Doppia scansione Raster Photoacoustic Small-Animal Imager per la visualizzazione vascolare

È stato progettato un doppio imager fotoacustico a scansione raster, che integrava l'imaging a campo largo e l'imaging in tempo reale.

L'imaging di reti vascolari su piccoli animali ha svolto un ruolo importante nella ricerca biomedica di base. La tecnologia di imaging fotoacustico ha un grande potenziale di applicazione nell'imageologia dei piccoli animali. L'imaging fotoacustico ad ampio campo di piccoli animali può fornire immagini ad alta risoluzione spaziotemporale, penetrazione profonda e contrasti multipli. Inoltre, il sistema di imaging fotoacustico in tempo reale è auspicabile per osservare le attività emodinamiche della vascucolatura dei piccoli animali, che possono essere utilizzate per ricercare il monitoraggio dinamico delle caratteristiche fisiologiche dei piccoli animali. Qui viene presentato un imager fotoacustico a scansione doppia raster, dotato di una funzione di imaging a doppia modalità commutabile. L'imaging a campo largo è guidato da una fase di traslazione motorizzata bidimensionale, mentre l'imaging in tempo reale è realizzato con galvanometri. Impostando diversi parametri e modalità di imaging, è possibile eseguire la visualizzazione in vivo della rete vascolare di piccoli animali. L'imaging in tempo reale può essere utilizzato per osservare il cambiamento cardiaco e il cambiamento del flusso sanguigno indotto dal farmaco, ecc. L'imaging a campo largo può essere utilizzato per tenere traccia del cambiamento di crescita della vascucolatura tumorale. Questi sono facili da adottare in vari settori della ricerca biomedicina di base.

Nel campo biomedico di base, i piccoli animali possono simulare la funzione fisiologica umana. Pertanto, l'imaging di piccoli animali svolge un ruolo importante nel guidare la ricerca di malattie omologhe umane e nella ricerca di un trattamento^{efficace 1}. L'imaging fotoacustico (PAI) è una tecnica di imaging non invasiva che combina i vantaggi dell'imaging ottico e dell'imaging ad^{ultrasuoni 2}. La microscopia fotoacustica (PAM) è un prezioso metodo di imaging per la ricerca di base di piccoli animali³. PAM può facilmente ottenere immagini ad alta risoluzione, penetrazione profonda, ad alta specificità e ad alto contrasto basate sull'eccitazione ottica e sul rilevamento degli ultrasuoni⁴.

Un laser a impulsi con una lunghezza d'onda specifica viene assorbito da cromofori endogeni dei tessuti. Successivamente, la temperatura del tessuto aumenta, il che si traduce nella produzione di onde ultrasoniche foto indotte. Le onde ultrasoniche possono essere rilevate da un trasduttore ad ultrasuoni. Dopo l'acquisizione del segnale e la ricostruzione dell'immagine, la distribuzione spaziale dell'assorbitore può essere^{ottenuta 5}. Da un lato, la visualizzazione della rete vascolare di organi interi richiede un ampio campo visivo. Il processo di scansione a campo largo di solito richiede molto tempo per garantire un'alta^{risoluzione 6,7,8}. D'altra parte, osservare le attività emodinamiche dei piccoli animali richiede immagini veloci in tempo reale. L'imaging in tempo reale è utile per studiare i segni vitali dei piccoli animali in tempo^{reale 9,10,11}. Il campo visivo dell'imaging in tempo reale è in genere sufficientemente piccolo da garantire un alto tasso di aggiornamento. Pertanto, c'è spesso un compromesso tra il raggiungimento di un ampio campo visivo e l'imaging in tempo reale. In precedenza, due diversi sistemi erano utilizzati per l'imaging a campo largo o l'imaging in tempo reale, separatamente.

