JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم تصميم هذه الطريقة لمتابعة تشكيل مجالات الكروماتين بوساطة PRC2 في خطوط الخلايا، ويمكن تكييف الطريقة مع العديد من الأنظمة الأخرى.

Abstract

تنظيم وهيكل مجالات الكروماتين فريدة من نوعها لسلالات الخلايا الفردية. وقد يؤدي سوء تنظيمها إلى فقدان الهوية الخلوية و/أو المرض. على الرغم من الجهود الهائلة، فإن فهمنا لتكوين وانتشار مجالات الكروماتين لا يزال محدوداً. وقد درست مجالات الكروماتين في ظل ظروف الحالة الثابتة، والتي لا تؤدي إلى متابعة الأحداث الأولية أثناء إنشائها. هنا، نقدم طريقة لإعادة بناء مجالات الكروماتين بشكل غير صحيح واتباع إعادة تشكيلها كدالة للوقت. على الرغم من أنه، تطبيق لأول مرة على حالة تكوين المجال الكروماتين القمعية بوساطة PRC2، فإنه يمكن تكييفها بسهولة مع مجالات الكروماتين الأخرى. وسيؤدي تعديل و/أو الجمع بين هذه الطريقة وتكنولوجيات علم الجينوم والتصوير إلى توفير أدوات لا تقدر بثمن لدراسة إنشاء مجالات الكروماتين بقدر كبير من التفصيل. ونحن نعتقد أن هذه الطريقة سوف تحدث ثورة في فهمنا لكيفية تشكيل مجالات الكروماتين والتفاعل مع بعضها البعض.

Introduction

الجينوم Eukaryotic هي منظمة للغاية والتغيرات في إمكانية الوصول الكروماتين يتحكم مباشرة في نسخ الجينات1. يحتوي الجينوم على أنواع متميزة من مجالات الكروماتين، والتيترتبط بنشاط النسخ ووقت النسخ المتماثل 2،3. تتراوح هذه المجالات الكروماتين في الحجم من عدد قليل من كيلوباسي (كيلو بايت) إلى أكثر من 100 كيلو بايت وتتميز بإثراء في تعديلات الهيستون متميزة4. والأسئلة الرئيسية هي: كيف تتشكل هذه المجالات وكيف يتم نشرها؟

يتم تعزيز واحدة من مجالات الكروماتين الأكثر تميزا من خلال نشاط مجمع بوليكومب القمعية 2 (PRC2). PRC2 هو مجمع متعدد الوحدات الفرعية يتكون من مجموعة فرعية منمجموعة بوليكومب (PcG) من البروتينات 5،6،ويحفز أحادية، دي، وثلاثي ة من يسين 27 من الهيستون H3 (H3K27me1/me2/me3)7،8، 9،10. ويرتبط H3K27me2/me3 مع حالة الكروماتين القمعية، ولكن وظيفة H3K27me1 غير واضح6،11. واحدة من المكونات الأساسية لPRC2، تطوير ectoderm الجنينية (EED)، يربط إلى المنتج النهائي من الحفز PRC2، H3K27me3، من خلال قفصه العطرية وهذه الميزة النتائج في تحفيز allosteric من PRC212،13. نشاط PRC2 الأنزيمي أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الهوية الخلوية أثناء التنمية كما التعبير غير المناسب لبعض الجينات التنموية التي يتم بطلان لسلالة معينة، سيكون ضارا5،6 . وبالتالي، فإن تفكيك الآليات التي تعزز بها PRC2 تشكيل مجالات الكروماتين القمعية في الثدييات له أهمية أساسية لفهم الهوية الخلوية.

تم تنفيذ جميع الأنظمة التجريبية السابقة المصممة للتحقيق في تكوين نطاق الكروماتين بما في ذلك مجالات الكروماتين بوساطة PRC2، في ظل ظروف ثابتة الحالة، والتي هي غير قادرة على تتبع الأحداث التي تتكشف من تكوين المجال الكروماتين في الخلايا. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لتوليد نظام خلوي غير قابل للتشغيل الذي يراقب التوظيف الأولي ونشر مجالات الكروماتين. وعلى وجه التحديد، نركز على تتبع تشكيل نطاقات الكروماتين القمعية التي تتوسط فيها PRC2 التي تضم H3K27me2/3. هذا النظام الذي يمكن التقاط التفاصيل الميكانيكية لتكوين المجال الكروماتين، يمكن تكييفها لتشمل مجالات الكروماتين الأخرى، مثل المجالات التي درست على نطاق واسع التي تتألف إما H2AK119ub أو H3K9me. وإلى جانب علم الجينوم وتقنيات التصوير، ينطوي هذا النهج على إمكانية معالجة مختلف المسائل الرئيسية في بيولوجيا الكروماتين بنجاح.

