Method Article
Bu yöntem hücre hatlarında ÇHC2 aracılı kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için tasarlanmıştır ve yöntem diğer birçok sistemlere uyarlanabilir.
Kromatin etki alanlarının organizasyonu ve yapısı tek tek hücre soylarına özgüdür. Onların yanlış regülasyonu hücresel kimlik ve / veya hastalık kaybına yol açabilir. Muazzam çabalara rağmen, kromatin alanlarının oluşumu ve yayılması anlayışımız hala sınırlıdır. Kromatin etki alanları, kuruluşları sırasında ki ilk olayları takip etmeye elverişli olmayan sabit devlet koşullarında incelenmiştir. Burada, kromatin etki alanlarını inducibly yeniden inşa etmek ve zamanın bir fonksiyonu olarak yeniden oluşumunu takip etmek için bir yöntem salıyoruz. Her ne kadar ilk olarak ÇHC2 aracılı baskılayıcı kromatin etki alanı oluşumu olgusuna uygulansa da, diğer kromatin etki adlarına kolayca adapte edilebilir. Bu yöntemin genomik ve görüntüleme teknolojileri ile değiştirilmesi ve/veya kombinasyonu, kromatin alanlarının kurulmasını ayrıntılı olarak incelemek için paha biçilmez araçlar sağlayacaktır. Bu yöntemin kromatin alanlarının nasıl oluştuğu ve birbirleriyle nasıl etkileşimde olduğu anlayışımızda devrim olacağına inanıyoruz.
Ökaryotik genomlar son derece organize ve kromatin erişilebilirlik değişiklikleri doğrudan gen transkripsiyonkontrol 1. Genom transkripsiyonel aktivite ve çoğaltma zamanlaması2,3ile ilişkili kromatin etki alanları, farklı türleri içerir. Bu kromatin etki alanları boyutu birkaç kilobases (kb) fazla 100 kb arasında değişir ve farklı histon modifikasyonları bir zenginleştirme ile karakterizedir4. Temel sorular şunlardır: bu etki alanları nasıl oluşur ve nasıl yayılır?
En iyi karakterize kromatin etki alanlarından biri Polycomb baskıcı kompleks 2 (PRC2) aktivitesi ile teşvik edilir. PRC2, Polycomb Group 'un (PcG)5,6proteinlerinin bir alt kümesinden oluşan ve histon H3 (H3K27me1/me2/me3) 27 lisenin mono-, di-ve trimethylation katalizler bir çok alt birim kompleksidir 7,8, 9,10. H3K27me2/me3 baskıcı kromatin durumu ile ilişkilidir, ancak H3K27me1 fonksiyonu belirsiz6,11. ÇHC2 temel bileşenlerinden biri, embriyonik ektoderm gelişimi (EED), çHC2 kataliz son ürün bağlanır, H3K27me3, aromatik kafes aracılığıyla ve bu özellik PRC2 allosteric stimülasyon sonuçları12,13. ÇHC2 enzimatik aktivitesi belirli bir soy için kontrendike olan bazı gelişimsel genlerin uygunsuz ifadesi olarak gelişim sırasında hücresel kimliğin korunması için çok önemlidir, zararlı olacaktır5,6 . Bu nedenle, PrC2'nin memelilerde baskıcı kromatin alanlarının oluşumunu teşvik ettiği mekanizmaların çözülmesi hücresel kimliğin anlaşılması için temel öneme sahiptir.
