Un modello di topi BLT a doppia umanizzata caratterizzato da un microbioma intestinale umano stabile e un sistema immunitario umano

Descriviamo un nuovo metodo per generare doppi topi BLT umani umani umani che presentano un sistema immunitario umano funzionale e un microbioma intestinale innestato stabile. Questo protocollo può essere seguito senza la necessità di topi privi di germi o strutture gnotobiotiche.

I topi umanizzati (topi arabi) che caratterizzano un sistema immunitario umano funzionale hanno cambiato radicalmente lo studio dei patogeni umani e delle malattie. Possono essere utilizzati per modellare malattie che sono altrimenti difficili o impossibili da studiare nell'uomo o in altri modelli animali. Il microbioma intestinale può avere un profondo impatto sulla salute umana e sulle malattie. Tuttavia, il microbioma intestinale murino è molto diverso da quello trovato negli esseri umani.  È necessario migliorare i modelli di hu-top preclinici che hanno un microbioma intestinale umano innestato. Pertanto, abbiamo creato due hu-topi che presentano sia un sistema immunitario umano che un microbioma intestinale umano stabile. fare cenno col capo. I topi Cg-Prkdc^ScidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) sono uno dei migliori animali per l'umanizzazione a causa del loro alto livello di immunodeficienza. Tuttavia, i topi NSG privi di germi e vari altri importanti modelli di topi privi di germi non sono attualmente disponibili in commercio. Inoltre, molte impostazioni di ricerca non hanno accesso a strutture gnotobiotiche, e lavorare in condizioni gnotobiotiche può spesso essere costoso e richiede molto tempo. È importante sottolineare che i topi privi di germi hanno diverse carenze immunitarie che esistono anche dopo l'innesto di microbi. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo che non richiede animali privi di germi o strutture gnotobiotiche. Per generare topi a doppio toro, i topi NSG sono stati trattati con radiazioni prima dell'intervento chirurgico per creare midollo osseo, fegato, topi timo-umanizzati (hu-BLT). I topi sono stati poi trattati con antibiotici ad ampio spettro per esaurire il microbioma dell'intestino murino preesistente. Dopo il trattamento antibiotico, i topi sono stati sottoposti a trapianti fecali con campioni di donatori umani sani tramite gavage orale. I topi a doppio hu-BLT avevano profili genetici di rRNA 16S unici basati sul campione di donatore umano singolo che è stato trapiantato. È importante sottolineare che il microbioma umano trapiantato è rimasto stabile nei topi a doppio hu-BLT per tutta la durata dello studio fino a 14,5 settimane dopo il trapianto.

Topi umanizzati (hu-topi) hanno trasformato lo studio di molti aspetti della salute umana e della malattia tra cui ematopoiesi, immunità, e malattie infettive^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9}. Questi hu-topi hanno il netto vantaggio rispetto ad altri modelli murini in quanto hanno un sistema immunitario umano funzionale e possono essere infettati da patogeni specifici umani. Tuttavia, l'importanza del microbioma intestinale è stata dimostrata dal suo ruolo in molte malattie umane come l'obesità, la sindrome metabolica, le malattie infiammatorie e il cancro^{10,11,12, 13}. Il sistema immunitario mucosale e il microbioma intestinale sono reciprocamente regolati per mantenere l'omeostasi intestinale e sistemica. Il sistema immunitario è modellato da antigeni presentati dal microbioma intestinale e reciprocamente il sistema immunitario svolge un importante ruolo regolatore nella promozione dei batteri intestinali commensale ed eliminazione degli agenti patogeni^{14,15, 16.}Tuttavia, il microbioma intestinale dei topi hu non è stato ben caratterizzato e il microbioma intestinale murino differisce sostanzialmente nella composizione e nella funzione degli esseri umani¹⁷. Ciò è dovuto alle differenze evolutive, fisiologiche e anatomiche tra il murino e l'intestino umano, nonché ad altri fattori importanti come la dieta, che possono influenzare i risultati sperimentali dei modelli di malattia hu-mice¹⁸. Pertanto, al di là della classificazione del microbioma intestinale murino dei topi hu, è necessario un modello animale caratterizzato sia da un sistema immunitario umano che da un microbioma intestinale umano per studiare le complesse interazioni della malattia umana in vivo.