Protocol

توليد أجهزة الإنقاذ من الـ EED غير القابلة للاستنساخ

1. خلية ثقافة

  1. استخدام الخلايا الجذعية الجنينية خالية من التغذية C57BL/6 (mESCs) تمتلك ترانسجين CreERT2 المتكاملة بشكل لا بأس به، والتي يمكن أن تنتقل إلى النواة عند إعطاء 4-هيدروكسيتاموكسيفين (4-OHT)13.
  2. تنمو mESCs في التقليدية ESC المتوسطة14،15، تستكمل مع 1000 U / مل LIF ، 1 μM ERK مثبطات PD0325901 و 3 μM GSK3 المانع CHIR99021. لمتوسطة ESC التقليدية، استخدم DMEM بالضربة القاضية التي تحتوي على 15٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 2 mM L-الجلوتامين، 1X البنسلين / العقديات و 0.1 مليون متر 2-mercaptoethanol.
  3. استخدام لوحات المغلفة مع 0.1٪ محلول الجيلاتين لmESCs زراعة.

2. توليد كلونال EED بالضربة القاضية (KO) mESCs

  1. تصميم دليل RNAs (gRNAs) لحذف Exon 10 و Exon 11 من نسخة محلية من EED في أجهزة الإس إس إي باستخدام أداة تصميم كريسبر في Benchling16. EED-KO-gRNA-1 يستهدف الإنترون على الفور المنبع من exon 10 وEED-KO-gRNA-2 يستهدف الإنترون على الفور المصب من Exon 11. التطبيق المتزامن لهذه gRNAs يحذف كل من Exon 10 و Exon 11 من قبل نهاية غير متجانسة الانضمام (NHEJ).
  2. استنساخ gRNAs في pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) باستخدام تعليمات في رانوآخرون.
  3. في شكل لوحة 6 جيدا، transfect 2 × 105 mESCs مع 1 ملغ من كل EED-KO-gRNA-1 و EED-KO-gRNA-2 (انظر جدولالمواد) باستخدام كاشف الانف عبر التغوط باتباع تعليمات الشركة المصنعة. تغيير وسائل الإعلام 24 ساعة بعد التغوط.
  4. بعد يومين من الانتراب، عزل الخلايا الإيجابية GFP باستخدام فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS). نتوقع أن تختلف كفاءة التغوط حول 10-30٪. فرز حوالي 5 × 105 خلايا لالتقاط خلايا إيجابية GFP كافية للطلاء.
  5. طبق MESCs GFP إيجابية معزولة في لوحات 15 سم المغلفة مسبقا مع الجيلاتين 0.1٪ (10-20 x103 خلايا لكل لوحة) لاختيار مستعمرة.
  6. قم بزراعة الخلايا في وسط ESC لمدة أسبوع تقريبًا حتى تظهر مستعمرات واحدة. تغيير وسائل الإعلام كل يومين.
  7. اختيار ما لا يقل عن 48 مستعمرات باستخدام 20 ميكروغرام تلميح micropipette. كشط على المستعمرة في حين aspirating في طرف micropipette. لا تقم بفصل المستعمرة إلى خلايا واحدة. نقل المستعمرة إلى accutase التي تحتوي على (20 مل) 96 لوحة جيدا.
  8. احتضان المستعمرات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل جميع الخلايا.
  9. إضافة 200 مل من وسائل الإعلام ESC في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  10. تُمزج الخلايا جيداً وتُمزج في لوحتين منفصلتين من 96 بئراً باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  11. استخدام واحدة من لوحات جيدا 96 للكتابة الجينية والحفاظ على الآخر ينمو حتى يتم الانتهاء من علم الوراثة. استخدام محلول استخراج الحمض النووي لاستخراج الحمض النووي من لوحة بئر 96 باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  12. استخدام النماذج الجينية التمهيدية Gnt_EED-KO-up و Gnt_EED-KO_down، والتي تمتد على الموقع المحذوفة وأداء PCR علم الوراثة مع بوليميراز الحمض النووي طاقة بناء على تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يمكن أيضا ً استخدام أنواع أخرى من بوليميراز الحمض النووي للكتابة الجينية، ومع ذلك، فإن بوليميراز الحمض النووي من طاقة التقوى يوفر الراحة حيث يمكن تحميل تفاعل PCR مباشرة على جل عند استخدام حاجز التفاعل الملون الخاص به.
    1. مراقبة منتج الحمض النووي من انخفاض الوزن الجزيئي في الخلايا مع حذف متجانسة نسبة إلى حالة من النوع البري (WT).
      ملاحظة: لإنشاء الخلايا الخالية PRC2، الحذف المتجانس للطاردات 10 و 11 ضروري لزعزعة استقرار وتدهور EED، وهي وحدة فرعية أساسية من PRC2الأساسية 13. كفاءة استهداف كريسبر حوالي 10%.
  13. التحقق من حذف EED exon 10 و 11 وفقدان بروتين EED بواسطة تسلسل Sanger والنشاف الغربي، على التوالي.
  14. تأكيد استنفاد EED و H3K27me2/me3 من الكروماتين في خلايا EED KO بواسطة ChIP-seq باستخدام الأجسام المضادة ضد H3K27me2/me3 وEED. استخدم البروتوكول الوارد في Oksuz وآخرون، 201715 لتجارب ChIP-seq.