PrC2 aracılı kromatin etki alanları da dahil olmak üzere kromatin etki alanı oluşumunu araştırmak için tasarlanmış tüm deneysel sistemler, kromatin etki alanı oluşumunun gelişen olaylarını takip edemeyen sabit durum koşullarında gerçekleştirilmiştir. Hücre. Burada, kromatin alanadlarının ilk işe alımını ve yayılmasını izleyen indüklenebilir bir hücresel sistem oluşturmak için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Özellikle, H3K27me2/3'ü oluşturan ÇHC2 aracılı baskıcı kromatin etki alanlarının oluşumunu izlemeye odaklanıyoruz. Kromatin etki alanı oluşumunun mekanistik ayrıntılarını yakalayabilen bu sistem, H2AK119ub veya H3K9me'den oluşan yaygın olarak çalışılan etki alanları gibi diğer kromatin etki alanlarını da dahil etmek üzere uyarlanabilir. Genomik ve görüntüleme teknolojileri ile birlikte, bu yaklaşım kromatin biyolojisindeki çeşitli önemli soruları başarılı bir şekilde ele alma potansiyeline sahiptir.
İndüklen EED kurtarma mESC'lerinin üretimi
1. Hücre kültürü
2. Klonal EED nakavt (KO) mESCs üretimi
3. Cre-ERT2 tabanlı indüklen EED ifadesini barındıracak EED nakavt mESC'lerini tasarlamak
4. Kromatin üzerinde ÇHC2 aktivitesinin çekirdekleşme ve yayılmasınıtaki takip
5. MESC'lerin çekirdeklerinde H3K27me3 focisinin ortaya çıkışını ve büyümesini izleme
Koşullu kurtarma sisteminin genel bir şeması
Şekil 1 endojen EED locus ifade edilir Ya WT veya kafes mutant (Y365A) EED ile EED KO hücreleri koşullu kurtarmak için hedefleme şeması gösterir. Stabilitesi ve enzimatik aktivitesi için gerekli olan ÇHC2'nin çekirdek alt birimi olan EED'yi nakavt ettikten sonra, EED'nin ekson 9'unu takip eden intron içinde bir kaset tanıtılır (Şekil1). Kaset, endojen gen dizilimine göre ters yönde, EED'nin kalan 3' cDNA dizisinden oluşur. Kaset heterolog ters loxP siteleri (lox66 ve lox71)18ile çevrilidir. H3K27me2/3 tam kaybı gözlenene kadar hücreler yayılır. Cre rekombinaz ifadesinin 4-OHT eklenmesiyle aktivasyonu üzerine, kaset, exon 9'un splice alıcı sırası kullanılarak kasete spliced olacak şekilde ters çevrilmiş tir (Şekil 1). Bu sistem ile, EED KO hücreleri artık her ikisi de C-terminal Bayrak-HA etiketine sahip olan EED'nin WT veya kafes mutant versiyonları tarafından kurtarılabilir. T2A-GFP, başarılı bir ters çevirme olayına maruz olan hücreler için seçmek için bir işaretçi sağlar. PolyA sinyali aşağı akım dizilerinin transkripsiyonuna engel oluyor. Bu sistem ile, ÇHC2 işe kinetik ve H3K27me etki alanlarının oluşumu artık takip edilebilir.
PrC2 aracılı H3K27me2/3'ün zamansal birikiminin izlenmesi
ÇHC2 aracılı kromatin etki alanı kurulmasının zamansal dinamiklerini takip etmek için, EED'nin WT veya kafes mutant versiyonu, 4-OHT tedavisi üzerine EED KO hücrelerinin arka planında yeniden ifade edilir (Şekil 2A,B). H3K27me2/3 işaretlerinin birikintiyi takip etmek için, H3K27me2/me3'ün ChIP-seq'ı, belirtilen zaman noktaları için WT veya kafes mutantı EED'nin yeniden ifade edilmesinden sonra gerçekleştirilir. H3K27me3'ün ortaya çıkışı, "nükleasyon bölgeleri" (Şekil2C) olarak gösterilen ayrık bölgelerde WT EED ekspresyonundan sonra 12 saat sonra ve daha sonra ilk çekirdekleşme bölgelerinden 24 saat13ile uzak bölgelerde görülür. Sonunda, H3K27me3 dağılımı neredeyse WT EED ifade sonra 36 h WT ebeveyn hücrelerinde görülen düzeyleri yaklaşık. H3K27me3 zamansal kurulan downstream siteleri "yayılan siteler"13denir. Bu sistem aynı zamanda H3K27me2'nin zamansal birikimini izleyebilir, bu da H3K27me3 birikiminden önce görünür (Şekil2C,D). Son olarak, kafes mutantı EED'nin yeniden ifade edilmesi WT EED'e göre farklı dinamikler sergiler (Şekil 2C,D). Bu durumda, H3K27me3 birikimi çok verimsiz ve bunun yerine, H3K27me2 belirgin hale gelir ve çekirdekleşme sitelerinde daha yoğun, kafes mutant EED komşu bölgelere değişiklik yaymak mümkün olmadığını gösteren.
