A Double Humanized BLT-fareler Modeli Kararlı Bir İnsan-Benzeri Gut Mikrobiyom ve İnsan Bağışıklık Sistemi featuring

Biz fonksiyonel bir insan bağışıklık sistemi ve istikrarlı bir engrafted insan benzeri bağırsak mikrobiyomu özelliği çift insanlaşmış BLT-fareler üretmek için yeni bir yöntem açıklar. Bu protokol mikropsuz fareler veya gnotobiyotik tesisler için gerek kalmadan takip edilebilir.

İşlevsel bir insan bağışıklık sistemine sahip olan insanlaşmış fareler (hu-fareler) temelde insan patojenleri ve hastalık çalışma değişti. İnsanlarda veya diğer hayvan modellerinde incelenmesi zor veya imkansız olan hastalıkları modellemek için kullanılabilirler. Bağırsak mikrobiyomu insan sağlığı ve hastalığı üzerinde derin bir etkisi olabilir. Ancak, murine bağırsak mikrobiyomu insanlarda bulunan çok farklıdır.  Bir engrafted insan bağırsak mikrobiyomu var gelişmiş pre-klinik hu-fare modelleri için bir ihtiyaç vardır. Bu nedenle, hem insan bağışıklık sistemi hem de kararlı insan benzeri bağırsak mikrobiyomu özelliği çift hu-fareler oluşturdu. Nod. Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) fareler immün yetmezlik yüksek düzeyde nedeniyle insanlaşma için en iyi hayvanlardan biridir. Ancak, mikropiçermeyen NSG fareler, ve diğer çeşitli önemli mikropiçermeyen fare modelleri şu anda ticari olarak mevcut değildir. Ayrıca, birçok araştırma ayarları gnotobiyotik tesislere erişim yok, ve gnotobiyotik koşullar altında çalışan genellikle pahalı ve zaman alıcı olabilir. Daha da önemlisi, mikrop içermeyen farelermikropların engraftment sonra bile var olan çeşitli bağışıklık eksiklikleri var. Bu nedenle, mikropsuz hayvanlar veya gnotobiyotik tesisler gerektirmeyen bir protokol geliştirdik. Çift hu-fare üretmek için, NSG fareler kemik iliği, karaciğer, timus-humanized (hu-BLT) fareler oluşturmak için ameliyat öncesi radyasyon ile tedavi edildi. Fareler daha sonra önceden varolan murine bağırsak mikrobiyom tüketmek için geniş spektrumlu antibiyotikler ile tedavi edildi. Antibiyotik tedavisi sonrası, fareler oral gavaj yoluyla sağlıklı insan donör örnekleri ile dışkı nakli yapıldı. Çift hu-BLT fareler, nakledilen bireysel insan donör örneğine dayalı benzersiz 16S rRNA gen profillerine sahipti. Daha da önemlisi, nakledilen insan benzeri mikrobiyom, nakil sonrası 14,5 haftaya kadar çalışma süresince çift hu-BLT farelerde stabildi.

Humanized fareler (hu-fareler) hematopoyis, bağışıklık, kanser, otoimmün hastalık ve bulaşıcı hastalık¹dahil olmak üzere insan sağlığı ve hastalığıbirçok yönünü çalışma dönüştürdü^{1 ,2,3,4 ,5,6,7},^8,9. Bu hu-fareler işlevsel bir insan bağışıklık sistemine sahip ve insan ait patojenler ile enfekte olabilir diğer fare modelleri üzerinde ayrı bir avantaja sahip. Bununla birlikte, bağırsak mikrobiyomu önemi obezite, metabolik sendrom, inflamatuar hastalıklar ve kanser 10^,11,12gibi birçok insan hastalıklarında rolü ile gösterilmiştir^{, 13. yıl.} Mukozal bağışıklık sistemi ve bağırsak mikrobiyomu karşılıklı bağırsak ve sistemik homeostaz korumak için düzenlenir. Bağışıklık sistemi bağırsak mikrobiyomu tarafından sunulan antijenler tarafından şekillendirilir ve bağışıklık sistemi kommensal bağırsak bakterilerinteşvik ve patojenleri ortadan kaldırarak önemli bir düzenleyici rol oynar^{14,15, 16}- Ancak, hu-farelerin bağırsak mikrobiyomu iyi karakterize edilmemiştir ve murine bağırsak mikrobiyomu insanlardan kompozisyon ve fonksiyon önemli ölçüde farklıdır¹⁷. Bu murine ve insan bağırsak arasındaki evrimsel, fizyolojik ve anatomik farklılıklar yanı sıra hu-fare hastalığı modellerinin deneysel sonuçlarını etkileyebilir diyet gibi diğer önemli faktörler nedeniyle¹⁸. Bu nedenle, hu-farelerin murine bağırsak mikrobiyomu sınıflandırma ötesinde, bir insan bağışıklık sistemi ve insan bağırsak mikrobiyomu hem de sahip bir hayvan modeli in vivo insan hastalığının karmaşık etkileşimleri incelemek için gereklidir.