3. هندسة EED خروج المغلوب mESCs لإيواء Cre-ERT2 على أساس التعبير EED inducible

  1. تصميم gRNA (EED-gRNA-inducible) لإدخال قطع داخل الإنترون بعد exon 9 من EED باستخدام أداة تصميم كريسبر في Benchling16 (انظر جدول المواد).
  2. استنساخ gRNAs في pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) باستخدام تعليمات في رانوآخرون.
  3. تصميم الحمض النووي قالب المانحة التي تتألف من EED cDNA تسلسل بعد exon 9 وC-المحطة الطرفية العلم-HA علامة المنبع من تسلسل T2A-GFP، كل ذلك في الاتجاه العكسي فيما يتعلق تسلسل الجينات الذاتية.
    1. يحيط بالكاسيت مع مقبل لصق وتسلسل تعدد الإنكار المتداخلة بين مواقع loxP المقلوبة غير المتجانسة (lox66 و lox71)18.
    2. وتشمل ما لا يقل عن 500 نقطة أساس من الأسلحة homology من كل نهاية. تقسيم قالب المانحين إلى 2 أجزاء من شظايا الجينات gBlocks (انظر gBlock-1، gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" و gBlock-2-قفص متحولة "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") وتجميعها في PCR متجه حادة باستخدام استنساخ جيبسون بعد تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: gblock-2 يحتوي على بقايا العطرية (Y365) داخل قفص EED التي هي مهمة للتفاعل مع H3K27me312. gBlock-2-Wt يحتوي على بقايا نوع البرية، في حين أن gblock-2-قفص متحولة يحتوي على قفص متحولة من EED (Y365A)، غير قادر على ربط H3K27me3. ويشار إلى إنقاذ EED WT اللاإمتز ايندوب كما i-WT-r وeED غير قابللل للنسخ يتم الإشارة إلى الإنقاذ EED قفص متحولة كما i-MT-r للراحة.
  4. في شكل لوحة 6-جيدا، transfect 2 × 105 mESCs مع 1 ملغ من gRNA (EED-gRNA-inducible) و 1 ملغ من قوالب المانحين (i-WT-r أو i-MT-r) باستخدام كاشف الانف المتحول وعزل الخلايا الإيجابية GFP باستخدام FACS.
  5. اتبع الخطوات 2.3-2.11 لعزل المستعمرات الفردية الجاهزة للكتابة الجينية للاستهداف الناجح.
  6. استخدام النماذج الجينية التمهيدية Inducible_Genotype-FW-1 وInducible_Genotype-REV-1، والتي تمتد على شريط إدراج وأداء PCR علم الوراثة باستخدام بوليميراز الحمض النووي طاقة.
    ملاحظة: كفاءة الاستهداف لـ CRISPR حوالي 10%.
    1. تأكد من التكامل الصحيح للكاسيت من قبل PCR باستخدام Inducible_Genotype-FW-2 وInducible_Genotype-REV-2 التمهيديات، والتي هي خارج الأسلحة الهولوجية.
      ملاحظة: التكامل المتجانس للكاسيت ضروري لإنجاز الإنقاذ الفعال للEED. لاحظ أن الخلايا مع التكامل المتجانس سوف تنتج منتج الحمض النووي كبيرة واحدة بالمقارنة مع EED WT، والتي سوف تنتج منتج قصير.
  7. تأكيد تكامل الكاسيت بواسطة تسلسل Sanger.
  8. تأكيد التقليب من كاسيت والتعبير عن EED وغيرها من المكونات الأساسية PRC2 (على سبيل المثال، EZH2 وSUZ12) على إدارة 4-OHT من قبل النشاف الغربية.
  9. تأكيد التعبير عن T2A-GFP ونسبة الوجه عن طريق قياس التدفق. لاحظ أن التعبير عن GFP يدل على التقليب من كاسيت والتعبير عن EED.