H3K27me3 foci'nin ortaya çıkışı ve büyümeleri de mikroskopi ile görüntülenebilir (Şekil 2E)13. WT EED ekspresyonunun indüksiyonundan önce H3K27me3 boyama belirgin değildir. Ancak, WT EED ifadesinin 12 saat H3K27me3 foci oluşumukanıt gösterir. Bu foci sayısı ve boyutu 24 h artış, ve sonunda WT EED ifade 36 h tarafından çekirdeğin büyük bölgelere yayıldı. Bu sistem, ChIP-seq ve immünoresans tarafından izlenen PRC2 aracılı kromatin etki alanlarının de novo oluşumuna dair kanıt verir (Şekil 2C-E)13.
Şekil 1 : EED KO mESC'lerini WT veya cage-mt EED (Y365A) ile koşullu olarak kurtarmak için hedeflemeşeması. Ekson 10 ve 11'in silinmesi EED'nin istikrarsızlaşmasına ve bozulmasına ve h3K27me2/me3'ün küresel kaybına neden olur. Ekson 9 ile 10 arasında intron bir kaset belirtildiği gibi ters yönde eklenir. 4-OHT eklenmesi, kasirenin endojen exon 9 splices'ini, WT veya kafes mutantı EED'nin indüklenemez şekilde yeniden ifade edilmesine izin veren kasetin kafes mutantı veya yabani tip cDNA'sına dönüştürür. Bu rakam Oksuz ve ark., 201813. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : İndüklen EED kurtarma sistemlerinin (i-WT-r ve i-MT-r) doğrulamaları ve temsili uygulamaları. (A). i-WT-r ve i-MT-r sistemleri, belirtilen zaman noktasında WT (i-WT-r) veya kafes mutantı (i-MT-r) EED ekspresyonu indüklemek için 4-OHT tedavisinden sonra tüm ekstrelerde belirtilen antikorlar kullanılarak Batı lekesi tarafından doğrulanır. (B). Ters kasetin başarılı bir şekilde takla attığınıgösteren T2A-GFP ifadesinin verimliliğini doğrulamak için i-WT-r hücrelerinde (0 saat) ve sonrası (36 saat) 4-OHT tedavisinde GFP'nin akış sitometri analizi. (C, D). H3K27me3 (C) ve H3K27me2 (D)için ChIP-seq parçaları WT'deki Emx1 geninin yakınında veya i-WT-r veya i-MT-r hücrelerinde, 4-OHT tedavisinin belirtilen süreleri için. Histon işaretlerinin tatılması için erken ve gecikmiş siteler belirtilir. (E). I-WT-r mESC'lerde WT EED ekspresyonunun kurtarılmasından sonra 0, 12, 24 ve 36 h'de H3K27me3 antikor kullanılarak immünoresans. 36 saat boyama düşük pozlamalarda gösterilir. En sağdaki panel, kırmızı okla etiketlenmiş hücrenin yakınlaştırılmış görüntüsüdür. Bu rakam Oksuz ve ark., 201813. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Belirli bir kromatin etki alanının oluşumu sırasında mekanistik ayrıntıları anlamak için güçlü bir yaklaşım, ilk etki alanı bozmak ve daha sonra hücreler içinde devam eden yeniden izlemedir. Devam eden olayları ayrıntılı olarak analiz etmek için yeniden yapılanma sırasında herhangi bir zamanda duraklatılmış olabilir. Kromatin etki alanları üzerinde daha önce yapılan çalışmalar, bu tür olayları sabit durum koşullarında (örneğin, yabani tip ve gen nakavtı karşılaştırması) gerçekleştirdikleri için çözemedikleri için çözemedikleri için. Burada, hücrelerde ÇHC2 aracılı baskıcı etki alanlarının işe alınması ve yayılmasıyla vurgulandığı gibi, kromatin etki alanlarının dinamik oluşumunu değerlendirmek için bir sistem ana hatlar.
Bu indükleyici sistem için en kritik adım, DNA yapılarının istenilen proteinleri (veya RNA) hücrelerden silindikten sonra yeniden ifade etmek için doğru tasarımıdır. Bu yapılarda downstream uygulamalarına bağlı olarak çeşitli mutasyonlar, etiketler ve floresan belirteçler getirilebilir. Örneğin, GFP'den hemen önce kendi kendine cleaving T2A peptid kullanmak yerine, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve/veya tek parçacık izleme deneyleri için çeşitli floresan füzyon proteinleri canlı hücrelerde kromatin etki alanı oluşumunun ilk olayları izlemek.
Bu yöntem kromatin etki alanlarının oluşumu na ilişkin içgörüler sağlamak için birçok şekilde değiştirilebilir olsa da, bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, Cre-ERT2 genini barındıran bir hücre hattı gerektirir. İkinci olarak, 4-OHT tedavisinden sonraki zaman noktalarını belirlemek için optimizasyonlar gereklidir. Üçüncü olarak, bu sistem bir kromatin etki alanının yapısızlaştırılması sırasında ki olayları izlemek için geri döndürülemez. Degron tabanlı yöntemler burada açıklanan yönteme alternatif olarak kullanılabilir26,27. Bu sistemler proteinlerin geri dönüşümlü ve hızlı bozulmasını sağlar, ancak genellikle protein destabilizasyonu için pahalı moleküller gerektirir, örneğin auxin veya kalkan26,27. Ayrıca, bu degron tabanlı yöntemlerin sınırlamaları vardır. Onlar sadece bozulmadan sonra proteinin WT sürümünü yeniden ifade etmek için kullanılabilir. Buna karşılık, burada açıklanan sistem, WT muadili ek olarak ilgi proteinmutant sürümünün koşullu ifade sağlar. Böyle bir degron sisteminin burada açıklanan yöntemle birleştirilmesi, kromatin etki alanlarının oluşumunu tersine çevirmek için güçlü bir araç olacaktır. Kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için alternatif bir yöntem, kromatinden tanımlanmış bir kromatin modifikasyonunu tüketmek ve daha sonra de novo dekontiyasyonunu takip etmek için inhibitörü yıkamak için spesifik inhibitörlerin kullanılmasını gerektirir. Örneğin, EZH2 inhibitörü ve sonraki yıkama ile tedavi H3K27me etki 28yeniden oluşumunu izlemek için kullanılır. Ancak, EZH2 inhibitörü tamamen H3K27me tüketen etkili değildir, hatta 7 gün tedaviden sonra. Bu durumda, önceden varolan H3K27me varlığı işe ve PRC212etkinleştirmek olabilir , böylece sonuçların yorumlanması karmaşık. Yanı sıra, inhibitör ve yıkama stratejisinin kullanımı birçok kromatin etki alanları için özel ve güçlü inhibitörlerin yokluğu nedeniyle sınırlıdır.
