Vasküler Görselleştirme için Çift Raster Taramalı Fotoakoustik Küçük Hayvan Görüntüleyici

Geniş alan görüntüleme ve gerçek zamanlı görüntülemeyi entegre eden çift raster taramalı fotoakoustik görüntüleyici tasarlanmıştır.

Vasküler ağların küçük hayvanlar üzerinde görüntülenmesi temel biyomedikal araştırmalarda önemli rol oynamıştır. Fotoakoustik görüntüleme teknolojisi, küçük hayvanların görüntübiliminde büyük bir uygulama potansiyeline sahiptir. Küçük hayvanların geniş alan fotoakoustik görüntülemesi, yüksek mekansal çözünürlük, derin penetrasyon ve çoklu kontrastlarla görüntüler sağlayabilir. Ayrıca, gerçek zamanlı fotoakoustik görüntüleme sistemi, küçük hayvan fizyolojik özelliklerinin dinamik izlenmesini araştırmak için kullanılabilecek küçük hayvan vaskülatının hemodinamik faaliyetlerini gözlemlemek için arzu edilir. Burada, değiştirilebilir çift modlu görüntüleme işlevine sahip çift raster taramalı bir fotoakoustik görüntüleyici sunulmaktadır. Geniş alan görüntüleme iki boyutlu motorlu çeviri aşaması ile yönlendirilirken, gerçek zamanlı görüntüleme galvanometreler ile gerçekleştirilir. Farklı parametreler ve görüntüleme modları ayarlanarak, küçük hayvan damar ağının in vivo görselleştirmesi yapılabilir. Gerçek zamanlı görüntüleme, ilaç kaynaklı vb. Geniş alan görüntüleme tümör vaskülatının büyüme değişimini izlemek için kullanılabilir. Bunlar temel biyotıp araştırmalarının çeşitli alanlarında benimsenmesi kolaydır.

Temel biyomedikal alanda, küçük hayvanlar insan fizyolojik işlevini simüle edebilir. Bu nedenle, küçük hayvan görüntüleme, insan homolog hastalıklarının araştırılmasına rehberlik etme ve etkili tedavi arayışında önemli bir rol oynar¹. Fotoakoustik görüntüleme (PAI), optik görüntüleme ve ultrason görüntülemenin avantajlarını birleştiren invaziv olmayan bir görüntüleme tekniğidir². Fotoakoustik mikroskopi (PAM), küçük hayvanların temel araştırmaları için değerli bir görüntüleme yöntemidir³. PAM, optik uyarlama ve ultrason algılamaya dayalı olarak yüksek çözünürlüklü, derin penetrasyon, yüksek özgüllük ve yüksek kontrastlı görüntüleri kolayca elde edebilir⁴.

Belirli bir dalga boylarına sahip bir darbe lazeri, dokuların endojen kromoforları tarafından emilir. Daha sonra, dokunun sıcaklığı yükselir, bu da fotoğraf kaynaklı ultrasonik dalgaların üretimiyle sonuçlanır. Ultrasonik dalgalar ultrasonik dönüştürücü tarafından tespit edilebilir. Sinyal alımı ve görüntü rekonstrüksiyonundan sonra emicinin mekansal dağılımı elde edilebilir⁵. Bir yandan, tüm organ damar ağının görselleştirilmesi geniş bir görüş alanı gerektirir. Geniş alan tarama işlemi genellikle yüksek çözünürlüklü 6 ,^7,8sağlamak için uzun zaman alır. Öte yandan, küçük hayvanların hemodinamik aktivitelerini gözlemlemek hızlı gerçek zamanlı görüntüleme gerektirir. Gerçek zamanlı görüntüleme, küçük hayvanların yaşamsal belirtilerini gerçek zamanlı olarak incelemek için faydalıdır^9,10,11. Gerçek zamanlı görüntülemenin görüş alanı genellikle yüksek bir güncelleme oranı sağlamak için yeterince küçüktür. Bu nedenle, genellikle geniş bir görüş alanına ulaşmak ve gerçek zamanlı görüntüleme arasında bir denge vardır. Daha önce, geniş alan görüntüleme veya gerçek zamanlı görüntüleme için ayrı ayrı iki farklı sistem kullanılmıştır.