Lo studio delle malattie umane direttamente nei soggetti umani è spesso impraticabile o non etico. Molti modelli animali non possono essere utilizzati per studiare patogeni umani come il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1). I modelli di primati non umani sono geneticamente obsoleti, molto costosi e non sono soggetti a molti patogeni umani. I topi che sono stati derivati come germi liberi (GF) e ricostituiti con microbiomi intestinali simili a come esseri umani sono stati ampiamente utilizzati per studiare la salute umana e la malattia^19,20. Tuttavia, questi animali non hanno un sistema immunitario umano e lavorare con gli animali GF richiede strutture specializzate, procedure e competenze. Pertanto, vi è la necessità di migliori modelli preclinici per studiare la complessa relazione del microbioma intestinale e del sistema immunitario umano. Molti ceppi di topi, come NOD. Cg-Prkdc^{ha recitato}Il2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG), non sono disponibili in commercio come GF. Gli animali GF possono anche soffrire di carenze immunitarie di lunga durata che non sono completamente invertite dall'innesto dei microbi²¹. Pertanto, abbiamo creato un doppio hu-topi caratterizzato sia da un sistema immunitario umano funzionale che da un microbioma intestinale umano stabile in condizioni specifiche di senza patogeni (SPF). Per generare topi a doppio toro, è stato eseguito un intervento chirurgico su topi NSG per creare midollo osseo, fegato, timo mumanizzato topi (hu-BLT). I topi hu-BLT sono stati poi trattati con antibiotici ad ampio spettro e poi sottoposti a trapianti fecali con un campione di donatori umani sano. Abbiamo caratterizzato il microbioma intestinale batterico di 173 campioni fecali di 45 topi a doppio hu-BLT e 4 campioni di donatori fecali umani. I topi a doppia to-BLT hanno profili genici di rRNA 16S unici basati sul campione di donatore umano singolo che viene trapiantato. È importante sottolineare che il microbioma umano trapiantato è rimasto stabile nei topi per tutta la durata dello studio fino a 14,5 settimane dopo il trapianto. Inoltre, i metagenomi previsti hanno mostrato che i topi a doppio hu-BLT hanno una capacità funzionale prevista diversa rispetto ai topi umani che è più simile ai campioni di donatori umani.

Tutti i metodi qui descritti sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura degli animali (IACUC) presso l'Università del Nebraska-Lincoln (UNL). L'IACUC all'UNL ha approvato due protocolli relativi alla generazione e all'utilizzo di topi hu-BLT, tra cui i doppi hu-topi. Inoltre, il Comitato di supervisione della ricerca scientifica (SROC) dell'UNL ha anche approvato l'uso di cellule staminali embrionali umane e tessuti fetali, che vengono acquistati dalle risorse biologiche avanzate per gli studi umanizzati sui topi (SROC 2016-1-002).

1. Alloggiamento e manutenzione dei topi

1. Acquista topi NSG di 6-8 settimane (NOD. Cg-Prkdc^{ha scritto}Il2rg^tm1Wjl/SzJ).
2. In una stanza con temperatura controllata, umidità e pressione, i topi sono in camera in condizioni SPF con cambi d'aria, prefiltri e filtri HEPA (0,22 m).
   1. Conservare e mantenere i topi in gabbie di microisolatore autoclaved in un sistema rack in grado di gestire lo scambio d'aria con prefiltri e filtri HEPA (0,22 m).
3. Eseguire tutte le procedure e le manipolazioni dei topi in un cappuccio con fumi di sicurezza biologica di classe II di tipo A2 che è stato pre-trattato con il 70% di etanolo. Prima di lavorare nella stanza degli animali, doccia e cambiare in scrub puliti, tuta tyvek, copriscarpe, berretto per capelli, maschera per il viso, e guanti. Indossare un abito da intervento chirurgico sopra la tuta tyvek durante le procedure chirurgiche.
   NOTA: la decontaminazione della luce ultravioletta (UV) è preferibile anche prima delle procedure.
   1. Autoclave tutti gli strumenti e reagenti, se possibile, e poi disinfettare prima del trasferimento al cofano fuma.
   2. Durante le procedure, rimuovere le gabbie a ventilazione individuale degli animali dal rack e disinfettare prima del trasferimento nella cappa del fume.
4. Alimentare i topi una dieta irradiata e fornire acqua autoclaved. Fornire cibo irradiato ab libitum e integrare con ulteriori alimenti irradiati in base alle esigenze. Modificare l'acqua autoclaved settimanale o in base alle esigenze.
   NOTA: È possibile utilizzare anche acqua acidificata autoclaved. La dieta irradiata fornita ha avuto una durata di conservazione di 6 mesi dopo la produzione.