4. بعد النوى وانتشار نشاط PRC2 على الكروماتين

  1. تأكد من أن i-WT-r و i-MT-r mESCs ليس لديها تعبير متسرب من GFP عن طريق قياس التدفق. في حالة التعبير راشح من GFP، عزل الخلايا السلبية GFP من قبل FACS قبل بدء التجربة.
  2. قم بتوسيع الـ i-WT-r وi-MT-r mESCs إلى خمس لوحات بحجم 15 سم (5x 106 خلايا لكل لوحة).
  3. حث التعبير عن WT أو قفص متحولة EED عن طريق إدارة 0.5 mM 4-OHT لمدة 0 ساعة و 12 ساعة و 24 ساعة و 36 ساعة و 8 أيام (لوحة واحدة 15 سم لكل شرط). تغيير وسائل الإعلام بعد 12 ساعة للعلاجات أطول من 12 ح. عزل الخلايا المعاد دمجها بنجاح من قبل FACS باستخدام GFP. ضبط وقت العلاجات بحيث يتم جمع جميع الشروط في وقت واحد.
  4. أداء ChIP-seq لH3K27me2، H3K27me3 للتحقيق في ترسبها الزمنية للكروماتين ردا على إعادة التعبير عن WT أو قفص متحولة EED. استخدام بروتوكول ChIP-seq بما في ذلك إعداد المكتبة مفصلةفي Oksuz وآخرون.
  5. استخدام التحكم في ارتفاع في كل عينة للسماح للمقارنة الكمية بين نقاط زمنية مختلفة19.
    1. للتحكم في ارتفاع، استخدم الكروماتين من Drosophila melanogaster (في نسبة 1:50 إلى الكروماتين المستمدة من mESC) وكذلك Drosophila محددة H2Av الأجسام المضادة (1 ميكرولتر من الأجسام المضادة H2Av لكل 4 ميكروغرام من كروماتين دروسوفيلا وفقا ل تعليمات الشركة المصنعة) في كل عينة.
    2. إعداد الكروماتين من دروسوفيلا بطريقة مماثلة لتلك التي من mESCs باستخدام البروتوكول المفصل في Oksuz وآخرون.
  6. خريطة تسلسل يقرأ لChIP-seq إلى مم10 الجينوم مع بوتي 2 باستخدام المعلمات الافتراضية20.
  7. تطبيع الماوس ChIP-seq يقرأ إلى ارتفاع في Drosophila قراءة التهم21. حساب عامل التسوية ارتفاع في باستخدام الصيغة التالية: 1 × 106/unique Drosophila قراءة التهم. نتوقع الحصول على حوالي 1 × 106Drosophila قراءة التهم و 20 × 106 الماوس قراءة التهم لكل تجربة.
    1. لا تقم بتضمين كروماتين دروسوفيلا عند تسلسل عينات الإدخال.
  8. استخدام أداة جينومكوف من bedtools لتحويل ملف بام إلى bedgraph22. المقبل، وتحويل bedgraph إلى ملف bigwig باستخدام أداة bedGraphToBigWig من USCS23،24. راجع البرنامج النصي التالي:
    gen ="المسار إلى الجينوم mm10"
    chr ="المسار إلى أحجام الكروموسوم mm10"
    inp_bam ="مسار لإدخال ملف بام "
    ضرب ="حساب عامل التطبيع ارتفاع في"
    كراسي السرير جينومكوف -bg-مقياس $multiply-ibam $inp_bam-g $gen > output.bedGraph
    فرز -k1،1 -k2،2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph
    بيدغرافتوبيجويج output_sorted.bedالرسم البياني $chr output.bw
  9. تصور كثافات قراءة ChIP-seq عن طريق تحميل ملفات bigwig على متصفح الجينوم USCS24.