Questo lavoro riporta un doppio imager fotoacustico a scansione raster (DRS-PAI), che integrava l'imaging a campo largo basato su uno stadio di traduzione motorizzato bidimensionale e l'imaging in tempo reale basato su uno scanner galvanometrico a due assi. La modalità di imaging a campo largo (WIM) viene eseguita per mostrare la morfologia vascolare. Per la modalità di imaging in tempo reale (RIM), attualmente ci sono due funzioni. Innanzitutto, RIM può fornire immagini B-scan in tempo reale. Misurando lo spostamento della vascucolatura lungo la direzione di profondità, si possono rivelare le caratteristiche della respirazione o dell'impulso. In secondo luogo, il RIM può misurare quantitativamente l'area specifica nell'immagine WIM. Fornendo immagini comparabili delle regioni WIM locali, i dettagli del cambiamento locale possono essere rivelati con precisione. Il sistema progetta una transizione flessibile tra l'imaging a campo largo della visualizzazione vascolare e l'imaging in tempo reale della dinamica locale. Il sistema è auspicabile nella ricerca biomedica di base, dove è necessaria l'imaging di piccoli animali.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti nel rispetto delle linee guida fornite dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della South China Normal University, Guangzhou, Cina.

1. Configurazione del sistema

1. Percorso ottico (Figura 1)
   1. Utilizzare un laser a impulsi da 532 nm come sorgente laser di sistema. Impostare la velocità di ripetizione del laser su 10 kHz, l'energia di uscita al 100% e l'impostazione del trigger sul trigger esterno utilizzando un programma definito dall'utente.
   2. Accoppiare il raggio laser alla fibra monomodale (SMF) tramite un accoppiatore in fibra ottica (FC1). Collimare il raggio laser utilizzando un collimatore in fibra ottica (FC2) su uno stadio motorizzato bidimensionale (Motore, velocità massima: 20 mm/s).
   3. Deviare il raggio laser utilizzando uno scanner galvanometrico a due assi (Galva). Utilizzare uno specchio spostabile (M1) per riflettere la trave. Mettere a fuoco il fascio attraverso una lente × 4 punti (OL, apertura numerica: 0,1).
   4. Utilizzare un supporto per traduttori XY (TM) per fissare il trasduttore ad ultrasuoni cavo autoprodotto (UT, frequenza centrale: 25 MHz; Larghezza di banda: oltre il 90%; Foro centrale: 3 mm) sul fondo dell'OL¹². Passare il fascio focalizzato attraverso il foro centrale del trasduttore ad ultrasuoni.
2. Percorso di scansione
   1. Bloccare galva utilizzando un array di gate programmabile sul campo (FPGA 2) durante WIM. Impostare l'intervallo di scansione e la velocità di scansione appropriati in base a un programma definito dall'utente.
   2. Bloccare il motore utilizzando un array di gate programmabile sul campo (FPGA 1) durante RIM. Impostare la frequenza di scansione e il numero di punti di scansione utilizzando FPGA 2. Utilizzare un programma definito dall'utente per controllare l'avvio e interrompere la scansione.
3. Acquisizione dati
   1. Utilizzare un amplificatore da 50 dB (AMP) per amplificare il segnale PA. Digitalizzare il segnale tramite la scheda di acquisizione dati (DAQ). Ottenere il segnale di innesco tramite FPGA 1 o FPGA 2.
   2. Utilizzare un'unità di elaborazione grafica (GPU) per elaborare i dati e visualizzare le immagini in parallelo¹³.
4. Sistema di imaging CCD
   1. Utilizzare un LED bianco a forma di anello (temperatura del colore: 6500 K; Illuminamento: 40000 lux; Diametro: 7,5 cm) come fonte di illuminazione. Rimuovere M1, utilizzare uno specchio fisso (M2) per riflettere la luce.
   2. Registra le immagini utilizzando una fotocamera CCD (6,3 milioni di pixel) sul sistema di imaging PA. Visualizzare le immagini con un software di visualizzazione.