2. Generazione di topi umanizzati BLT

NOTA: La generazione di topi hu-BLT è stata descritta in precedenza^22,23,24.

1. Il giorno dell'intervento chirurgico, dare ai topi irradiazione di tutto il corpo ad una dose di 12 cGy/g di peso corporeo.
2. Preparare i topi per l'intervento chirurgico.
   1. Dare a ogni topo irradiato una miscela di Ketamina alla concentrazione di lavoro di 100 mg/kg e Xylazina alla concentrazione di 12 mg/kg, che variava da 130-170 l per topo in base al peso corporeo mediante iniezione intraperitoneale (IP) per l'anestesia. Per preparare 3 ml della miscela di Ketamina e Xylazina, aggiungere 0,27 mL di Ketamina alla concentrazione di scorte di 100 mg/mL e 0,03 mL di Xylazine alla concentrazione di 100 mg/mL a 2,7 mL di salina sterile e mescolare bene. Disinfettare la pelle con il 70% di isopropanolo prima dell'iniezione.
   2. Dare a ogni topo irradiato Buprenorfina 1 mg/kg di peso corporeo (mezzo vivo 72 h, SR-LAB) con iniezione sottocutanea per una gestione del dolore di lunga durata.
   3. Dare a ogni topo irradiato 100 (858 g) di Cefazolin mediante iniezione IP per la profilassi antibiotica preoperatoria.
   4. Rasare i capelli dei topi utilizzando tagliacapelli elettrici intorno al lato laterale sinistro e mediale del topo presso il sito chirurgico successivo utilizzato per esporre il rene sinistro.
   5. Verificare il livello corretto di anestesia mediante riflesso pedale (pizzico di dita dell'aldino).
   6. Dare gas isoflurane al 3-5% se è necessaria un'anestesia aggiuntiva in qualsiasi momento durante l'intervento chirurgico.
   7. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la disidratazione corneale. Se necessario, applicare il tag dell'orecchio.
3. Eseguire un intervento chirurgico per impiantare i tessuti del fegato e del timo nella capsula renale sinistra.
   1. Disinfettare la pelle nel sito chirurgico applicando lo scrub allo iodio partendo dal centro del sito chirurgico e muovendosi verso l'esterno in modo circolare. Ripetere questo processo con 70% isopropanolo e una terza volta con iodio.
   2. Utilizzando le pinze, caricare prima un frammento di tessuto epatico fetale umano in un trocar. Quindi, usando le pinze, carica un frammento di timo fetale umano nel trocar. Quindi usando le pinze, carica un altro frammento di tessuto epatico fetale umano nel trocar. I tessuti devono essere tagliati a 1-1,6 mm³ per adattarsi alle dimensioni interne del trocar.
   3. Utilizzare pinze per sollevare la pelle e utilizzare le forbici per fare un piccolo taglio longitudinalmente. Estendere il taglio a 1,5-2 cm sul lato sinistro del mouse.
   4. Utilizzare pinze per sollevare lo strato muscolare e utilizzare le forbici per fare un piccolo taglio longitudinalmente. Estendere il taglio in base alle esigenze per esporre il rene.
   5. Esporre il rene afferrando delicatamente il tessuto adiposo che circonda il rene. Non toccare direttamente il parenchyma renale.
   6. Fare un'incisione di 1-2 mm all'estremità posteriore della capsula renale utilizzando un bisturi.
   7. Inserire lentamente il trocar precaricato attraverso l'incisione parallelamente al lungo asse del rene e rilasciare i tessuti tra la capsula renale e il rene.
   8. Riportare con attenzione il rene e l'intestino alla loro posizione normale. Utilizzare suture assorbenti 5/0 P-3 (P-13) con ago da 13 mm a 3/8 cerchio per chiudere lo strato muscolare e le graffette chirurgiche per chiudere la pelle.