Doğrudan insan deneklerde insan hastalıklarının incelenmesi genellikle pratik değildir veya etik değildir. Birçok hayvan modeli insan immün yetmezlik virüs tip 1 (HIV-1) gibi insan patojenleri incelemek için kullanılamaz. İnsan olmayan primat modelleri genetik olarak dışlanır, çok pahalıdır ve birçok insan patojenine karşı duyarlı değildir. Mikropsuz (GF) olarak türetilmiş ve insan benzeri bağırsak mikrobiyomları ile yeniden yapılı fareleryaygın insan sağlığı ve hastalık 19^,20çalışma için kullanılmıştır. Ancak, bu hayvanların bir insan bağışıklık sistemi yok ve GF hayvanlar ile çalışan özel tesisler, prosedürler ve uzmanlık gerektirir. Bu nedenle, bağırsak mikrobiyomu ve insan bağışıklık sisteminin karmaşık ilişkisini incelemek için geliştirilmiş pre-klinik modeller için bir ihtiyaç vardır. NOD gibi birçok fare suşları. Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG), ticari olarak GF olarak kullanılamaz. GF hayvanlar da tamamen mikropların engraftment tarafından ters değildir uzun süreli bağışıklık eksiklikleri muzdarip olabilir²¹. Bu nedenle, belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında hem fonksiyonel bir insan bağışıklık sistemi ve istikrarlı insan benzeri bağırsak mikrobiyomu içeren bir çift hu-fare oluşturdu. Çift hu-fare üretmek için, kemik iliği, karaciğer, timus humanized fareler (hu-BLT) oluşturmak için NSG fareler üzerinde ameliyat yapıldı. Hu-BLT fareler daha sonra geniş spektrumlu antibiyotikler ile tedavi edildi ve daha sonra sağlıklı bir insan donör örneği ile dışkı nakli verildi. Biz 45 çift hu-BLT fareler ve 4 insan dışkı donör örnekleri 173 dışkı örneklerinin bakteriyel bağırsak mikrobiyomu karakterize. Çift hu-BLT fareler, nakledilen bireysel insan donör örneğine dayalı benzersiz 16S rRNA gen profillerine sahiptir. Daha da önemlisi, nakledilen insan benzeri mikrobiyom, nakil sonrası 14,5 haftaya kadar çalışma süresince farelerde stabildi. Buna ek olarak, öngörülen metagenomlar çift hu-BLT farelerin insan donör örneklerine daha çok benzeyen hu-farelerden farklı tahmin edilen fonksiyonel kapasiteye sahip olduğunu göstermiştir.

Burada açıklanan tüm yöntemler, Nebraska-Lincoln Üniversitesi'nde (UNL) Kurumsal Hayvan Bakım ve Araştırma Komitesi (IACUC) onaylı protokollere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. UNL'deki IACUC, çift hu-fare dahil olmak üzere hu-BLT fareleri üretmek ve kullanmakla ilgili iki protokolü onayladı. Buna ek olarak, UNL'deki Bilimsel Araştırma Gözetim Komitesi (SROC), insanlaştırılmış fareler için Gelişmiş Biyobilim Kaynakları'ndan temin edilen insan embriyonik kök hücreleri ve fetal dokuların kullanımını da onaylamıştır (SROC# 2016-1-002).

1. Farelerin barınma ve bakımı

1. Satın alma 6-8 haftalık NSG fareler (NOD. Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ).
2. Kontrollü sıcaklık, nem ve basınç içeren bir odada hava değişimi, ön filtreler ve HEPA filtreler (0,22 μm) ile SPF koşullarında fareleri barındırın.
   1. Ön filtreler ve HEPA filtreler (0,22 μm) ile hava değişimini yönetebilen bir raf sisteminde otoklavlı bireysel mikroizolatör kafeslerinde fareleri barındırın ve bakımını yap.
3. %70 etanol ile önceden işlenmiş sınıf II Tip A2 biyolojik güvenlik dumanı başlığında farelerin tüm prosedürlerini ve manipülasyonlarını gerçekleştirin. Hayvan odasında çalışmadan önce, duş ve temiz önlük, tyvek takım elbise, çizme kapakları, saç kapağı, yüz maskesi ve eldiven içine değiştirin. Cerrahi işlemler sırasında tyvek takım elbise üzerine bir ameliyat elbisesi giyin.
   NOT: Ultraviyole (UV) ışık dekontaminasyonu da prosedürlerden önce tercih edilir.
   1. Mümkünse tüm aletleri ve reaktifleri otoklavlayın ve duman kaputuna aktarıldan önce dezenfekte edin.
   2. İşlemler sırasında, hayvanların ayrı ayrı havalandırılan kafeslerini raftan çıkarın ve duman kaputuna aktarılmadan önce dezenfekte edin.
4. Fareleri radyasyonlu bir diyetle besleyin ve otoklavlı su sağlayın. Isınmış gıda ab libitum ve gerektiğinde ek ışınlanmış gıda ile ek sağlayın. Otoklavlı suyu haftalık veya gerektiği gibi değiştirin.
   NOT: Otoklavlı asitli su da kullanılabilir. Sağlanan ışınlanmış diyet üretimden sonra 6 ay raf ömrü vardı.