2. Allineamento del sistema

1. Selezionare un serbatoio dell'acqua (10 cm × 10 cm × 4,4 cm; finestra inferiore: 3 cm × 3 cm). Coprire l'intero serbatoio dell'acqua utilizzando una membrana in polietilene (membrana spessa: 10 μm). Aggiungere acqua ultrapura sufficiente.
2. Posizionare il serbatoio dell'acqua sulla fase di lavoro.
3. Accendere l'interruttore laser. Selezionare il programma di controllo laser. Preriscaldare per 5 minuti. Premere il tasto "ON" sull'interruttore di pompaggio. Impostare i parametri laser come da passaggio 1.1.1. Apri il deflettori del laser.
4. Selezionare il programma raccolto dalla riga A. Premere il pulsante "Start" per acquisire il segnale a punto singolo e visualizzare l'ampiezza e lo spettro del segnale di linea A corrente.
5. Posizionare una lama sul fondo del serbatoio dell'acqua. Immergere la parte inferiore dell'UT nel serbatoio dell'acqua per l'accoppiamento acustico. Evitare bolle nella parte inferiore dell'UT.
6. Regolare la posizione di Galva, regolare il traduttore XY tra UT e OL per evitare il segnale di oscillazione e assicurarsi che sia confocale.
7. Regolare l'altezza della fase di lavoro per massimizzare l'ampiezza del segnale e determinare la posizione di messa a fuoco.

3. Esperimento animale

1. Utilizzare un mouse BALB/c di 5\u20126 settimane con un peso corporeo di 20\u201230 g.
2. Anestetizzare l'animale usando uretano (1 g/kg) iniettato per via intraperitoneale prima dell'esperimento.
3. Condurre la transizione tra WIM e RIM.
   1. Utilizzare un trasduttore ad ultrasuoni planare. Radere la pelliccia sul retro del mouse usando un trimmer e una crema depilatoria. Posizionare il mouse sul supporto (8 cm × 2,8 cm × 2 cm) in posizione soggetta.
   2. Consentire alla regione di imaging di essere a contatto con la membrana in polietilene utilizzando il gel ad ultrasuoni. Evitare bolle nella parte di contatto.
   3. Posizionare il supporto sul palco di lavoro per l'accoppiamento acustico. Seguire i passaggi 2.3\u20122.4 per avviare il laser e raccogliere il segnale di linea A. Seguire i passaggi 2.6\u20122.7 per allinearli. Premere "Interrompi" per terminare la raccolta dopo l'allineamento.
   4. Selezionare il programma WIM. Assegnare un nome alla cartella appena creata. Impostare il parametro di scansione su 20 mm/s nella scheda "Velocità di scansione", "20 mm*20 mm" nella scheda "Area di scansione" e "20" nella scheda "Passo". Fare clic sul pulsante Raccogli per avviare la scansione.
   5. Fare clic sul pulsante Interrompi per terminare la scansione dopo l'acquisizione. Fate clic su Torna a zero (Return to Zero) per portare il motore a zero. Chiudi il deflettori laser. Impostare l'impostazione del trigger sul trigger interno. Premere il tasto OFF per l'interruttore di pompaggio.
   6. Sostituire il trigger WIM come trigger RIM e collegarlo al trigger laser esterno. Premere il tasto ON per l'interruttore di pompaggio. Impostare l'impostazione del trigger sul trigger esterno. Fare clic sul pulsante Esci per uscire dal programma WIM.
   7. Utilizzare il passaggio 2.4 per raccogliere il segnale della linea A. Apri il deflettori laser. Seguire i passaggi 2.6\u20122.7 per allinearli. Premere Interrompi per terminare la raccolta dopo l'allineamento.
   8. Selezionate il programma RIM. Assegnare un nome alla cartella appena creata. Fare clic sul pulsante Raccogli per avviare la scansione.
   9. Fare clic sul pulsante Interrompi per terminare la scansione dopo aver completato l'acquisizione. Fate clic sul pulsante Esci (Exit) per uscire dal programma RIM.
   10. Eutanasia l'animale usando la lussazione cervicale al termine dell'imaging.
4. Condurre WIM di visualizzazione vascolare.
   1. Utilizzare un trasduttore ad ultrasuoni focalizzato (frequenza centrale: 25 MHz; Larghezza di banda: oltre il 90%; Lunghezza focale: 8 mm). Rimuovere i capelli dell'orecchio o del cuoio capelluto dei topi.
      1. Usa un bisturi per fare una piccola incisione sul lato laterale della parte superiore temporale cranica del topo (profondità al cranio). Usa le forbici oftalmiche per iniziare da questa incisione. Tagliare il cuoio capelluto intorno al lato esterno del cranio. Comprimere il punto di sanguinamento per interrompere il sanguinamento. Lavare la ferita con la normale soluzione salina. Posizionare il mouse sul supporto.
   2. Consentire alla regione di imaging di essere a contatto con la membrana in polietilene utilizzando il gel ad ultrasuoni. Evitare bolle nella regione di contatto (Figura complementare 1).
   3. Posizionare il supporto sul palco di lavoro per l'accoppiamento acustico. Utilizzare i passaggi 2.3\u20122.4 per aprire il laser e raccogliere il segnale di linea A. Utilizzare il passaggio 2.6\u20122.7 per allinearlo. Premere Interrompi per terminare la raccolta dopo l'allineamento.
   4. Selezionare programma WIM. Assegnare un nome alla cartella appena creata. Impostare il parametro di scansione su "10 mm/s" nella scheda "Velocità di scansione", "10 mm*10 mm" sotto la scheda "Area di scansione" e "10" nella scheda "Passo". Fare clic sul pulsante Raccogli per avviare la scansione.
   5. Fare clic sul pulsante Interrompi per terminare la scansione dopo aver completato l'acquisizione. Fate clic sul pulsante Torna a zero (Return to Zero) per fare in modo che il motore ritorni a zero. Fare clic sul pulsante Esci per uscire dal programma WIM.
   6. Eutanasia l'animale al termine della procedura mentre l'animale è ancora in anestesia.
5. Condurre RIM per il monitoraggio dinamico dei piccoli animali.
   1. Radersi i capelli dell'addome del topo. Posizionare il mouse sul supporto in posizione supina.
   2. Consentire alla regione di imaging di essere a contatto con la membrana in polietilene utilizzando il gel ad ultrasuoni. Evitare bolle nell'area di contatto.
   3. Posizionare il supporto sul palco di lavoro per l'accoppiamento acustico. Eseguire i passaggi 2.3\u20122.4 per avviare il laser e raccogliere il segnale di linea A. Eseguire il passaggio 2.6\u20122.7 per allinearlo. Premere Interrompi per terminare la raccolta dopo l'allineamento.
   4. Selezionate il programma RIM. Assegnare un nome alla cartella appena creata. Fare clic sul pulsante Raccogli per avviare la scansione.
   5. Fare clic sul pulsante Interrompi per terminare la scansione dopo aver completato l'acquisizione. Fate clic sul pulsante Esci (Exit) per uscire dal programma RIM.
6. Utilizzate i dati RIM per la ricostruzione della proiezione di ampiezza massima (MAP) lungo la direzione di profondità per programma definito dall'utente. Osserva i cambiamenti dinamici nell'animale.