5. رصد ظهور ونمو بؤر H3K27me3 في نوى mESCs

  1. لوحة 1X 104 mESCs في 8 جيدا غرفة الشرائح المغلفة مسبقا مع 0.1٪ الجيلاتين.
  2. في اليوم التالي، ابدأ في إجراء دورات تعريف ية متتالية 4-OHT (0.5 mM) لجمع الخلايا التي تعبر عن EED للنقاط الزمنية المشار إليها (0 ساعة و12 ساعة و24 ساعة و36 ساعة). تغيير وسائل الإعلام بعد 12 ساعة للعلاجات أطول من 12 ساعة.
  3. إصلاح mESCs مع 4٪ paraformaldehyde في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق.
  4. Permeabilize الخلايا مع PBS / 0.25٪ تريتون X-100 في RT لمدة 30 دقيقة.
  5. منع الخلايا مع PBS / 5٪ مصل الحمار / 0.1٪ تريتون X-100 (حظر العازلة) في RT لمدة 30 دقيقة.
  6. تمييع H3K27me3 الأجسام المضادة الأساسية 1:500 في المخزن المؤقت حظر وإضافة إلى الخلايا.
  7. حضانة الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  8. في اليوم التالي، قم بإجراء 3 عمليات تذما مع PBS/0.1% Triton X-100.
  9. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا فلور 595) 1:1000 في المخزن المؤقت حظر وإضافة إلى الخلايا.
    1. تنفيذ جميع الحضانة في الظلام في الخطوات التالية كما الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع اليكسا فلور حساسة للضوء.
  10. احتضان الأجسام المضادة الثانوية لمدة 2 ساعة في RT.
  11. إجراء 3 عمليات الشهي مع PBS /0.1% تريتون X-100.
  12. تمييع DAPI (1 ملغ / مل) 1:4000 مع PBS / 0.1٪ تريتون X-100 وإضافة إلى الخلايا.
  13. حضانة الخلايا مع DAPI لمدة 10 دقيقة في RT.
  14. جبل الخلايا مع جبل أكوا.
  15. صورة الخلايا مع الفحص المجهري البؤري في التكبير 63X.
  16. عملية والزائفة اللون الصور باستخدام توزيع ImageJ، فيجي25.

النتائج

مخطط عام لنظام الإنقاذ المشروط
ويبين الشكل 1 مخطط الاستهداف لإنقاذ خلايا EED KO بشروط مع إما WT أو قفص متحولة (Y365A) EED التي يتم التعبير عنها من موضع EED الذاتية. بعد الخروج EED، وهي وحدة فرعية أساسية من PRC2 التي هي ضرورية لاستقرارها والنشاط الأنزيمي،يتم تقديم كاسيت داخل الإنترون بعد exon 9 من EED (الشكل 1). يتكون الكاسيت من تسلسل cDNA 3 المتبقية من EED، في الاتجاه العكسي فيما يتعلق بتسلسل الجينات الذاتية.  يحيط بالشريط مواقع loxP المقلوبة غير المتجانسة (lox66 و lox71)18. يتم نشر الخلايا حتى يتم ملاحظة فقدان كامل H3K27me2/3. عند تفعيل التعبير Recombinase Cre عن طريق إضافة 4-OHT، يتم عكس كاسيت بحيث يتم لصق exon 9 في الكاسيت باستخدام تسلسل قبول لصق (الشكل1). مع هذا النظام، يمكن الآن إنقاذ خلايا EED KO إما WT أو إصدارات قفص متحولة من EED وكلاهما لديه علامة العلم HA C-الطرفية. يوفر المصب T2A-GFP علامة لتحديد الخلايا التي تخضع لحدث انعكاس ناجح. تمنع إشارة بوليا نسخ التسلسلات النهائية. مع هذا النظام، يمكن الآن اتباع حركية تجنيد PRC2 وتشكيل نطاقات H3K27me.