2. İnsanlaştırılmış BLT farelerinin üretimi

NOT: Hu-BLT fareüretimi daha önce^22,23,24olarak tanımlanmıştır.

1. Ameliyat günü, vücut ağırlığı 12 cGy / g bir dozda fareler tüm vücut ışınlama verin.
2. Fareleri ameliyata hazırlayın.
   1. Her ışınlanmış fareye 100 mg/kg çalışma konsantrasyonunda 100 mg/kg ve Xylazine karışımını 12 mg/kg konsantrasyonunda verin ve bu karışım lar, anestezi için intraperitoneal (IP) enjeksiyonu ile vücut ağırlığına göre fare başına 130-170 μL arasında değişmektedir. Ketamin ve Ksilazin karışımının 3 ml'sini hazırlamak için 100 mg/mL stok konsantrasyonuna 0.27 mL ketamin ve 100 mg/mL ile 2.7 mL steril tuz konsantrasyonuna 0.03 mL ketamin ekleyin ve iyice karıştırın. Enjeksiyondan önce cildi %70 isopropanol ile dezenfekte edin.
   2. Uzun süreli ağrı yönetimi için deri altı enjeksiyon ile her ışınlanmış fare Buprenorfin 1 mg/kg vücut ağırlığı (yarı canlı 72 saat, SR-LAB) verin.
   3. Ameliyat öncesi antibiyotik profilaksisi için IP enjeksiyonu ile her bir ışınlanmış fare 100 μL (858 μg) Cefazolin verin.
   4. Daha sonra cerrahi sitede farenin sol lateral ve medial tarafında etrafında elektrikli saç makası kullanarak farelerin saç tıraş sol böbrek ortaya çıkarmak için kullanılır.
   5. Pedal refleksi (firma ayak ucutu) ile anestezinin uygun seviyesini doğrulayın.
   6. Ameliyat sırasında herhangi bir noktada ek anestezi gerekiyorsa %3-5 oranında isofluran gazı verin.
   7. Kornea nın kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın. Gerekirse kulak etiketi uygulayın.
3. Sol böbrek kapsülü içine karaciğer ve timus dokuları implant için ameliyat gerçekleştirin.
   1. Cerrahi alan merkezinden başlayarak ve dairesel bir şekilde dışarıya doğru hareket ederek cerrahi yerinde cildi dezenfekte edin. % 70 izopropanol ve iyot ile üçüncü kez bu işlemi tekrarlayın.
   2. Forceps kullanarak, ilk bir insan fetal karaciğer dokusu parçası bir trocar içine yükleyin. Sonra forceps kullanarak, trocar içine bir insan fetal timus doku parçası yükleyin. Sonra forceps kullanarak, trocar içine başka bir insan fetal karaciğer dokusu parçası yükleyin. Dokular trokar iç boyutlarına uyacak şekilde 1-1.6 mm 3'e kadar kesilmelidir.
   3. Cildi kaldırmak için forseps kullanın ve uzunlamasına küçük bir kesim yapmak için makas kullanın. Farenin sol tarafında 1,5-2 cm kesim uzatın.
   4. Kas tabakası kaldırmak için forseps kullanın ve uzunlamasına küçük bir kesim yapmak için makas kullanın. Böbreği açığa çıkarmak için gerekli olduğu şekilde kesiği uzatın.
   5. Böbreği çevreleyen yağ dokusunu nazikçe kavrayarak böbreği açığa çıkar. Doğrudan böbrek parankim dokunmayın.
   6. Neşter kullanarak böbrek kapsülünün arka ucunda 1-2 mm'lik bir kesi yapın.
   7. Önceden yüklenmiş trocar'ı böbreğin uzun eksenine paralel olarak kesiden yavaşça yerleştirin ve böbrek kapsülü ile böbrek arasındaki dokuları serbest bırakın.