Lo schema del DRS-PAI è illustrato nella figura 1. Il sistema consente il passaggio flessibile e ripetibile tra WIM e RIM. Il segnale PA acquisito viene elaborato rapidamente per generare immagini PA B-Scan e MAP. La telecamera CCD può fornire fotografie di campioni.

Tutti i componenti del DRS-PAI sono integrati e assemblati in una configurazione di imager (Figura 2), semplificando l'assemblaggio e il funzionamento. Nel WIM viene utilizzata la scansione raster continua di uno stadio motorizzato bidimensionale. Viene registrato il segnale della fase di corsa. L'acquisizione dei dati è proseguita durante la traduzione uniforme della fase. Nel RIM è stato utilizzato uno scanner galvanometrico a due assi. I dati sono stati raccolti in modo sincrono con la scansione Galva (Figura 3).

Qui sono state raccolte le immagini vascolari dei campioni con ogni modalità di imaging. La figura 4A mostra l'immagine MAP del mouse di nuovo in WIM. Il tempo di imaging è stato di circa 33 minuti. La figura 4B mostra le immagini B-scan del mouse durante RIM. L'intero processo di RIM è mostrato nel video 1. Quindi, è stato utilizzato un trasduttore ad ultrasuoni focalizzato. Le reti vascolari dell'orecchio e del cervello del mouse sono mostrate nella figura 5. Il tempo di imaging era di circa 16 minuti. Ciò dimostra la capacità di DRS-PAI di immagini vascure a campo largo. Inoltre, la figura 6A mostra che l'intervallo di imaging contiene un recipiente. La gamma di imaging di RIM è di circa 100 μm a causa dell'uso del trasduttore ad ultrasuoni focalizzato. L'immagine di spostamento lungo la direzione di profondità dell'addome del mouse rispetto al tempo è illustrata nella figura 6B. Il video 2 mostra il processo di spostamento vascolare e l'ottenimento dell'impulso di corrente o della curva di respirazione.