4. Dopo l'intervento chirurgico, mettere il mouse in una gabbia microisolatore autoclaved pulito per il recupero.
   1. Per ridurre al minimo la perdita di calore durante il recupero post-chirurgico, mettere la gabbia contenente i topi su una piastra di riscaldamento collegata a una pompa dell'acqua che riscalda e fa circolare l'acqua.
   2. Monitorare i topi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente consapevolezza per mantenere la recumbency sternale.
5. Entro 6 h dal completamento della chirurgia, attraverso la vena della coda, iniettare cellule staminali ematopoietiche CD34 isolate dal tessuto epatico fetale umano.
   1. Riscaldare i topi con una lampada termica. Disinfettare la coda con il 70% di isopropanolo e iniettare da 1,5 a 5 x 10⁵ cellule staminali/200 -L nella vena della coda.
   2. Fermare qualsiasi sanguinamento dall'iniezione e riportare i topi alla gabbia del microisolatore e la gabbia del microisolatore al rack della gabbia.
      NOTA: I topi post-chirurgia sono in genere alloggiati insieme, cinque per gabbia microisolatore, durante e dopo il recupero. Tuttavia, i topi sono alloggiati insieme solo se hanno ricevuto tutti un intervento chirurgico nello stesso giorno.
6. Controllare i mouse ogni giorno. Monitorare attentamente le graffette chirurgiche e sostituirle in base alle esigenze. Monitorare attentamente i topi per qualsiasi segno di infezione o disagio. Fornire cibo autoclaved sul pavimento della gabbia microisolatore per un paio di giorni dopo l'intervento chirurgico.
7. Rimuovere le graffette chirurgiche 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico. Dare gas isoflurane al 3-5% per anetizzare i topi. Rimuovere con attenzione le graffette e quindi applicare antibiotico e antidolorifico unguento sul sito.
8. Lasciare 9-12 settimane per la ricostituzione delle cellule immunitarie umane, quindi raccogliere il sangue periferico dalla vena saphenous mediale da ciascuno dei topi umanizzati.
   1. Restrain topo coscienti utilizzando un cono di plastica di dimensioni appropriate con un'apertura vicino alla testa del mouse per la respirazione e un'apertura vicino alla parte posteriore del mouse per isolare una gamba. Mettere prima i topi nella testa del cono di ritenuta e poi tirare delicatamente una gamba attraverso l'apertura della gamba.
   2. Spruzzare il lato mediale della gamba isolata con il 70% isopropanolo, quindi diffondere antibiotici e alleviare il dolore unguento sullo stesso sito.
      NOTA: L'unguento aiuta a rivelare la posizione della vena senza la necessità di depilazione e aiuta anche nella formazione delle gocce di sangue.
   3. Utilizzando un ago calibro 25 con un angolo di 90 gradi, forare la vena e raccogliere 50-100 - L di sangue utilizzando un tubo di raccolta del sangue rivestito EDTA. Fermare l'emorragia applicando pressione al sito con garza sterile. Una volta che l'emorragia si è fermata, riportare i topi alla loro gabbia.
      NOTA: I volumi di sangue massimi raccolti sono in genere di 50 - L a settimana o 100 L ogni due settimane.
   4. Utilizzare il sangue periferico raccolto per testare il livello di ricostituzione delle cellule immunitarie umane utilizzando citometria di flusso con anticorpi per hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.

3. Trattamento antibiotico

1. Prima del trattamento antibiotico, raccogliere campioni fecali pre-trattamento. Spostare i topi in una nuova gabbia di microisolatori autoclaved.
2. Preparare un cocktail fresco di antibiotici ad ampio spettro ogni giorno.
   1. Preparare 250 mL di acqua contenente Metronidazolo appena preparato (1 g/L), neomycin (1 g/L), Vancomycin (0,5 g/L) ed Ampicillin (1 g/L) per ogni gabbia di topi microisolatore.
      NOTA: Utilizzare acqua autoclaved o sterile per l'acqua potabile integrata antibiotica.
   2. Aggiungere 9,2 g di zuppa di bevanda zuccherata dello zucchero d'uva a 250 mL di acqua integrata antibiotica.
      NOTA: L'uso di zucchero d'uva addolcito bevanda mix maschera il sapore amaro degli antibiotici e aiuta a prevenire la disidratazione nei topi.
   3. Cambiare l'antibiotico e lo zucchero d'uva zuccherato miscela di acqua integrata e posizionare i topi in una nuova gabbia autoclaved ogni giorno.
      NOTA: I topi sono coprofagici e cambiare le gabbie ogni giorno impedisce ai topi di ri-inocularsi con batteri intestinali.
   4. Per il massimo innesto del microbioma intestinale simile all'uomo, fornire antibiotici per 14 giorni. Durante il trattamento antibiotico, monitorare i topi per la perdita di peso e la disidratazione. La perdita di peso è prevista durante i primi 3-4 giorni e altipiani dopo che per la durata del trattamento. Se si verifica la disidratazione, dare i topi salina o Ringers Soluzione tramite iniezione intraperitoneale.
      NOTA: Altri protocolli di umanizzazione del microbioma intestinale richiedono l'inganno orale degli antibiotici. Pur esaurendo i batteri dell'intestino murno, abbiamo scoperto che il metodo meno invasivo per aggiungere antibiotici all'acqua potabile mette meno stress sui nostri topi umanizzati e ha portato a risultati migliori.

4. Campioni di donatori e trapianti fecali

1. Preparare campioni fecali donatore umano.
   1. Utilizzare fonti adeguatamente preparate di materiale fecale di trapianto di microbiota (FMT) per il trapianto fecale nei topi umanizzati.
   2. Scongelare i preparati FMT e in condizioni anaerobiche in una camera anaerobica.
   3. Se lo si desidera, in questa fase mescolare parti uguali dei campioni fecali insieme per creare un campione "umano" imparziale.
   4. Continuare a congelare e scongelare il materiale FMT al minimo, se l'aliquota o la miscelazione di campioni non è necessaria, solo scongelare immediatamente prima della procedura.
2. Trapianto fecale umano
   1. Dopo 14 giorni di trattamento antibiotico, cambiare l'acqua potabile in acqua autoclata e spostare i topi in una nuova gabbia autoclaved. Fermare i cambiamenti giornalieri della gabbia e implementare una volta ogni 1-2 settimane gabbia cambiando programma.
   2. Dare due trapianti fecali a 24 e 48 h dopo la cessazione degli antibiotici.
   3. 24 h dopo il trattamento antibiotico, scongelare la quantità necessaria di materiale FMT, dare a ogni topo 200 l di materiale FMT tramite gavage orale. Ripetere la procedura a 48 h dopo gli antibiotici.
   4. Stendere il materiale FMT scongelato rimanente o residuo sulla pelliccia dei topi umanizzati o sulla biancheria da letto della gabbia.

5. Raccolta di campioni fecali freschi

1. Autoclave singoli sacchetti di carta prima del trasferimento al cofano fume.
2. Nel cofano dei fumi, mettere un mouse in ogni singolo sacchetto di carta e lasciare che il mouse si distorchi.
3. Utilizzando pinze sterili, raccogliere il campione fecale in tubi di plastica da 1,5 ml e congelare a -80 gradi centigradi. Riportare i topi nelle gabbie dei microisolatori.
   NOTA: Questo metodo di raccolta di campioni fecali consente la raccolta di campioni fecali freschi da singoli topi senza alcuna manipolazione di stress.

La figura 1 mostra un contorno dei metodi utilizzati per creare topi a doppia hu-BLT e descrive brevemente il processo di aggiunta di un sistema immunitario umano funzionale e di un microbioma intestinale umano stabile ai topi NSG. La figura 2 mostra un esempio di analisi della citometria di flusso del sangue periferico da un topo BLT umanizzato 10 settimane dopo l'intervento chirurgico. La figura 3 mostra l'abbondanza relativa dei campioni di donatori fecali umani utilizzati per trasferire un microbioma intestinale per creare doppi topori. La figura 4 mostra i cambiamenti fenotipici indotti dal trattamento antibiotico alla milza e al cecum, simili a quelli osservati negli animali privi di germi. La figura 5 mostra un grafico principale dell'analisi dei componenti (PCA) dei dati di sequenziamento del rRNA 16S che rivelano che i topi a doppio hu hanno microbiomi intestinali simili a quelli umani che sono unici per il campione del donatore umano.

Figura 1 : Creazione di doppi topi BLT umanizzati. La creazione di topi a doppia hu-BLT è un processo in due fasi. Il primo passo è quello di innestare il sistema immunitario umano ai topi NSG. Il giorno dell'intervento chirurgico, ai topi NSG viene data irradiazione per creare una nicchia per le cellule staminali. I topi vengono poi impiantati con fegato fetale umano e tessuti timo e iniettati con cellule staminali ematopoietiche umane. La ricostituzione delle cellule immunitarie umane viene controllata circa 10 settimane dopo l'intervento chirurgico.  Il secondo passo è quello di innestare il microbioma intestinale umano. I topi sono trattati con antibiotici per ridurre i batteri dell'intestino murino preesistenti. I topi vengono poi sottoposti a trapianti fecali per fornire il microbioma intestinale umano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Testare la ricostituzione delle cellule immunitarie umane in doppi topi BLT umanizzati. Un esempio di analisi della citometria di flusso di un sangue periferico bIL umanizzato 10 settimane dopo l'intervento chirurgico. La figura mostra la strategia di gating utilizzata per identificare la popolazione di linfociti, le cellule mCD45- hCD45, le cellule B CD19, le cellule T CD3, le cellule T CD4 e le cellule T CD8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : profili di campioni fecali del donatore umano. L'abbondanza relativa dei 3 donatori umani e dei campioni misti (tutti donatori) mostrati a livello familiare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : i topi trattati con antibiotici assomigliano a fenotipi privi di germi. I topi hu sono stati sacrificati dopo 9 giorni di trattamento antibiotico (Antibiotici) o nessun trattamento antibiotico (Controllo). Dopo il trattamento antibiotico, il fenotipo dei topi umanizzati inizia ad assomigliare a quelli visti negli animali privi di germi. Come risultato del trattamento antibiotico c'è una riduzione delle dimensioni della milza (a sinistra) e il cecum è ingrandito (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : I topi BLT a due umanisti umanizzati sono dotati di microbiomi intestinali specifici per donatori fecali. La trama PCA dei dati di sequenziamento rRNA 16S mostra dopo il trapianto fecale umano, i topi a doppio hu-BLT presentano microbiomi intestinali unici per il singolo donatore fecale umano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il protocollo qui descritto è per la creazione di topi a doppia hu-BLT che presentano sia un sistema immunitario umano funzionale che un microbioma intestinale stabile simile all'uomo. Questo protocollo può essere adattato ad altri modelli di topi umanizzati o non umanizzati senza la necessità di animali GF e strutture gnotobiotiche. Mentre i metodi qui descritti sono relativamente semplici, ci sono diversi dettagli critici che sono importanti per la creazione di successo di topi a doppia hu-BLT. I topi NSG sono estremamente immunodeficienti e prevenire le infezioni è fondamentale per la sopravvivenza a lungo termine dei topi. Abbiamo preso le seguenti misure per prevenire l'infezione. In primo luogo, gli animali sono stati alloggiati in gabbie di microisolatori individuali con filtri HEPA (0,22 m) in un sistema rack con gestione del tasso di cambio dell'aria in una suite dedicata. Il gestore dell'aria per il rack conteneva pre-filtri insieme all'alimentazione e all'aria di scarico filtrate HEPA (0,22 m), nonché il monitoraggio on-line in tempo reale della temperatura dell'aria di scarico della gabbia e dell'umidità relativa. In secondo luogo, tutti coloro che sono entrati nella stanza degli animali hanno dovuto fare la doccia e indossare scrub e scarpe puliti, nonché indossare guanti, abiti usa e getta tyvek, stivaletti, cofano per capelli e maschera per il viso. In terzo luogo, tutte le procedure, compresi i cambiamenti delle gabbie e l'aggiunta di cibo e acqua, sono state eseguite all'interno di una cappa di fumi di sicurezza biologica di classe II Tipo A2 pre-sterilizzata con il 70% di etanolo e luce UV. In quarto luogo, è stata utilizzata la tecnica chirurgica assettica durante l'intervento chirurgico di sopravvivenza, che includeva il chirurgo e gli assistenti che indossavano un ulteriore livello di protezione tra cui un abito da intervento e guanti. La chirurgia è stata condotta nella cappa fumi disinfettata, utilizzando solo strumenti sterili, garze e materiali di chiusura delle ferite, pur mantenendo la sterilità di guanti e strumenti durante l'intervento chirurgico. Infine, per prevenire l'infezione e garantire la stabilità del microbioma intestinale simile all'uomo innestato, tutto il cibo e l'acqua somministrati ai topi erano sterili. Tutto il cibo dovrebbe essere irradiato e tutta l'acqua dovrebbe essere autoclaved. Per ridurre al minimo il dolore e l'angoscia, abbiamo somministrato la buprenorfina ad azione prolungata sottocutanea ai topi prima dell'intervento chirurgico. La combinazione di Ketamina e Xylazina per l'anestesia chirurgica del topo è molto affidabile e può durare circa per 30 min. Se questo non è abbastanza lungo, diamo gas islurane per anesizzare ulteriormente i topi. È anche molto importante mantenere la temperatura corporea del mouse post-chirurgia. Abbiamo messo la gabbia sul pad riscaldato fino all'iniezione di cellule staminali ematopoietiche attraverso la vena della coda. A quel tempo, i topi vengono recuperati dall'anestesia e riportati al rack.