   8. Dikkatle normal konumuna böbrek ve bağırsak dönmek. Kas tabakasını ve cerrahi zımbaları kapatmak için 13mm 3/8 daire iğneli emilebilir 5/0 P-3 (P-13) dikişleri kullanın.
4. Ameliyattan sonra, kurtarma için temiz bir otoklavlı mikroizolatör kafesiçine fare koyun.
   1. Ameliyat sonrası iyileşme sırasında ısı kaybını en aza indirmek için, fareleri içeren kafesi, suyu ısıtan ve dolaşan bir su pompasına bağlı bir ısıtma yastığına koyun.
   2. Onlar sternal recumbency korumak için yeterli bilinç kazanmış olana kadar fareler izleyin.
5. Ameliyatın tamamlanmasından sonraki 6 saat içinde, kuyruk-damar yoluyla, insan fetal karaciğer dokusundan izole edilmiş CD34+ hematopoetik kök hücreleri enjekte edin.
   1. Fareleri ısı lambasıyla ısıtın. %70 isopropanol ile kuyruğu dezenfekte edin ve kuyruk damarına 1,5 ila 5 × 10⁵ kök hücre/200 μL enjekte edin.
   2. Enjeksiyondan kaynaklanan kanamayı durdurun ve fareleri mikroizolatör kafesine ve mikroisolatör kafesini kafes rafına geri getirin.
      NOT: Ameliyat sonrası fareler genellikle mikroisolatör kafesbaşına beş, iyileşme sırasında ve sonrasında birlikte yerleşirler. Ancak, fareler sadece hepsi aynı gün ameliyat edilirse birlikte barındırılır.
6. Fareleri her gün kontrol et. Cerrahi zımbaları dikkatle izleyin ve gerektiği gibi değiştirin. Yakından enfeksiyon veya rahatsızlık herhangi bir belirti için fareleri izleyin. Ameliyat sonrası birkaç gün mikroisolatör kafesinin zeminine otoklavlı yiyecek temin edin.
7. Ameliyattan 7-10 gün sonra cerrahi zımbaları çıkarın. Fareleri anestezik etmek için %3-5 oranında isofluran gazı verin. Dikkatle zımba kaldırmak ve daha sonra siteye antibiyotik ve ağrı giderici merhem uygulayın.
8. 9-12 hafta insan bağışıklık hücrelerinin yeniden yapılandırılması için izin ver, sonra insanlaşmış farelerin her medial saphenous ven periferik kan toplamak.
   1. Bilinçli fareleri, nefes almak için farenin başının yanında bir açıklık ve bir bacağı izole etmek için farenin arkasına yakın bir açıklıkla uygun büyüklükte plastik koni kısıtlaması kullanarak dizginleyin. Önce fareleri bağlama konisi kafasına koyun ve sonra bir bacağını yavaşça bacak açılışından geçirin.
   2. Sprey% 70 isopropanol ile izole bacak medial tarafı, sonra aynı siteye antibiyotik ve ağrı giderici merhem yayıldı.
      NOT: Merhem epilasyona gerek kalmadan ve damarın yerini nismenin ortaya çıkarılmasına yardımcı olur ve kan damlacıklarının oluşumuna yardımcı olur.
   3. 90° açıda 25 kalibrelik bir iğne kullanarak, damarı delin ve EDTA kaplı kan toplama tüpü kullanarak 50-100°L kan toplayın. Steril gazlı bez ile bölgeye basınç uygulayarak kanamayı durdurun. Kanama durduktan sonra fareleri kafeslerine geri ver.
      NOT: Toplanan maksimum kan hacmi genellikle haftada 50 μL veya her iki haftada 100 μL'dir.
   4. HCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19 antikorları ile akış sitometrisi kullanarak insan immün hücre reconstitution düzeyini test etmek için toplanan periferik kan kullanın.

3. Antibiyotik tedavisi

1. Antibiyotik tedavisi öncesinde, tedavi öncesi dışkı örnekleri toplayın. Fareleri yeni bir otoklavlı mikroizolatör kafesine taşıyın.
2. Her gün geniş spektrumlu antibiyotiklerden oluşan taze bir kokteyl hazırlayın.
   1. Farelerin her mikroisolatör kafesi için taze hazırlanmış Metronidazol (1 g/L), Neomisin (1 g/L), Vankomisin (0,5 g/L) ve Ampicillin (1 g/L) içeren 250 mL su hazırlayın.
      NOT: Antibiyotik takviyeli içme suyu için otoklavlı veya steril su kullanın.
   2. Antibiyotik takviyeli su 250 mL üzüm şekeri tatlandırıcı içecek karışımı 9,2 g ekleyin.
      NOT: Üzüm şekeri tatlandırılmış içecek karışımı nın kullanımı antibiyotiklerin acı tadını maskeler ve farelerde susuzluktan korunmaya yardımcı olur.
   3. Antibiyotik ve üzüm şekeri tatlandırıcı içecek karışımı takviye su değiştirin ve günlük yeni bir otoklavkafes fareler yerleştirin.
      NOT: Fareler koprophagic ve kafesleri günlük değişen bağırsak bakterileri ile kendilerini yeniden aşılama fareler engeller.
   4. Insan benzeri bağırsak mikrobiyommmuzunmatal engraftment için, 14 gün boyunca antibiyotik sağlamak. Antibiyotik tedavisi sırasında, kilo kaybı ve dehidratasyon için fareler izlemek. Tedavi süresince ilk 3-4 gün ve yaylalarda kilo kaybı beklenmektedir. Dehidratasyon oluşursa, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla fareler salin veya Ringers Çözüm verin.
      NOT: Diğer bağırsak mikrobiyom insanlaşma protokolleri antibiyotiklerin oral gavage için çağrı. Murine bağırsak bakterileri depleting etkili iken, biz içme suyuna antibiyotik ekleyerek daha az invaziv yöntem bizim insanlaşmış fareler üzerinde daha az stres koymak ve daha iyi sonuçlara yol bulundu.

4. Donör örnekleri ve dışkı nakli

1. İnsan donör dışkı örnekleri hazırlayın.
   1. İnsanlaştırılmış farelere dışkı nakli için uygun şekilde hazırlanmış dışkı mikrobiyota nakli (FMT) malzemelerini kullanın.
   2. Thaw FMT hazırlıkları ve anaerobik bir odada anaerobik koşullar altında aliquot.
   3. İstenirse, bu adımda, tarafsız bir "insan" örneği oluşturmak için dışkı örneklerinin eşit parçalarını bir araya getirin.
   4. Numunelerin karıştırılması veya karıştırılması gerekli değilse, FMT malzemesini dondurup en aza doğru eritmeye devam edin, yalnızca işlemden hemen önce çözülün.
2. İnsan dışkı nakli
   1. 14 günlük antibiyotik tedavisitamamlandıktan sonra içme suyunu otoklavlı suya çevirin ve fareleri yeni bir otoklavkafese taşıyın. Günlük kafes değişikliklerini durdurun ve her 1-2 haftada bir kafes değiştirme programını uygulayın.
   2. Antibiyotiklerin kesilmesi nden sonra 24 ve 48 saat iki dışkı nakli verin.
   3. Antibiyotik tedavisinden 24 saat sonra, gerekli miktarda FMT malzemeyi eritin, her fareye oral gavaj yoluyla 200 μL FMT malzeme verin. Tekrar prosedürü tekrar 48 saat sonrası antibiyotik.
   4. Kalan veya kalan tüm çözülmüş FMT malzemesini insanlaştırılmış farelerin kürküne veya kafes yataklarına yayın.

5. Taze dışkı numunesi toplama

1. Otoklav tek tek kağıt torbalar önce duman kaputa aktarma.
2. Duman kaputunda, her bir kağıt torbaya bir fare koyun ve farenin dışkılamasını bekleyin.
3. Steril çöçler kullanarak dışkı örneğini 1,5 mL plastik tüplerhalinde toplayın ve -80 °C'de dondurun. Fareleri mikroizole kafeslere geri ver.
   NOT: Dışkı örnekleri toplama bu yöntem herhangi bir stres manipülasyonlar indükleyici olmadan bireysel farelertaze dışkı örnek toplama sağlar.

Şekil 1 çift hu-BLT fareler oluşturmak için kullanılan yöntemlerin bir anahat gösterir ve kısaca NSG fareler için fonksiyonel bir insan bağışıklık sistemi ve istikrarlı insan benzeri bağırsak mikrobiyomu ekleme sürecini açıklar. Şekil 2, ameliyat sonrası insanlaşmış BLT-fareden periferik kanın akış sitometri analizine bir örnek göstermektedir. Şekil 3 çift hu-fareler oluşturmak için bir bağırsak mikrobiyomu aktarmak için kullanılan insan dışkı donör örneklerinin göreceli bolluk gösterir. Şekil 4, antibiyotik tedavisinin mikropsuz hayvanlarda gözlenene benzer şekilde dalak ve çekuma bağlı olan henotik değişiklikleri göstermektedir. Şekil 5, çift hu-fareleri ortaya çıkaran 16S rRNA sıralama verilerinin temel bileşen analizini (PCA) göstermektedir.