Bu yöntemin hücresel sistemlere uygulanabilirliğine ek olarak, hayvanlarda istenilen proteinler üzerinde indüklenebilir mutasyonlar/etiketleme oluşturmak için de kullanılabilir. Bazı durumlarda, bir proteini mutasyona uğratarak veya bir etiket eklemek geliştirme sırasında ölümcül olabilir. Bu yöntem bu öldürücülüğü atlar ve dokuya özgü Cre-ERT2 fare suşları ile bağlantı sağlayarak proteinlerin mutasyonu/etiketlemesinin zamansal ve mekansal kontrolünü sağlar. Bu tür deneyler, bir mutasyonun belirli bir dokudaki ve/veya gelişimin belirli bir aşamasındaki etkisini belirlemek için değerli olacaktır. Daha da önemlisi, kaset içinde muhabir aracılığıyla başarılı bir rekombinasyon geçiren hücrelerin izolasyonunu sağlar. Bu biyokimyasal analizler kolaylaştırır, belirli dokulardan afinite saflaştırma gibi, belirli bir protein için dokuya özgü etkileşimizolasyon. Bu sistem herhangi bir hücresel süreç dinamik değişiklikleri izlemek için yönelik olabilir, ve bu nedenle kromatin etki alanı oluşumuizleme ile sınırlı değildir.
D.R. Constellation Pharmaceuticals ve Fulcrum Therapeutics'in kurucularındandır. Yazarlar hiçbir rakip çıkarları olduğunu beyan.
Dr. L. Vales, D. Ozata ve H. Mou'ya makalenin revizyonu için teşekkür ederiz. D.R. Lab, Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01CA199652 ve R01NS100897) tarafından desteklenir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg) | Sigma | H7904-5MG | For induction of EED expression |
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunofluorescence |
2-mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985-023 | For mESCs culture |
2% Gelatin Solution | Sigma | G1393-100ml | For mESCs culture |
Accutase 500 ML | Innovative Cell Tech/FISHER | AT 104-500 | For mESCs culture |
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresaerch | 711-585-152 | For immunofluorescence |
Aqua-Mount Mounting Medium | FISHER/VWR | 41799-008 | For immunofluorescence |
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK | Fisher Sci | 177445PK | For immunofluorescence |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg | Life Tech | D1306 | For immunofluorescence |
ERK inhibitor, PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | For mESCs culture |
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Millipore/Fisher | ESG1107 | For mESCs culture |
FBS Stem Cell Qualified | Atlanta | S10250 | For mESCs culture |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | For Donor template cloning |
GSK3 inhibitor, CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | For mESCs culture |
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB | Cell Signaling | 9728S | Antibody for ChIP-seq |
H3K27me3 | Cell Signaling | 9733S | Antibody for ChIP-seq |
Histone H2Av antibody (pAb) | Active motif | 39715 | Spike-in control for ChIP-seq |
Knockout DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For mESCs culture |
L-glutamine | Sigma | G7513 | For mESCs culture |
Lipofectamine 2000 | LifeTech | 11668019 | For transfection |
MangoTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21079 | For Genotyping PCR |
Normal donkey serum (10 mL) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | For immunofluorescence |
Penicillin-Streptomycin | Sigma/Roche | P0781 | For mESCs culture |
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | For gRNA cloning |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | For Genotyping PCR |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Zero Blunt PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K270020 | For Donor template cloning |
Primers/gBlocks | |||
EED-KO-gRNA-1 | Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
EED-KO-gRNA-2 | Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems. | ||
EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
i-WT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
EED-gRNA-inducible | Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background. | ||
i-MT-r Donor | https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background. | ||
Genotyping Primers | |||
Gnt-EED-KO-FW-1 | Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
Gnt-EED-KO-REV-1 | Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp. | ||
Inducible_Genotype-FW-1 | Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
Inducible_Genotype-REV-1 | Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp. | ||
Inducible_Genotype-FW-2 | Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. | ||
Inducible_Genotype-REV-2 | Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp. |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır