Tau Aggregation Lentiviral kullanarak eğitim için bir In vitro modeli-ınsan nöronların aracılı dönüştürücü

Bu protokol, insan nöronal kültürlerin mutant insan Tau için lentiviral yapıları ile dönüştürücü olduğu bir prosedür ayrıntıları. Traned kültürler Tau toplamları ve ilişkili patolojileri görüntüler.

Protein Tau aberrant toplama patilik nörodejeneratif hastalıkların bir dizi dahil, Alzheimer hastalığı (AD) dahil olmak üzere. Tauopati fare modelleri toplanan Tau nörotoksisik mekanizmaları araştırmak için değerli bir kaynak sağladı rağmen, bu giderek belirgin hale geliyor, nörofizyolojide türler arası farklılıklar nedeniyle, fare beyni için uygun değildir insan durumunu modelleme. Hücre kültürü yöntemlerindeki gelişmeler insan nöronal kültürlerini deneysel kullanım için erişilebilir hale almış ve nörokemoterapi gelişiminde destekli olmuştur. Ancak, insan nöronal hücre kültürlerinin adaptasyon rağmen, insan tauopati in vitro modellerde henüz yaygın olarak mevcut değildir. Bu protokol, insan nöronların lentiviral türeyen vektörler ile transkif olduğu, patik olarak mutasyona uğramış Tau için kod olan, Sarı floresan proteini (YFP) muhabiri olan Tau toplama hücresel modelini açıklar. Dönüştürücü kültürler, Tiyoflavin ve neurotoksisite görüntüleme belirteçleri için pozitif leke Tau agrega üretmek, gibi azalan Akral uzunluğu ve artmış lizozomal hacim gibi. Bu prosedür, insan tauopathies okumak için yararlı ve ekonomik bir model olabilir.

Microtubule ilişkili protein Tau patolojik toplama birçok nörodejeneratif hastalıkların tanımlama özelliğidir, ad dahil, Frontotemporal Demans (FTD), Pick hastalığı, ve Progressive supranucleer palsi (PSP)¹. Hastalıklı olmayan bir durumda, Tau, nöronal akkıslar²' de microtubül filayonlarını bağlar ve stabilize eder. Ancak, Tau hastalığı ilişkili hiperfosforilasyon Tau toplama teşvik, microtubules ayrışma, ve nöronal toksisite³. Toplanan Tau toksik etkileri kolinerjik⁴ ve glutamaterjik reseptörlerin anormal aktivasyonu içerebilir⁵ hücre içi kalsiyum disregülasyon sonucu, ve sonunda, hücrenin ölümü. Hayvan modellerinde, beyin Tau azalma AD fareler⁶ ve tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarı fare modellerinde patolojisini geliştirir⁷.

Montaj kanıtların yapısı ve bağlama benzeşimi fare türevi Tau insan türetilen Tau farklıdır ve bu fare Tau insan tauopathies⁸modelleme için uygun olmadığını gösterir. Ancak, insan hücresi tauopati modelleri yaygın olarak satışa sunulmaz. Bu çalışmanın genel hedefi, insan nöronlarının mutant insan Tau yapıları içeren lentiviral türevi vektörler ile dönüştürücü olduğu Tau toplama bir in vitro modeli açıklamak için⁹. Tau toplama neden lentiviral yapıları, P301L ve V337M mutasyonlar bir YFP Reporter (Tau-WT-YFP) için kullanılan Wild-Type (WT) Tau tekrarlama etki alanı için kod yapıları sırasında erimiş Tau Yinele etki alanı için ek olarak bir rıld (Tau-rdlm-YFP). Nöronal kültürler bu yöntemi kullanarak transribe yaklaşık dokuz kat daha fazla Tau nondönüştürüclü kültürler daha. Tau-RDLM-YFP-ve Tau-WT-YFP-traned hücreler arasında aşırı ifade edilen Tau ifadesinin miktarı kabaca eşit olsa da, yalnızca Tau-RDLM-YFP görüntü toplamları ile dönüştürücüye gelen nöronlar. Kültürler Tau-rdlm-YFP ile traned, Tiyoflavin için pozitif leke ve akal uzunlukta ve sinaptik yoğunlukta görüntü indirimleri. Bu nedenle, bu hücresel model in vitro Tau toplama okumak için yararlı bir araç olabilir.

1. medya ve Reaktiflerin hazırlanması

1. Bodrum membran matriks kaplamasını 4 °C ' de kültür plakaları için çözün (Bodrum membran matrisinin ısınmasına izin verme ya da katılaşma olacaktır). 1 ml plakaya yapın ve onları-20 °c veya-70 °c ' de saklayın.
2. 10 μg/mL 'de steril fosfat-tamponlu tuz (PBS) içinde temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) yeniden oluşturur ve 10 μL aliquots yapın. 4 °C ' de saklayın.
3. Yeni, açılmamış, 500 mL 'Lik bir şişe glutamin ile DMEM/F12, B27 (10 mL), N2 (5 mL) ve penisilin-streptomisin (5 mL) ekleyin. Bu nöral kök hücre (NSC) ortamının 50 mL 'yi konik bir tüpte yerleştirin ve 10 μL 10 μg/μL (2 μg/mL Final) bFGF ekleyin. NSC (+) bFGF medyasını 4 °C ' de saklayın.
4. (-) BFGF medya yapmak için, adım 1,3 açıklandığı gibi aynı tarifi kullanın ama bFGF eklemeyin. Bu medya, NSCs 'leri nöronlara ayırmak ve farklılaşma sonrası nöronal kültürlerin korunması için kullanılacaktır.