Şekil 1 : Çift insanlı BLT-fareler oluşturma. Çift hu-BLT fareler oluşturma iki aşamalı bir süreçtir. İlk adım, insan bağışıklık sistemini NSG farelere aşılamaktır. Ameliyat günü, NSG fareler kök hücreler için bir niş oluşturmak için ışınlama verilir. Fareler daha sonra insan fetal karaciğer ve timus dokuları ile implante ve insan hematopoetik kök hücreleri ile enjekte edilir. İnsan bağışıklık hücresi reconstitution yaklaşık 10 hafta ameliyat sonrası kontrol edilir.  İkinci adım insan bağırsak mikrobiyom engraft etmektir. Fareler önceden varolan murine bağırsak bakterileri azaltmak için antibiyotik ile tedavi edilir. Fareler daha sonra insan bağırsak mikrobiyom sağlamak için dışkı nakli verilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2 : İnsan bağışıklık hücresi reconstitution test çift insanlaşmış BLT-fareler. İnsanlaştırılmış BLT-fare periferik kanın akış sitometri analizine bir örnek 10 hafta ameliyat sonrası. Bu rakam lenfosit popülasyonu, mCD45- hCD45+ hücreleri, CD19+ B hücreleri, CD3+ T hücreleri, CD4+ T hücreleri ve CD8+ T hücrelerini tanımlamak için kullanılan gating stratejisini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3 : İnsan donör dışkı örnek profilleri. 3 insan donör ve karışık (tüm donör) örnekleri nin göreceli bolluğu aile düzeyinde gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4 : Antibiyotik tedavisi gören fareler mikropsuz fenotiplere benzer. Hu-fareler antibiyotik tedavisi 9 gün sonra kurban edildi (Antibiyotikler) veya hiçbir antibiyotik tedavisi (Kontrol). Antibiyotik tedavisinden sonra, insanlaşmış farelerin fenotip mikropsuz hayvanlarda görülen benzer başlar. Antibiyotik tedavisi sonucunda dalak (sol) ve çekum (sağ) büyüklüğünde bir azalma vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5 : Çift insanize BLT-fareler özelliği dışkı donör özel bağırsak mikrobiyomları. 16S rRNA sıralama veri PCA arsa insan dışkı nakli çift hu-BLT fareler bireysel insan dışkı donör benzersiz bağırsak mikrobiyomları özelliği sonra göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Burada açıklanan protokol, hem işlevsel bir insan bağışıklık sistemi hem de istikrarlı bir insan benzeri bağırsak mikrobiyomu özelliği çift hu-BLT farelerin oluşturulması içindir. Bu protokol, GF hayvanlarına ve gnotobiyotik tesislere ihtiyaç duymadan diğer insanlaşmış veya insanlaştırılmayan fare modellerine uyarlanabilir. Burada açıklanan yöntemler nispeten basit olmakla birlikte, çift hu-BLT farelerin başarılı yaratılması için önemli olan birkaç kritik ayrıntı vardır. NSG fareler son derece immünoeksik ve enfeksiyonları önlemek farelerin uzun vadeli hayatta kalma anahtarıdır. Enfeksiyonu önlemek için gerekli önlemleri aldık. İlk olarak, hayvanlar özel bir süitte hava değişim oranı yönetimi ile raf sisteminde HEPA filtreleri (0.22 μm) ile bireysel mikroizolatör kafeslerde barındırıldı. Rafın hava işleyicisi, HEPA filtreli (0,22 m) besleme ve egzoz havasının yanı sıra kafes egzoz hava sıcaklığı ve bağıl nem oranının gerçek zamanlı on-line takibi ile birlikte ön filtreler içeriyordu. İkinci olarak, hayvan odasına giren herkes duş almak ve temiz önlük ve ayakkabı giymenin yanı sıra eldiven, tek kullanımlık tyvek takım elbise, patik, saç kaputu ve yüz maskesi giymek zorunda kaldı. Üçüncü olarak, kafes değişiklikleri ve yiyecek ve su ilavesi de dahil olmak üzere tüm işlemler, %70 etanol ve UV ışığı ile önceden sterilize edilmiş Sınıf II Tip A2 biyolojik güvenlik dumanı başlığı içinde gerçekleştirilmiştir. Dördüncü olarak, aseptik cerrahi tekniği sağkalım cerrahisi sırasında kullanılan, cerrah ve yardımcıları bir cerrahi elbise ve eldiven de dahil olmak üzere ek bir koruma katmanı giyen dahil. Ameliyat, sadece steril aletler, gazlı bezler ve yara kapatma malzemeleri kullanılarak dezenfekte edilmiş duman kaputunda yapılırken, ameliyat boyunca eldiven ve aletlerin sterilitesini korudu. Son olarak, enfeksiyonu önlemek ve engrafted insan benzeri bağırsak mikrobiyomu istikrarını sağlamak için, farelere verilen tüm gıda ve su steril oldu. Tüm yiyecekler radyasyona maruz edilmeli ve tüm su otoklavlanmalıdır. Ağrı ve sıkıntıyı en aza indirmek için ameliyattan önce farelere uzun etkili buprenorfin uyguladık. Fare cerrahi anestezi için Ketamin ve Xylazine kombinasyonu çok güvenilir ve yaklaşık 30 dakika sürebilir. Bu yeterli değilse, fareleri daha fazla anestezik gaz vermek için izofluran gaz veririz. Ayrıca ameliyat sonrası fare vücut ısısını korumak için çok önemlidir. Kafesi, kuyruk damarı ile hematopoetik kök hücre enjeksiyonuna kadar ısıtılmış ısıtma yastığına koyuyoruz. O zaman, fareler anestezi den kurtarılır ve rafa geri döndü.

Murine gut mikrobiyomu tüketmek ve insan dışkı nakli için hazırlamak için, her zaman taze hazırlanmış antibiyotik kullanmak ve antibiyotik takviyeli su ve kafesleri günlük değiştirmek önemlidir. Bu 14 günlük antibiyotik tedavisi boyunca birçok mikroisolatör kafesleri kullanacak, ama fareler koprophagia yoluyla yeniden aşılanmamasını sağlar. Antibiyotik tedavisi sırasında, aynı zamanda vücut ağırlığı ve farelerin sağlığını izlemek için önemlidir. Dışkı naklinden sonra, fareler hızlı bir şekilde herhangi bir kayıp kilo kazanmak. Dışkı nakli materyali için herhangi bir donma-çözülme döngüsünü en aza indirmek ve aliquoting örnekleri gerekiyorsa bir anaerobik oda kullandığınızdan emin olmak önemlidir. Çift hu-BLT fareler oluştururken fareler üzerinde neden olan kullanım ve stresi en aza indirmek önemlidir. Bu enfeksiyonu önlemeye yardımcı olur ve uzun süreli sağkalım geliştirir.

Başlangıçta anti-mantar amphotericin B ile fareler ön tedavi çalıştı ama fareler çok iyi tedavi tahammül etmedi bulundu ve artık kullanılmaz. Ayrıca antibiyotik tedavisinin farklı sürelerini de denedik. Biz murine bağırsak bakterilerin çoğunluğu antibiyotikler7 gün sonra tükenmiş gibi görünse de, tedavi nin 14 gün sonra donör engraftment düzeyi çok daha yüksek olduğunu bulundu. Ayrıca günde iki kez oral gavaj yoluyla antibiyotik vermeye çalıştık. Ancak, bu yöntemin hu-farelerimiz için fazla invaziv olduğunu bulduk. Biz tek bir günlük gavage programı geçti ama fareler hala stresli ve sağlıksız olduğu ortaya çıktı. İçme suyuna antibiyotik sağlamanın en iyi yöntem olduğunu bulduk. Hala yeterli murine bağırsak bakterileri azaltırken fareler için miktarı işleme ve stres azaltılmış. Farelerin yeterli dozda antibiyotik almasını sağlamak ve susuzluktan korunmak için içme suyunda üzüm şekeri tatlandırılmış içecek karışımı sağladık. Fareler antibiyotik tedavisinin ilk 3-4 gün boyunca vücut ağırlığında bir azalma deneyimi yok, ancak intraperitoneal enjeksiyon yoluyla ekstra sıvı sağlanması vücut ağırlığını artırmaz. Dışkı naklinden sonra, fareler hızla kaybedilen kiloları geri kazanırlar.

Bu yöntem tekrartekrar çift hu-BLT fareler oluşturmak mümkün olsa da, model için bazı sınırlamalar vardır. Göz önünde bulundurulması gereken ilk şey hu-fareler daha az organize lenfoid yapıya sahip, germinal merkezi de dahil olmak üzere, azaltılmış antikor sınıf anahtarlama ve sınırlı afinite olgunlaşma yol. Ancak, NSG hu-BLT fareler sistemik immün reconstitution ve translatable T hücre yanıtları var ve birçok insan hastalıkları model için kullanılabilir. Başka bir konu aşırı insan bağışıklık reconstitution birkaç ay sonra bazı hu-farelerde greft-versus-host hastalığı (GVHD) potansiyel gelişimidir. Biz ve diğerleri dikkatle izlenmesi gereken blefarit, alopesi, kilo kaybı ve maloklüzyon gibi GVHD belirtileri gözlemledik²⁵.