Figura 1: Schema del sistema DRS-PAI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Progettazione del sistema DRS-PAI.
(A) La fotografia del sistema DRS-PAI. (B) Il pannello mostra una fotografia della configurazione per l'assemblaggio del percorso laser. (C) Il pannello mostra il modello 3D per l'assemblaggio del percorso laser. (D) Il pannello mostra l'assieme dello scanner del galvanometro veloce a due assi. (E) Il pannello mostra l'assieme sonda. (F) Il pannello mostra l'assieme del percorso ottico CCD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Configurazione della scansione per diverse modalità di imaging.
(A) Percorso di scansione di WIM. (B) Percorso di scansione di RIM. (C) Impostazione del trigger di due modalità di imaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Wim fotoacustico e RIM del mouse posteriore.
(A) Immagine MAP del mouse in WIM. (B) Le immagini B-Scan del mouse tornano in RIM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Wim fotoacustico di un mouse.
(A) Immagine MAP dell'orecchio del mouse in WIM. (B) Immagine MAP del cervello del mouse in WIM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Il BORDO fotoacustico dell'addome del topo.
(A) Le immagini B-scan dell'addome del topo in RIM. (B) Immagine MAP lungo la direzione di profondità dell'addome del mouse rispetto al tempo in RIM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Il processo di RIM del mouse indietro. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Il processo dell'immagine MAP lungo la direzione di profondità dell'addome del mouse rispetto al tempo. Clicca qui per scaricare questo video.

Figura complementare 1: La parte della regione di imaging a contatto con la membrana in polietilene. Clicca qui per scaricare questa cifra.

Qui abbiamo presentato un doppio imager fotoacustico a scansione raster per la visualizzazione vascolare non invasiva che è stato progettato e sviluppato per catturare la struttura della vascolarizzazione e il relativo cambiamento dinamico del sangue. Il vantaggio di DRS-PAI è che integra il WIM e il RIM in un unico sistema, il che rende più facile studiare la struttura della rete dinamica vascolare e vascolare dei piccoli animali. Il sistema può fornire una visualizzazione vascolare ad ampio campo ad alta risoluzione e dinamiche del sangue in tempo reale.

Nel sistema attuale, l'eccitazione ottica è stata implementata con una sorgente luminosa a lunghezza d'onda singola. Un futuro sistema multi-lunghezza d'onda fornirebbe altri parametri come la saturazione dell'ossigeno nel sangue. Inoltre, è possibile sviluppare uno speciale algoritmo di elaborazione delle immagini per l'analisi quantitativa, tra cui la stima del diametro vascolare, la densità vascolare, la tortuosità vascolare, ecc. L'analisi quantitativa può fornire informazioni preziose per la diagnosi precoce e il trattamento delle malattie.

In sintesi, il sistema consente ai ricercatori di ottenere approfondimenti fisiologici e patologici ad alta dimensione sulla ricerca su piccoli animali con rilevanza biomedica. Il sistema può essere adattato alla maggior parte delle impostazioni di ricerca su piccoli animali, includono, a titolo titolo omonimo, imaging di angiogenesi, microambiente tumorale, connessioni emodinamiche e funzionali nel cervello, microcircolo, risposte ai farmaci e risposte terapeutiche. I passaggi critici all'interno del protocollo includono la progettazione della struttura a doppia scansione, la regolazione confocale della messa a fuoco ottica e acustica nel WIM e la regolazione del punto centrale del campo sonoro nel RIM.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e i regolamenti approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Gli autori non hanno interessi finanziari rilevanti nel manoscritto e nessun altro potenziale conflitto di interessi da rivelare.

Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (61822505; 11774101; 61627827; 81630046), The Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China (2015B020233016) e The Science and Technology Program of Guangzhou (n. 2019020001).