تتبع الترسب الزمني لـ H3K27me2/3 بوساطة PRC2
لمتابعة الديناميات الزمنية لإنشاء مجال الكروماتين بوساطة PRC2، يتم إعادة التعبير عن إصدار WT أو قفص متحولة من EED في خلفية خلايا EED KO، عند العلاج 4-OHT (الشكل2A, B). لمتابعة ترسب علامات H3K27me2/3، يتم تنفيذ ChIP-seq H3K27me2/me3 بعد إعادة التعبير عن WT أو قفص متحولة EED للنقاط الزمنية المشار إليها. ويلاحظ ظهور H3K27me3 في 12 ساعة بعد التعبير عن EED WT في المناطق المنفصلة التي يشار إليها باسم "مواقع النويات" (الشكل2C)،ثم في المناطق البعيدة عن مواقع النوى الأولية بحلول 24 ح13. في نهاية المطاف، فإن توزيع H3K27me3 يقترب تقريبا من مستويات ينظر في الخلايا الأبوية WT في 36 ساعة بعد التعبير EED WT. وتسمى مواقع المصب المنشأة زمنيا من H3K27me3 "مواقع الانتشار"13. ويمكن لهذا النظام أيضا تتبع الترسيب الزمني H3K27me2، الذي يبدو أنه يسبق ترسب H3K27me3 (الشكل2C،D). وأخيراً، فإن إعادة التعبير عن EED القفص متحولة يعرض ديناميات مختلفة بالنسبة إلى EED WT (الشكل2C,D). في هذه الحالة، ترسب H3K27me3 غير فعالة جدا، وبدلا من ذلك، H3K27me2 يصبح واضحا وأكثر تركيزا في مواقع النوى، مما يشير إلى أن القفص متحولة EED غير قادر على نشر التعديل إلى المناطق المجاورة.

ظهور بؤر H3K27me3 ونموها يمكن أيضا أن تصور عن طريق الفحص المجهري (الشكل 2E)13. قبل الحث على التعبير EED WT، H3K27me3 تلطيخ ليست واضحة. ومع ذلك، 12 ساعة من التعبير EED WT يظهر أدلة على تكوين بؤر H3K27me3. هذه البؤر زيادة في العدد والحجم بنسبة 24 ساعة، وانتشرت في نهاية المطاف إلى مناطق كبيرة من النواة بنسبة 36 ساعة من التعبير EED WT. هذا النظام يعطي دليلا على تشكيل دي نوفو من مجالات الكروماتين PRC2 بوساطة كما رصدت من قبل ChIP-seq والمناعية (الشكل2C-E)13.

figure-results-3203
الشكل 1 مخطط الاستهداف لإنقاذ EED KO mESCs بشروط إما مع WT أو قفص-MT EED (Y365A). يؤدي حذف الإكسون 10 و11 إلى زعزعة الاستقرار وتدهور EED والخسارة العالمية لH3K27me2/me3. يتم إدراج كاسيت في الإنترون بين exon 9 و 10 في الاتجاه العكسي كما هو مبين. إضافة 4-OHT يعكس كاسيت من هذا القبيل أن الزفير الذاتية 9 لصقات في قفص متحولة أو البرية نوع cDNA من كاسيت السماح بتكرار التعبير عن التأضوة أو قفص متحولة EED. تم تعديل هذا الرقم من Oksuz وآخرون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3996
الشكل 2 التحقق من صحة نظم الإنقاذ EED القابلة للإلغاء والتطبيقات التمثيلية لها (i-WT-r وi-MT-r). (A). i-WT-r و i-MT-r يتم التحقق من صحة أنظمة i-WT-r بواسطة اللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها على مقتطفات كاملة بعد العلاج 4-OHT للحث على التعبير عن WT (i-WT-r) أو قفص متحولة (i-MT-r) EED، في الوقت المشار إليه. (B). تحليل قياس التدفق للGFP في خلايا i-WT-r قبل (0 ساعة) وبعد (36 ساعة) 4-OHT العلاج لتأكيد كفاءة التعبير عن T2A-GFP، وهو ما يدل على الوجه الناجح للكاسيت المقلوب. (C، D). مسارات ChIP-seq لH3K27me3 (C) و H3K27me2 (D) بالقرب من الجين Emx1 في WT، أو في i-WT-r أو في خلايا i-MT-r، للأوقات المشار إليها من العلاج 4-OHT. يشار إلى المواقع المبكرة والمتأخرة لترسب علامات الهيستون. (E). الفلورة المناعية باستخدام الأجسام المضادة H3K27me3 في 0 و 12 و 24 و 36 ساعة بعد إنقاذ التعبير EED WT في i-WT-r mESCs. يظهر تلطيخ في 36 ساعة في التعرض أقل. اللوحة الموجودة في أقصى اليمين هي صورة مكبرة للكلمة تحمل اسم سهم أحمر. تم تعديل هذا الرقم من Oksuz وآخرون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