Per esaurire il microbioma intestinale murino e prepararsi per il trapianto fecale umano, è importante utilizzare sempre antibiotici appena preparati e cambiare l'acqua e le gabbie integrate con antibiotici ogni giorno. Questo userà molte gabbie microisolatori durante il trattamento antibiotico di 14 giorni, ma assicura che i topi non vengano re-inoculati attraverso la coprofagia. Durante il trattamento antibiotico, è anche fondamentale monitorare il peso corporeo e la salute dei topi. Dopo un trapianto fecale, i topi riacquistano rapidamente qualsiasi perdita di peso. È importante ridurre al minimo eventuali cicli di congelamento-disgelo per il materiale fecale di trapianto e assicurarsi di utilizzare una camera anaerobica se è necessario l'aliquota dei campioni. Durante la creazione di topi a doppia hu-BLT è importante ridurre al minimo la manipolazione e lo stress indotti sui topi. Questo aiuta a prevenire l'infezione e migliora la sopravvivenza a lungo termine.

Inizialmente abbiamo cercato di pre-trattare i topi con amphotericina B antifungina, ma abbiamo scoperto che i topi non tolleravano il trattamento molto bene e non viene più utilizzato. Abbiamo anche sperimentato diverse durate del trattamento antibiotico. Abbiamo scoperto che mentre la maggior parte dei batteri intestinali murini sembrano essere esauriti dopo 7 giorni di antibiotici, il livello di innesto del donatore è molto più alto dopo 14 giorni di trattamento. Abbiamo anche provato la somministrazione di antibiotici attraverso gavage orale due volte al giorno. Tuttavia, abbiamo scoperto che questo metodo era troppo invasivo per i nostri hu-topi. Siamo passati a un singolo programma giornaliero di gavage, ma i topi sembravano ancora essere stressati e malsani. Abbiamo scoperto che fornire antibiotici nell'acqua potabile era il metodo migliore. Ha ridotto la manipolazione della quantità e lo stress ai topi, pur riducendo adeguatamente i batteri dell'intestino murno. Abbiamo fornito la miscela di bevande zucchero d'uva zuccherata nell'acqua potabile per garantire che i topi ricevessero un adeguato dosaggio di antibiotici e per prevenire la disidratazione. I topi sperimentano una riduzione del peso corporeo durante i primi 3-4 giorni di trattamento antibiotico, ma fornire liquidi extra tramite iniezione intraperitoneale non aumenta il peso corporeo. Dopo un trapianto fecale, i topi riacquistano rapidamente il peso perso.

Mentre questo metodo è in grado di generare in modo riproducibile topi a doppia hu-BLT, ci sono alcune limitazioni al modello. La prima cosa da considerare è che i topi hu hanno una struttura linfoide meno organizzata, compreso il centro germinale, che porta a una riduzione della commutazione di classe anticorpale e a una limitata maturazione dell'affinità. Tuttavia, i topi NSG hu-BLT hanno una ricostituzione immunitaria sistemica e risposte traducibili delle cellule T e possono essere utilizzati per modellare molte malattie umane. Un altro problema è il potenziale sviluppo della malattia innesto contro l'ospite (GVHD) in alcuni topi hu dopo diversi mesi di eccessiva ricostituzione immunitaria umana. Noi e altri abbiamo osservato manifestazioni GVHD come blepharitis, alopecia, perdita di peso, e malocclusione che devono essere attentamente monitorati²⁵.