Antibiyotikler ile farelerde bağırsak bakterileri tükenmesi için çeşitli belgelenmiş rejimler vardır^{26,27,28,29,30,31}. Biz bağırsakta bakterilerin geniş bir yelpazede hedef ve literatürde başarılı bakteriyel tükenmesi çeşitli örnekler bulduk çünkü bilinen kapasitesi nedeniyle antibiyotik bizim kokteyl seçti. Birçok yayınlanan durumlarda antibiyotiklerin çok daha az titiz bir ders kullanmak, bizim çalışmamızda, biz 14 gün bir insan benzeri bağırsak mikrobiyomu optimal engraftment için gerekli olduğunu bulundu. Biz başlangıçta Hintze ve ark dayalı bir protokol çalıştı, biz oral gavaj çok invaziv olduğunu ve anti-mantar tedavisi fareler için zararlı olduğunu bulundu²⁶. NSG hu-BLT farelerin benzersiz olduğuna ve diğer daha sağlam farelere göre daha az invaziv prosedürlerin tercih edilir olduğuna inanıyoruz. Çalışmamızda GF hayvanlarını kullanmadık. Bağırsak mikrobiyometkilerini incelemek için GF farelerin kullanımı iyi belgelenmiştir, ancak, Bu hayvanların bir insan bağışıklık sistemi yok^19,32. Ayrıca, bir GF NSG hu-BLT fare modeli ile çalışan araştırma için ilginç fırsatlar yaratacağını itiraf. İlk olarak, insan bağışıklık hücresi reconstitution ve HIV-1 gibi insan ait patogenezinin bağırsak mikrobiyomu varlığı olmadan incelenmesi ilginç sonuçlar sağlayabilir. Ayrıca, GF modelleri dışkı nakli sonrasında insan benzeri bağırsak mikrobiyomu daha tam bir reconstitution için izin verebilir. Ancak, GF fareler uzun süreli bağışıklık eksiklikleri var, bağırsak mikrobiyom reconstitution sonra bile²¹. Modelimiz, GF tesislerine göre yaygın olarak kullanılabilir ve daha ucuz olan SPF barınma koşullarını kullanma avantajına sahiptir. Tamamen GF ortamına gerek olmadığı için modelimiz aynı zamanda cerrahi olarak hu-BLT farelerin normal prosedürlerini rahatsız etmeme avantajına sahiptir.

Biz bu çift hu-BLT fare modeli sadece insan bağışıklık fonksiyonu ve insan hastalıkları çalışma için kullanılabilir benzersiz olduğuna inanıyoruz, ama aynı zamanda hastalık patogenezi ve tedavi in vivo bağırsak mikrobiyom etkisini belirlemek. Bu protokol le, insan donörözel bağırsak mikrobiyom profilleri ile tekrar tekrar çift hu-BLT fareler oluşturabilirsiniz. Bu nedenle, çift hu-BLT fareler kullanarak HIV-1 ve kanser gibi çeşitli insan hastalıkları için tedaviler üzerinde bağırsak mikrobiyom etkisini test etmek için tasarlanmış gelecekteki kişiselleştirilmiş tıp uygulamaları için yararlı olacağına inanıyoruz. Özetle, bizim çift hu-BLT fareler modeli hem fonksiyonel bir insan bağışıklık sistemi ve istikrarlı bir insan benzeri bağırsak mikrobiyomu insan sağlığı ve hastalık çalışma özellikleri önemli ve yeni bir pre-klinik modelidir.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Yanmin Wan, Guobin Kang ve Pallabi Kundu'ya BLT-insanlaşmış farelerin üretilmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Nebraska Araştırma Ağı'ndan Fonksiyonel Genomik NE-INBRE P20GM103427-14, Nörosensorysystems CoBRE P30GM110768 Moleküler Biyolojisi, Fred & Pamela'dan kısmi destek alan UNMC Genomics Çekirdek Tesisi'ne teşekkür ederiz. Buffett Kanser Merkezi - P30CA036727, Kök ve Rhizobiome Yenilik Merkezi (CRRI) 36-5150-2085-20 ve Nebraska Araştırma Girişimi. Biz Nebraska Üniversitesi - Lincoln Yaşam Bilimleri Ek ve personel yardımiçin teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hiber01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Kronik HIV Enfeksiyonu ve Yaşlanma NeuroAIDS (CHAIN) Merkezi, 1R01AI111862 Q Li tarafından desteklenmiştir.  Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin hazırlanması veya yayınlanmak üzere karar verme de hiçbir rolü yoktu.