نهج قوي نحو فهم التفاصيل الميكانيكية أثناء تشكيل مجال كروماتين معين، هو أولا تعطيل المجال ومن ثم تتبع إعادة بنائه في التقدم داخل الخلايا. يمكن إيقاف العملية مؤقتاً في أي وقت أثناء إعادة الإعمار لتحليل الأحداث الجارية بالتفصيل. ولم تتمكن الدراسات السابقة المتعلقة بمجالات الكروماتين من حل مثل هذه الأحداث لأنها أجريت في ظل ظروف ثابتة (مثل مقارنة النوع البري وخروج الجينات من المغلوب). هنا، نحدد الخطوط العريضة لنظام لتقييم التكوين الديناميكي لمجالات الكروماتين، كما يُبرز ذلك من خلال توظيف ونشر المجالات القمعية التي تتوسط فيها PRC2 في الخلايا.

الخطوة الأكثر أهمية لهذا النظام اللابدوبي هو التصميم الدقيق لمنشآت الحمض النووي لإعادة التعبير عن البروتينات المطلوبة (أو RNA) بعد حذف كل منها من الخلايا. يمكن إدخال الطفرات المختلفة، والعلامات، وعلامات الفلورسنت داخل هذه البنيات، اعتماداً على تطبيقات المصب. على سبيل المثال، بدلاً من استخدام الببتيد T2A الذاتي الشق مباشرة قبل GFP لقطعها عن البروتين من الفائدة، يمكن توليد مختلف البروتينات الانصهار الفلورسنت للتصوير عالية الدقة و / أو تجارب تتبع الجسيمات الواحدة ل رصد الأحداث الأولية لتكوين المجال الكروماتين في الخلايا الحية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن تعديلها بطرق عديدة لتوفير رؤى في تشكيل مجالات الكروماتين، إلا أن لديها بعض القيود. أولاً، يتطلب خط خلية يؤوي جين Cre-ERT2. ثانيا، التحسينات ضرورية لتحديد النقاط الزمنية بعد العلاج 4-OHT. ثالثا، هذا النظام غير قابل للعكس وذلك لرصد الأحداث أثناء تفكيك مجال الكروماتين. يمكن استخدام الأساليب المستندة إلى Degron كبديل للطريقة الموضحة هنا26،27. هذه النظم تمكن من التدهور عكسها والسريع للبروتينات، ولكن عادة ما تتطلب جزيئات مكلفة لزعزعة استقرار البروتين، مثل أوكسين أو درع26،27. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأساليب المستندة إلى degron لها قيود. ويمكن استخدامها فقط لإعادة التعبير عن نسخة WT من البروتين بعد تدهوره. وعلى النقيض من ذلك، فإن النظام الموصوف هنا يسمح بالتعبير المشروط عن النسخة المتحولة من البروتين الذي يهمه الأمر بالإضافة إلى نظيره WT. والجمع بين نظام degron هذا والأسلوب الموصوف هنا سيكون وسيلة قوية لتعديل تشكيل مجالات الكروماتين بشكل عكسي. طريقة بديلة لمتابعة تشكيل مجالات الكروماتين ينطوي على استخدام مثبطات محددة لاستنفاد تعديل الكروماتين محددة من الكروماتين ومن ثم غسل المانع لمتابعة الترسيب دي نوفو من التعديل. على سبيل المثال، يتم استخدام العلاج مع مثبطات EZH2 والغسل اللاحقة لتتبع إعادة تشكيل مجالات H3K27me28. ومع ذلك، مثبطEZH2 ليست فعالة في استنفاد تماما H3K27me، حتى بعد 7 أيام من العلاج. في هذه الحالة، وجود H3K27me الموجودة من قبل قد تجنيد وتفعيل PRC212،مما يعقد تفسير النتائج. كذلك, استخدام المانع واستراتيجية غسل محدودة بسبب عدم وجود مثبطات محددة وقوية للعديد من مجالات الكروماتين.