Ci sono diversi regimi documentati per esaurire i batteri intestinali nei topi con antibiotici^{26,27,28,29,30,31}. Abbiamo scelto il nostro cocktail di antibiotici a causa della loro capacità nota di indirizzare una vasta gamma di batteri nell'intestino e perché abbiamo trovato diversi esempi di esaurimento batterico di successo nella letteratura. Molti casi pubblicati usano un ciclo molto meno rigoroso di antibiotici, ma nel nostro studio, abbiamo scoperto che sono necessari 14 giorni per un innesto ottimale di un microbioma intestinale simile a quello umano. Mentre inizialmente abbiamo provato un protocollo basato su Hintze et al., abbiamo scoperto che il gavage orale era troppo invasivo e che il trattamento antifungini era dannoso per i topi²⁶. Crediamo che i topi NSG hu-BLT siano unici e le procedure meno invasive siano preferite rispetto ad altri topi più robusti. Non abbiamo usato animali GF nel nostro studio. L'uso di topi GF per studiare gli effetti del microbioma intestinale è stato ben documentato, tuttavia, questi animali non hanno un sistema immunitario umano^19,32. Inoltre, ammettiamo che lavorare con un modello di topi goft hu-BLT creerebbe interessanti opportunità per la ricerca. Per prima cosa, studiare la ricostituzione delle cellule immunitarie umane e la patogenesi di patogeni specifici umani come l'HIV-1 senza la presenza del microbioma intestinale potrebbe fornire risultati interessanti. Inoltre, i modelli GF possono consentire una ricostituzione più completa di un microbioma intestinale simile a quello umano dopo il trapianto fecale. Tuttavia, i topi GF hanno carenze immunitarie di lunga durata, anche dopo la ricostituzione del microbioma intestinale²¹. Il nostro modello ha il vantaggio di utilizzare le condizioni abitative SPF, che sono ampiamente disponibili e meno costose rispetto alle strutture GF. Il nostro modello ha anche il vantaggio di non perturbare le normali procedure di generazione chirurgica di topi hu-BLT perché non c'è bisogno di un ambiente completamente GF.

Crediamo che questo modello murino a doppia hu-BLT sia unico in quanto non solo può essere utilizzato per studiare la funzione immunitaria umana e le malattie umane, ma anche per determinare l'impatto del microbioma intestinale sulla patogenesi e sul trattamento in vivo della malattia. Con questo protocollo, possiamo creare in modo riproducibile topi a doppia hu-BLT con profili di microbiomica intestinale specifici del donatore umano. Pertanto, riteniamo che l'utilizzo di topi a doppia hu-BLT sarà vantaggioso per future applicazioni di medicina personalizzata progettate per testare l'impatto del microbioma intestinale sui trattamenti per varie malattie umane come l'HIV-1 e il cancro. In sintesi, il nostro modello di topi a doppia hu-BLT è un importante e nuovo modello preclinico che presenta sia un sistema immunitario umano funzionale che un microbioma intestinale umano stabile per studiare la salute umana e la malattia.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamo Yanmin Wan, Guobin Kang e Pallabi Kundu per la loro assistenza nella generazione di topi umanizzati con BLT. Vorremmo riconoscere l'UNMC Genomics Core Facility che riceve un supporto parziale dal Nebraska Research Network In Genomica Funzionale NE-INBRE P20GM103427-14, La Biologia Molecolare dei Sistemi Neurosensoriali CoBRE P30GM110768, The Fred & Pamela Buffett Cancer Center - P30CA036727, Il Centro per l'innovazione radicale e rhizobiome (CRRI) 36-5150-2085-20, e l'iniziativa di ricerca del Nebraska. Ringraziamo l'Università del Nebraska - Lincoln Life Sciences Annex e il loro staff per la loro assistenza. Questo studio è supportato in parte dal National Institutes of Health (NIH) Grants R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Chronic HIV Infection and Aging in NeuroAIDS (CHAIN) Center, 1R01AI111862 to Q Li.  I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella preparazione del manoscritto o nella decisione per la pubblicazione.