Bu çalışma, iki boyutlu motorlu çeviri aşamasına ve iki eksenli galvanometre tarayıcısına dayalı gerçek zamanlı görüntülemeye dayalı geniş alan görüntülemeyi entegre eden çift raster taramalı fotoakoustik görüntüleyici (DRS-PAI) rapor eder. Geniş alan görüntüleme modu (WIM) vasküler morfolojiyi göstermek için gerçekleştirilir. Gerçek zamanlı görüntüleme modu (RIM) için şu anda iki işlev vardır. İlk olarak, RIM gerçek zamanlı B tarama görüntüleri sağlayabilir. Vaskülatın derinlik yönü boyunca yer değiştirmesi ölçülerek, solunum veya nabız özellikleri ortaya çıkabilir. İkinci olarak, RIM WIM görüntüsündeki belirli alanı nicel olarak ölçebilir. Yerel WIM bölgelerinin karşılaştırılabilir görüntülerini sağlayarak, yerel değişikliğin ayrıntıları doğru bir şekilde ortaya çıkabilir. Sistem, vasküler görselleştirmenin geniş alan görüntülemesi ile yerel dinamiğin gerçek zamanlı görüntülenmesi arasında esnek bir geçiş tasarlar. Sistem, küçük hayvan görüntülemeye ihtiyaç duyulan temel biyomedikal araştırmalarda arzu edilir.

Tüm hayvan deneyleri, Güney Çin Normal Üniversitesi, Guangzhou, Çin'in kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından sağlanan yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Sistem Kurulumu

1. Optik yol (Şekil 1)
   1. Sistem lazer kaynağı olarak 532 nm darbe lazer kullanın. Lazerin tekrarlama hızını 10 kHz, çıkış enerjisini %100 ve tetik ayarını kullanıcı tanımlı bir program kullanarak harici tetikleyici olarak ayarlayın.
   2. Lazer ışınını optik fiber bağlayıcı (FC1) ile tek modlu fibere (SMF) birleştirir. Lazer ışınını iki boyutlu motorlu bir aşamada (Motor, maksimum hız: 20 mm/sn) optik fiber kolimatör (FC2) kullanarak işle.
   3. İki eksenli galvanometre tarayıcı (Galva) kullanarak lazer ışınını saptırın. Işını yansıtmak için hareket ettirilebilir bir ayna (M1) kullanın. Işını 4 × objektif bir mercekle odakla (OL, Sayısal diyafram: 0.1).
   4. Kendi kendine yapılan içi boş ultrasonik dönüştürücüyü (UT, Merkezi frekans: 25 MHz) düzeltmek için bir XY çevirmen montajı (TM) kullanın; Bant genişliği: %90'dan fazla; Orta delik: 3 mm) OL^12'nindibinde. Odaklanmış kirişi ultrasonik dönüştürücünün orta deliğinden geçirin.
2. Tarama yolu
   1. GALVA'yı WIM sırasında alan programlanabilir bir kapı dizisi (FPGA 2) kullanarak kilitleyin. Kullanıcı tanımlı bir program tarafından uygun tarama aralığını ve tarama hızını ayarlayın.
   2. RIM sırasında sahada programlanabilir bir kapı dizisi (FPGA 1) kullanarak Motoru kilitleyin. FPGA 2 kullanarak tarama sıklığını ve tarama noktalarının sayısını ayarlayın. Başlatmayı denetlemek ve taramayı durdurmak için kullanıcı tanımlı bir program kullanın.
3. Veri toplama
   1. PA sinyalini yükseltmek için 50 dB amplifikatör (AMP) kullanın. Sinyali veri toplama kartına (DAQ) göre dijitalleştirin. Tetik sinyalini FPGA 1 veya FPGA 2 üzerinden alın.
   2. Verileri işlemek ve görüntüleri paralel olarak görüntülemek için bir grafik işlem birimi (GPU) kullanın¹³.
4. CCD görüntüleme sistemi
   1. Halka şeklinde beyaz bir LED kullanın (Renk sıcaklığı: 6500 K; Illuminance: 40000 lüks; Çap: 7,5 cm) aydınlatma kaynağı olarak. M1'i çıkarın, ışığı yansıtmak için sabit bir ayna (M2) kullanın.
   2. Görüntüleri PA görüntüleme sistemine ccd kamera (6,3 milyon piksel) kullanarak kaydedin. Görüntüleri bir görüntüleme yazılımıyla görüntüleyin.

2. Sistem hizalaması

1. Bir su deposu seçin (10 cm × 10 cm × 4,4 cm; alt pencere: 3 cm × 3 cm). Tüm su deposunu bir polietilen membran (membran kalınlığı: 10 μm) kullanarak örtün. Yeterli ultra saf su ekleyin.
2. Su haznesini çalışma aşamasına yerleştirin.
3. Lazer anahtarını aç. Lazer kontrol programını seçin. 5 dakika önceden ısıtın. Pompalama düğmesindeki "AÇ" düğmesine basın. Lazer parametrelerini adım 1.1.1'e göre ayarlayın. Lazerin şaşkınlıklarını aç.
4. Toplanan A satırı programını seçin. Tek nokta sinyalini yakalamak ve mevcut A-line sinyalinin genliğini ve spektrumu görüntülemek için "Başlat" düğmesine basın.
5. Su deposunun dibine bir bıçak yerleştirin. Akustik bağlantı için UT'nin alt kısmını su haznesi içine daldırın. UT'nin alt kısmında kabarcıklardan kaçının.
6. Galva'nın konumunu ayarlayın, salınım sinyalini önlemek için UT ve OL arasındaki XY çevirmenini ayarlayın ve bunun konfokal olduğundan emin olun.
7. Sinyalin genliğini en üst düzeye çıkarmak için çalışma aşamasının yüksekliğini ayarlayın ve odak konumunu belirleyin.

3. Hayvan deneyi

1. Vücut ağırlığı 20\u201230 g olan 5\u20126 haftalık balb/c fare kullanın.
2. Deneyden önce intraperitoneally enjekte edilen üretan (1 g/kg) kullanarak hayvanı uyuşturun.
3. WIM ve RIM arasında geçiş gerçekleştirin.
   1. Düzlemsel ultrasonik dönüştürücü kullanın. Düzeltici ve depilatör krem kullanarak farenin sırtındaki kürkü tıraş edin. Fareyi tutucunun üzerine (8 cm × 2,8 cm × 2 cm) eğilimli konumda yerleştirin.
   2. Ultrason jeli kullanarak görüntüleme bölgesinin polietilen membranla temas etmesine izin verin. Temas kısmında kabarcıklardan kaçının.
   3. Tutucuyu akustik bağlantı için çalışma sahnesine yerleştirin. Lazeri başlatmak ve A hattı sinyali toplamak için 2.3\u20122.4 adımlarını izleyin. Hizalamak için 2.6\u20122.7 adımlarını izleyin. Hizalamadan sonra koleksiyonu sonlandırmak için "Dur" tuşuna basın.
   4. WIM programını seçin. Yeni oluşturulan klasörü adlandırın. Tarama parametresini "Tarama Hızı" sekmesinde 20 mm/sn, "Tarama Alanı" sekmesinde "20 mm*20 mm" ve "Adım" sekmesinde "20" olarak ayarlayın. Taramaya başlamak için Topla düğmesini tıklatın.
   5. Edinimden sonra taramayı sonlandırmak için Durdur düğmesini tıklatın. Motoru sıfıra getirmek için Sıfıra Döndür'ü tıklatın. Lazer şaşkınlıklarını kapatın. Tetikleyici ayarını dahili tetikleyici olarak ayarlayın. Pompalama düğmesi için KAPA düğmesine basın.
   6. WIM tetikleyicisini RIM tetikleyicisi olarak değiştirin ve harici lazer tetiğine bağlayın. Pompalama anahtarı için ON düğmesine basın. Tetikleyici ayarını dış tetikleyiciye ayarlayın. WIM programından çıkmak için Çıkış düğmesini tıklatın.
   7. A hattı sinyalini toplamak için 2.4 adımını kullanın. Lazer şaşkınını aç. Hizalamak için 2.6\u20122.7 adımlarını izleyin. Hizalamadan sonra koleksiyonu sonlandırmak için Durdur tuşuna basın.
   8. RIM programını seçin. Yeni oluşturulan klasörü adlandırın. Taramaya başlamak için Topla düğmesini tıklatın.
   9. Edinme işlemini tamamladıktan sonra taramayı sonlandırmak için Durdur düğmesini tıklatın. RIM programından çıkmak için Çıkış düğmesini tıklatın.
   10. Görüntülemenin sonunda servikal çıkık kullanarak hayvanı ötenazi.
4. Vasküler görselleştirmenin WIM'ini gerçekleştirin.
   1. Odaklanmış ultrasonik dönüştürücü kullanın (Merkezi frekans: 25 MHz; Bant genişliği: %90'dan fazla; Odak uzaklığı: 8 mm). Fare kulağının veya kafa derisinin kıllarını çıkarın.
      1. Farenin kraniyal zamansal üst kısmının yan tarafında küçük bir kesi yapmak için bir neşter kullanın (kafatasına derinlik). Bu kesiden başlamak için oftalmik makas kullanın. Kafa derisini kafatasının dış tarafında kesin. Kanamayı durdurmak için kanama noktasını sıkıştırın. Yarayı normal salinle yıkayın. Fareyi tutucunun üzerine yerleştirin.
   2. Ultrason jeli kullanarak görüntüleme bölgesinin polietilen membranla temas etmesine izin verin. Temas bölgesindeki kabarcıklardan kaçının (Ek Şekil 1).
   3. Tutucuyu akustik bağlantı için çalışma sahnesine yerleştirin. Lazeri açmak ve A hattı sinyali toplamak için 2.3\u20122.4 adımlarını kullanın. Hizalamak için 2.6\u20122.7 adımlarını kullanın. Hizalamadan sonra koleksiyonu sonlandırmak için Durdur tuşuna basın.
   4. WIM programını seçin. Yeni oluşturulan klasörü adlandırın. Tarama parametresini "Tarama Hızı" sekmesinde "10 mm/s", "Tarama Alanı" sekmesinin altında "10 mm*10 mm" ve "Adım" sekmesinde "10" olarak ayarlayın. Taramaya başlamak için Topla düğmesini tıklatın.
   5. Edinme işlemini tamamladıktan sonra taramayı sonlandırmak için Durdur düğmesini tıklatın. Motorun sıfıra dönmesini sağlamak için Sıfıra Dön'ü tıklatın. WIM programından çıkmak için Çıkış düğmesini tıklatın.
   6. Hayvan hala anestezi altındayken prosedürün sonunda hayvanı ötenazi edin.
5. Küçük hayvanların dinamik izlenmesi için RIM'i gerçekleştirin.
   1. Fare karnının saçını tıraş edin. Fareyi tutucunun üzerine supine pozisyonunda yerleştirin.
   2. Ultrason jeli kullanarak görüntüleme bölgesinin polietilen membranla temas etmesine izin verin. Temas bölgesindeki kabarcıklardan kaçının.
   3. Tutucuyu akustik bağlantı için çalışma sahnesine yerleştirin. Lazeri başlatmak ve A hattı sinyalini toplamak için 2.3\u20122.4 adımlarını uygulayın. Hizalamak için 2.6\u20122.7 adımlarını gerçekleştirin. Hizalamadan sonra koleksiyonu sonlandırmak için Durdur tuşuna basın.
   4. RIM programını seçin. Yeni oluşturulan klasörü adlandırın. Taramaya başlamak için Topla düğmesini tıklatın.
   5. Edinme işlemini tamamladıktan sonra taramayı sonlandırmak için Durdur düğmesini tıklatın. RIM programından çıkmak için Çıkış düğmesini tıklatın.
6. Kullanıcı tanımlı program tarafından derinlik yönü boyunca maksimum genlik projeksiyonunun (MAP) yeniden yapılandırılması için RIM verilerini kullanın. Hayvandaki dinamik değişiklikleri gözlemleyin.