بالإضافة إلى تطبيق هذه الطريقة على الأنظمة الخلوية، يمكن استخدامها لتوليد طفرات لا تُستخدم/وضع علامات على البروتينات المطلوبة في الحيوانات. في بعض الحالات، يمكن أن يكون تغيير البروتين أو إدخال علامة مميتة أثناء النمو. وتتجاوز هذه الطريقة هذه الفتكاً وتوفر التحكم الزمني والمكاني في الطفرة/وضع العلامات على البروتينات عن طريق الربط بسلالات ماوس Cre-ERT2 المحددة للأنسجة. وستكون هذه الأنواع من التجارب ذات قيمة لتحديد أثر طفرة في نسيج معين و/أو في مرحلة محددة من التطور. الأهم من ذلك، فإنه يسمح لعزل الخلايا التي تخضع لإعادة تركيب ناجحة عن طريق مراسل داخل كاسيت. وهذا يسهل التحاليل البيوكيميائية، مثل تنقية التقارب من أنسجة محددة، لعزل interactome الأنسجة الخاصة لبروتين معين. ويمكن توجيه هذا النظام لرصد التغيرات الدينامية في أي عملية خلوية معينة، وبالتالي لا يقتصر على تتبع تشكيل نطاق الكروماتين.

Disclosures

D.R. هو أحد مؤسسي شركة كوكبة المستحضرات الصيدلانية وFulcrum Therapeutics. ويعلن المؤلفون أن ليس لهم مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نشكر الدكتورس ل. فالى، د. أوزاتا وه. مو على مراجعة المخطوطة. ويدعم مختبر D.R. من قبل معهد هوارد هيوز الطبي والمعاهد الوطنية للصحة (R01CA199652 و R01NS100897).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg)SigmaH7904-5MGFor induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml)Electron Microscopy Sciences15710For immunofluorescence
2-mercaptoethanolLifeTechnologies21985-023For mESCs culture
2% Gelatin SolutionSigmaG1393-100mlFor mESCs culture
Accutase 500 MLInnovative Cell Tech/FISHERAT 104-500For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresaerch711-585-152For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting MediumFISHER/VWR41799-008For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PKFisher Sci177445PKFor immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mgLife TechD1306For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901Stemgent04-0006For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF ProteinMillipore/FisherESG1107For mESCs culture
FBS Stem Cell QualifiedAtlantaS10250For mESCs culture
Gibson Assembly Master MixNEBE2611LFor Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021Stemgent04-0004For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mABCell Signaling9728SAntibody for ChIP-seq
H3K27me3Cell Signaling9733SAntibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb)Active motif39715Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEMInvitrogen10829-018For mESCs culture
L-glutamineSigmaG7513For mESCs culture
Lipofectamine 2000LifeTech11668019For transfection
MangoTaq DNA PolymeraseBiolineBIO-21079For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL)Jackson ImmunoResearch017-000-121For immunofluorescence
Penicillin-StreptomycinSigma/RocheP0781For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction SolutionLucigenQE0905TFor Genotyping PCR
Triton X-100SigmaT8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning KitThermo FisherK270020For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducibleSequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donorhttps://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducibleSequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donorhttps://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.

References

  1. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
  2. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  3. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  4. Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
  5. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  6. Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
  7. Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
  8. Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
  9. Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
  10. Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
  11. Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
  12. Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
  13. Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
  14. Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
  15. Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
  16. Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
  17. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  18. Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90(2002).
  19. Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
  20. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  21. Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
  22. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  23. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  24. UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  27. Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  28. Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150 PRC2 H3K27me2 H3K27me3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved