütme için bir lens kullanın.
   2. Görüntü alımından sonra, ImageJ/FIJI yazılımını kullanarak görüntüleri açın ve çok noktalı araç²⁰ ile EdU+ ve/veya Nanos1⁺ için pozitif olan hücreleri sayın.

Kladonoma dokunaçları, morfogenez ve rejenerasyonun hücresel süreçlerini incelemek için bir model olarak kullanılmıştır^15,16,17. Tentacle yapısı, kök benzeri hücrelerin veya i-hücrelerinin, dokunaç ampulü adı verilen proksimal bölgede bulunduğu ve ampulün distal bölgesinin arkasına adaksiyal taraf boyunca sırayla yeni dalların eklendiği bir epitel tüpünden oluşur (Şekil 3A)¹⁵. Önceki raporlar, hücre proliferasyonunun hem dokunaç ampulünde hem de^16,17 etiketli EdU veya BrdU kullanılarak yeni dallanma bölgelerinde aktif olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, in situ hibridizasyonun çözünürlüğü nedeniyle, kök benzeri hücrelerin gerçekten proliferatif olup olmadığı belirsizdir. Hem kök benzeri hem de proliferatif hücreleri hücresel düzeyde aynı anda görselleştirmek için, kök hücre belirteçleri (Nanos1 veya Piwi) için FISH ve aynı örneklerdeki S faz hücreleri için EdU etiketlemesi gerçekleştirdik.

FISH tarafından hücresel çözünürlükte, Nanos1'in ekspresyonu dokunaç ampulünde ve yeni dallanma bölgesinde lokalize edildi (Şekil 3B). Piwi ayrıca dokunaç ampulünde ve yeni dallanma bölgesinde Nanos1'inkine benzer bir desende ifade edildi (Şekil 3C). Bu sonuçlar,⁷ günlük bir medusa'nın tomurcuklanan dalının Nanos1 ve Piwi tarafından neredeyse eşit şekilde etiketlendiği önceki bir rapor 17'deki tam montajlı in situ hibridizasyondan elde edilen gözlemlerle tutarlıydı. Kök benzeri hücrelerin birikiminin başlangıcını görselleştirmek için, 5 günlük bir medusanın yeni dallanma bölgesini izledik. Nanos1 ekspresyonu ve EdU-pozitif hücrelerin birlikte etiketlenmesi, dokunaçtaki kök benzeri hücrelerin ve proliferatif hücrelerin uzamsal modelini ortaya çıkardı (Şekil 4A). EdU + ve Nanos1 ⁺ hücrelerinin brüt dağılımları önceki raporlar^16,17 ile tutarlı olmasına rağmen, EdU + hücreleri dokunaç ampulü boyunca, en azından dallanmanın başlangıcında daha yaygın olarak dağılırken^, Nanos1 ⁺ hücreleri dokunaç ampulünde ve yeni dallanma bölgesinde daha lokal olarak birikmiştir (Şekil 4A ve Şekil 4E ). Bu gözlemler, kök benzeri hücrelerin ve çoğalan hücrelerin farklı dağılımlarının, gelişimsel zamanlamaya ve farklı aşamalara bağlı olarak tespit edildiğini göstermektedir.

Ampulün ve yeni dallanma bölgesinin daha ayrıntılı bir görünümü, EdU sinyallerinin nükleer boyama ile birleştiğini, oysa Nanos1 ekspresyonunun, önceki bir rapor⁵ ile tutarlı olarak, çekirdeği çevreleyen sitoplazma ile sınırlı olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 4B, C). Hücrelerin bir kısmı (%19.79) EdU ve Nanos1'un (EdU+ Nanos1⁺; Şekil 4B, C, sarı ok uçları ve Şekil 4D), bu hücrelerin aktif olarak çoğalan bir kök hücre popülasyonu olduğunu düşündürmektedir. İlginç bir şekilde, hücrelerin% 14.46'sının ampulün ortasında ve yeni dallanma bölgesinde EdU ⁺ Nanos1 ^- olduğu bulundu, bu da kök benzeri olmayan proliferatif hücrelerin varlığını düşündürdü (Şekil 4B, C, beyaz oklar ve Şekil 4D). Buna karşılık, hücrelerin% 26.32'sinin ampulün tabanında ve yeni dallanma bölgesinde EdU-Nanos1 ⁺ olduğu gözlendi, bu da yavaş döngülü veya sessiz bir kök hücre popülasyonunun varlığını gösteriyordu, bunların hiçbiri EdU nabız etiketlemesi ile tespit edilmedi (Şekil 4B, C, sarı oklar ve Şekil 4D).

Şekil 1: İn situ hibridizasyon için prob sentezinin şeması. Medusadan total RNA'nın ekstraksiyonu ve total RNA'dan cDNA sentezi. Nanos1'e özgü PCR ürünleri cDNA'dan sentezlendi. PCR ürünleri vektörlere bağlandı ve güçlendirilmiş vektörler yetkin hücre kültürü yoluyla toplandı. RNA polimeraz bağlanma bölgelerine sahip PCR ürünleri, plazmidler şablon olarak kullanılarak sentezlendi. DIG etiketli RNA probları in vitro transkripsiyon ile sentezlendi. Kısaltmalar: DIG = digoxigenin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: EdU şeması ve floresan in situ hibridizasyon ko-boyama. Medusae, 1 saat boyunca 150 μM EdU ile inkübe edildi. Daha sonra, medusae_H2 O'da% 7 MgCl 2 ile uyuşturuldu (dokuyu gevşetmek için) ve4 ° C'de% 4 PFA O.N. ile sabitlendi. Fiksasyondan sonra, numuneler 55 ° C'de 20-24 saat boyunca bir prob ile HB Buffer ile hibridize edildi. Hibridizasyon reaksiyonundan sonra, numuneler 4 ° C'de anti-DIG-POD çözeltisi O.N. ile yıkandı ve inkübe edildi. Medusae 10 dakika boyunca Cy5-tiramid çözeltisi ile boyandı, ardından 30 dakika boyunca EdU'nun tespiti ve 30 dakika boyunca Hoechst 33342 ile boyandı. Tüm boyama işlemleri tamamlandıktan sonra, medusae cam slayt üzerine monte edildi ve konfokal mikroskopla görüntüler elde edildi. Kısaltmalar: EdU = 5-etinil-2'-deoksiüridin; FISH = floresan in situ hibridizasyon; PFA = paraformaldehit; O.N. = geceleme; HB = hibridizasyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 3: Cladonema medusa dokunaçlarının proksimal adaksial tarafındaki nanos1 ve Piwi ekspresyon kalıpları. (A) Bir Cladonema medusa ve dokunaçlarının şeması. Dokunaçların adaksiyal tarafı: yeni dallanma bölgesinde sırayla oluşturulan yeni dallara sahip dokunaç ampulü (en proksimal bölge). İç kısım (kesikli kare), konfokal görüntü tarafından yakalanan alanı gösterir. (B) 7 günlük bir Cladonema medusa'nın dokunaçlarının proksimal, adaksiyal tarafından Nanos1 gen ekspresyonunun FISH görüntüleri. (C) 7 günlük bir Cladonema medusa'nın dokunaçlarının proksimal, adaksiyal tarafından Piwi gen ekspresyonunun FISH görüntüleri. DNA: yeşil, Nanos1: macenta. Sadece Nanos1 FISH görüntüleri için B'-C'. Ölçek çubukları = 100 μm (B,C). Kısaltma: FISH = floresan in situ hibridizasyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Cladonema medusa dokunaçlarının proksimal, adaksiyal tarafındaki EdU ve Nanos1 ekspresyon kalıpları. (A-C) Cladonema medusa dokunaçlarının proksimal adaksiyal tarafının Nanos1 ekspresyonu ve EdU ile birlikte etiketlenmiş görüntüleri; 5 günlük medusae kullanıldı. (A) Dokunaçlara genel bakış. Sarı kesikli kareler B ve C alanlarını gösterir. (B) Dokunaç ampulünün büyütülmesi. (C) Yeni bir dallanma alanının büyütülmesi. Sarı ok uçları, hem EdU hem de Nanos1 için pozitif olan hücreleri gösterir. Sarı oklar sadece Nanos1 için pozitif olan hücreleri gösterir. Beyaz oklar, hücrelerin yalnızca EdU için pozitif olduğunu gösterir. A-C panelleri, DNA (mavi), EdU (yeşil) ve Nanos1 (macenta) için birleştirilmiş görüntülerdir. A'-C' yalnızca EdU görüntüleri için panellerdir; A''-C'' sadece Nanos1 FISH görüntüleri içindir. Ölçek çubukları = 100 μm (A), 50 μm (B, C). (D) Dokunacın bazal tarafındaki EdU ve / veya Nanos1 pozitif hücrelerin nicelleştirilmesi (nicelleştirme alanı = 30.10 μm² kare, n = 6, toplam 249 hücre). EdU ⁺ Nanos1 ⁻ hücreleri,% 14.46; EdU + Nanos1 ⁺ hücreleri,% 19.79; EdU⁻ Nanos1⁺ hücreler, %26,32; EdU-Nanos1-hücreler,% 39.44. (E) Adoksiyal taraftan bir Cladonema medusa dokunaçlarının şeması. EdU + hücrelerinin ve Nanos1 ⁺ hücrelerinin genel dağılımı sırasıyla E ve E ' olarak gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Bu protokolde farklı PCR reaksiyonlarının ve tamponlarının bileşimi. Ligasyon reaksiyonundaki PCR ürününün (X μL) hacmini hesaplamak için, protokol adım 1.4'ten sonraki nota bakın. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Proliferasyon yapan hücreler ve kök hücreler morfogenez, büyüme ve rejenerasyon gibi çeşitli süreçlerde önemli hücresel kaynaklardır^21,22. Bu yazıda kök hücre belirteci Nanos1'in Cladonema medusae'de FISH ve EdU etiketlemesi ile birlikte boyanması için bir yöntem açıklanmaktadır. EdU veya BrdU etiketlemesini kullanan önceki çalışmalar, proliferatif hücrelerin dokunaç ampulleri^16,17'ye lokalize olduğunu^, ancak moleküler özelliklerinin belirsiz olduğunu öne sürdü. Bu çalışma, proliferatif hücrelerin dağılımının ve Nanos1⁺ kök benzeri hücrelerin lokalizasyonunun eşzamanlı olarak belirlenmesini göstermektedir (Şekil 4). Sonuçlar, bazı proliferatif hücrelerin Nanos1'u ifade ettiğini, ancak diğer hücrelerin sadece EdU ile işaretlendiğini ve Nanos1'u ifade etmediğini, kök hücre heterojenliğinin veya potansiyel olarak diğer proliferatif hücrelerin varlığını gösterdiğini gösterdi. Cladonema'da dokunaç dallanması, doku homeostazı, organ rejenerasyonu ve germ hücresi bakımı dahil olmak üzere farklı işlemler sırasında ayrıntılı kök hücre dağılımını incelemek ilginç olacaktır.