DRS-PAI şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Sistem, RIM ile WIM arasında esnek ve tekrarlanabilir geçiş sağlar. Elde edilen PA sinyali, PA B-Scan ve MAP görüntülerini oluşturmak için hızlı bir şekilde işlenir. CCD kamera örneklerin fotoğraflarını sağlayabilir.

DRS-PAI'nin tüm bileşenleri entegre edilir ve bir görüntüleyici kurulumuna monte edilir (Şekil 2), montajı ve çalışmasını kolaylaştırır. WIM'de, iki boyutlu motorlu bir aşamanın sürekli raster taraması kullanılır. Çalışma aşamasının sinyali kaydedilir. Veri toplama, aşamanın tekdüze çevirisi sırasında devam etti. RIM'de iki eksenli bir galvanometre tarayıcı kullanıldı. Veriler Galva taraması ile senkronize olarak toplanarak toplandırıldı (Şekil 3).

Burada her görüntüleme moduna sahip örneklerin damar görüntüleri toplandı. Şekil 4A, farenin MAP görüntüsünü WIM'de gösterir. Görüntüleme süresi yaklaşık 33 dk idi. Şekil 4B, RIM sırasında farenin B tarama görüntülerini göstermektedir. RIM'in tüm süreci Video 1. Daha sonra odaklanmış bir ultrasonik dönüştürücü kullanıldı. Fare kulağının ve beyninin damar ağları Şekil 5'te gösterilmiştir. Görüntüleme süresi yaklaşık 16 dakikaydı. Bu, DRS-PAI'nin geniş alan vaskülatını görüntüleme yeteneğini göstermektedir. Ek olarak, Şekil 6A görüntüleme aralığının bir damar içerdiğini göstermektedir. RIM'in görüntüleme aralığı, odaklanmış ultrasonik dönüştürücünün kullanımı nedeniyle yaklaşık 100 μm'dir. Fare karnının zamana karşı derinlik yönü boyunca yer değiştirme görüntüsü Şekil 6B'de gösterilmiştir. Video 2, damar yer değiştirme ve mevcut nabız veya solunum eğrisini elde etme sürecini gösterir.

Şekil 1: DRS-PAI sisteminin şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: DRS-PAI sisteminin tasarımı.
(A) DRS-PAI sisteminin fotoğrafı. (B) Panelde lazer yol montajı için kurulumun bir fotoğrafı gösterilir. (C) Panel lazer yol montajı için 3D modeli gösterir. (D) Panel iki eksenli hızlı galvanometre tarayıcı montajını gösterir. (E) Panel prob montajını gösterir. (F) Panel CCD optik yol montajını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Farklı görüntüleme modları için tarama kurulumu.
(A) WIM'nin tarama yolu. (B) RIM'in tarama yolu. (C) İki görüntüleme modunun tetikleyici kurulumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Farenin fotoakoustik WIM'i ve RIM arkası.
(A) Farenin WIM'deki MAP görüntüsü. (B) RIM'deki farenin B-Scan görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Farenin fotoakoustik WIM'i.
(A) Fare kulağının WIM'deki MAP görüntüsü. (B) Fare beyninin WIM'deki MAP görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Fare karnının fotoakoustik RIM' i.
(A) RIM fare karnının B tarama görüntüleri. (B) RIM'deki zamana karşı fare karnının derinlik yönü boyunca MAP görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Farenin RIM işlemi geri. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 2: Fare karnının derinlik yönü boyunca MAP görüntüsünün zamana karşı işlenmesi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1: Görüntüleme bölgesinin polietilen membranla temas eden kısmı. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Burada, vaskülatın yapısını ve ilgili dinamik kan değişimini yakalamak için tasarlanmış ve geliştirilmiş noninvaziv vasküler görselleştirme için çift raster taramalı fotoakoustik küçük hayvan görüntüleyici sunduk. DRS-PAI'nin avantajı, WIM ve RIM'i tek bir sisteme entegre etmesidir, bu da küçük hayvanların vasküler dinamik ve vasküler ağ yapısını incelemeyi kolaylaştırır. Sistem yüksek çözünürlüklü geniş alan vasküler görselleştirme ve gerçek zamanlı kan dinamiği sağlayabilir.

Mevcut sistemde, optik heyecan tek dalga boyu ışık kaynağı ile uygulandı. Gelecekteki bir çok dalga boyu sistemi, kan oksijen doygunluğu gibi diğer parametreleri sağlayacaktır. Ayrıca, vasküler çap, damar yoğunluğu, damar işkencesi vb. Nicel analiz, hastalıkların erken tanı ve tedavisi için değerli bilgiler sağlayabilir.

Özetle, sistem araştırmacıların biyomedikal alaka düzeyi ile küçük hayvan araştırmaları hakkında yüksek boyutlu fizyolojik ve patolojik içgörüler elde etmelerine olanak tanır. Sistem, anjiogenez, tümör mikroçevrengileri, hemodinamik, beyindeki fonksiyonel bağlantılar, mikrosirkülasyon, ilaç yanıtları ve tedavi yanıtlarını içeren ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çoğu küçük hayvan araştırma ayarına uyarlanabilir. Protokoldeki kritik adımlar arasında çift tarama yapısının tasarımı, WIM'deki optik ve akustik odağın konfokal ayarı ve RIM'deki ses alanının merkez noktası ayarı yer alıyor.

Tüm hayvan deneyleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onaylı kılavuz ve yönetmeliklerine göre gerçek gerçekleştirildi. Yazarların makaleyle ilgili herhangi bir finansal çıkarları yoktur ve açıklayacak başka bir potansiyel çıkar çatışması yoktur.

Yazarlar, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (61822505; 11774101; 61627827; 81630046), Çin'in Guangdong Eyaleti Bilim ve Teknoloji Planlama Projesi (2015B02020233016) ve Guangzhou Bilim ve Teknoloji Programı (No. 2019020001).