Hayvanlarda kök hücrelerin görselleştirilmesi için en büyük darboğaz, kök hücre belirteçlerinin ilk tanımlanmasıdır. Cnidarians'ta, kök hücre belirteçleri hidrozoan olmayan^3'te tanımlanmamıştır ve bu nedenle, bu aşamada, kök hücre belirteçleri için FISH'in doğrudan uygulanması hidrozoanlarla sınırlı kalmaktadır. Bununla birlikte, FISH, hücresel düzeyde spesifik gen ekspresyonunun tespit edilmesine izin verir ve bu nedenle, probları değiştirerek, bu yöntem, ilgilenilen herhangi bir genin mekansal ekspresyon kalıplarını ayrıntılı olarak gözlemlemek için genişletilebilir. Örneğin, progenitör hücrelerin ve farklılaşmış hücrelerin belirteçlerini kullanarak, Cladonema dokunaçlarındaki spesifik hücre tiplerinin dağılımını doğrulayabiliriz. Bir uyarı olarak, mevcut protokolün, ekspresyon seviyelerindeki ve mRNA stabilitesindeki farklılıklar nedeniyle ilgilenilen genlere bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilir. Özellikle, spesifik olmayan sinyaller ve zayıf sinyaller FISH ile ilişkili yaygın sorunlardır. Hibridizasyon süresini ve sıcaklığını değiştirmek, ağartma reaktifleri (formamid veya metanol) kullanmak ve diğer parametreleri ayarlamak (TSA reaksiyon süresi, Proteinaz K işlemi, hibridizasyondan sonra yıkama) daha net sinyaller ve daha az spesifik olmayan sinyal^{verebilir 23,24}. Kullanılan hayvan modeline uygun bir FISH protokolü seçmek de önemlidir, çünkü bir FISH protokolü aynı takson ^7,25,26 içinde bile diğer türlere uygulanamayabilir.

EdU etiketlemesi genellikle proliferatif hücreleri tespit etmek için kullanılır, ancak konsantrasyonu ve inkübasyon süresini değiştirerek farklı deneysel amaçlar için kullanılabilir²⁷. Çoğalan hücreleri tespit etmek için, EdU kuruluşu için başarılı bir süre ve konsantrasyon belirlemek çok önemlidir. Bu çalışmada kullanılan nabız etiketlemesinde, sadece kısa bir süre için S fazından geçen proliferatif hücreler işaretlenmiş ve diğer cnidarian'larda çoğalan hücreleri tespit etmek için benzer kısa inkübasyon yöntemleri kullanılmıştır 6,28,29. Buna karşılık, uzun süreli EdU birleşmesi ve Nanos1 FISH'in kombinasyonu, yavaş döngülü veya sessiz kök hücrelerin varlığını ortaya çıkarabilir²⁷. Sadece proliferatif hücreleri değil, aynı zamanda DNA sentezine uğramış endosiklasyon hücrelerini de bölünmeden işaretlemek mümkündür. Ayrıca, EdU etiketli hücreleri daha uzun süre izleyerek, proliferatif hücreler ve hücre soyları ^6,30 ile ilişkili göç ve farklılaşma için hücresel kapasiteyi belirleyebiliriz.

FISH ve EdU veya BrdU boyama kombinasyonu ^7,31 kullanılırken, burada kurulan yöntem, farklı denizanası türleri de dahil olmak üzere diğer deniz omurgasızlarına ve model olmayan hayvanlara kolayca uygulanabilir. EdU boyama, BrdU boyama^18'den daha basit ve daha hassastır ve kısa süreli inkübasyonuyla, uzun süreli hücre etiketleme⁷ için EdU'yu kullanan önceki çalışmanın aksine, çoğalan hücrelerin tespit edilmesini sağlar. Son yıllarda, yeni nesil dizileme teknolojilerinin ilerlemesiyle, genom ve gen ekspresyon bilgileri birçok tür için kullanılabilir hale gelmiştir. Kök hücrelerin ve proliferatif hücrelerin tanımlanması, kök hücre heterojenliğini ve çeşitliliğini anlamak ve farklı biyolojik fenomenlerin altında yatan hücresel dinamikler hakkında fikir vermek için etkili bir yaklaşım olmaya devam edecektir.

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışma AMED tarafından JP22gm6110025 Hibe Numarası altında (YN'ye) ve JSPS KAKENHI Hibe Numarası 22H02762 (YN'ye) tarafından desteklenmiştir.