2. lentiviral yapıları

Not: Lentiviral yapıları ile çalışmaya başlamadan önce, laboratuar Biyogüvenlik seviye-2 (BSL-2) aracıları kullanmak için onaylanmış olduğundan emin olun. Ayrıca lentiviral vektörler ile çalışırken BSL-2 kültür davlumbaz, kişisel koruyucu ekipman (PPE) ve bertaraf yöntemleri kullanılmalıdır.

1. Tau yapıları tercih edilen bir kaynaktan Lentivirus paketlenmiş elde (bkz Sanders ve al.¹⁰ yapı bilgileri için).

3. Insan nöral kök hücreleri kültür

Not: NSCs genellikle 100000 – 150,000 hücrelerde/cm² ' de dikilir ve piyasadaki en çok kullanılabilir nscs 'ler 1 x 10⁶ hücre/şişe olarak satılır. Bu protokol 10 cm hücre kültürü yemekleri için optimize edilmiştir (yemek diğer boyutlarda kullanılabilir olsa da); Bu nedenle, ticari olarak kullanılabilen NSCs kullanılırsa, NSCs 'nin 10 cm 'lik yemeklerden yeterli hücrelere neden olması için ilk olarak altı kuyu yemekleriyle kültürleşmiş olması gerekebilir. Bu protokol alternatif olarak çeşitli hücre kültürü çanak boyutları için adapte edilebilir (ancak bu protokoller^11,12başka bir yerde kullanılabilir olduğu için geçiş nscs için yönergeler içermez).

1. Hücre kültürü plakalarının hazırlanması için, hücre kültürü plakaları için dondurulmuş Bodrum membran matris kaplama bir kısım kaldırmak ve 4 °c ' de çözülmesine izin (aliquots 4 °c gece hücrelerden önce bir gecede yerleştirilebilir). 385 μL Bodrum membran matris kaplama 5 mL DMEM/F12 medya + penisilin-streptomisin ekleyin.
   Not: 5 ml DMEM/F12 medya + penisilin-streptomisin tek bir 10 cm çanak (bu Bodrum membran matris kaplama çözeltisi 1 ml kat için yeterli bir altı iyi çanak bir kat için yeterlidir). Alternatif olarak, hücreler sabit ve immunost, ya da thioflavin için lekeli iseniz, 24-Well kültür yemekleri cam Cover, kültür hücreleri.
   1. Medyayı ve matris kaplamasını önce ve kültür yemeklerine eklerken soğuk tutun. Bodrum membran matris kaplama kültür yemekleri ekleyin ve 1 h için (37 °C ' de) bir kuluçk yemek yerleştirin. Optimum kaplama için, Bodrum membran matrisini 1 saatten fazla veya daha az süre boyunca inkük etmeyin. 1 saat sonra, hücre kültürlerinden yemeklerden Bodrum membran matris kaplama Aspire. Bunun, NSCs 'nin kaplammaya hazır olması ile çakıştığınızdan emin olun.
      Not: Hücreler dondurulmuş stokları çözülmüş değilseniz, adım 3,2 atlayın ve adım 3,3 ile devam edin.
2. Eğer hücreler dondurulmuş NSC stokları çözülür, dondurulmuş hücreler bir şişe almak ve bir su banyosunun ısıtmak 37 °C ısınarak su geri ve ileri şişe hareket ettirerek. Bir kez çözülmüş,% 70 etanol ile şişe sprey ve bir hücre kültürü kaputu içine yerleştirin. Hücreleri ~ 10 ml dmem/F12 + penisilin-streptomisin medyaya aktarın ve 1.000 x g 'de oda sıcaklığında tüpü 5 dakika boyunca santrifüjün. medyayı aspirate ve NSC medyadaki hücreleri pelletini.
3. Kullanılan hücre kültürü gemisi için uygun tohumlama yoğunluğu elde etmek için NSC medyadaki hücreleri seyreltin.
   Not: Örneğin, NSCs altı-kuyu plakası üzerine kaplama iseniz-bir iyi altı-iyi kültür çanak bir yüzey alanı vardır 9 cm²— 900.000 için 1.350.000 hücreler tohum için gereklidir. Yani, 1.000.000 hücreleri içeren bir şişe medya 2 mL resuspended olabilir ve altı-iyi yemek tek bir kuyu ekledi.
4. Bodrum membran matris kaplı kültür yemekleri (100.000 hücreler/cm²) tohum ve her gün medya değiştirmek (dondurulmuş bir stok kullanıyorsanız, ortam kaplama sonra gün ve sonra her gün değiştirmek) NSC medyada askıya yeterli hücre ekleyin. Hücreleri% 75 –% 80 konfluent olana kadar büyütün.
   Not: Hücreleri büyük olasılıkla ulaşacaktır 75% – 80% konfluence kısa bir süre sonra kaplama, ancak bu dondurulmuş stokları kullanılırsa daha uzun sürebilir.
5. NSCs% 75 –% 80 konfluent olduktan sonra, NSC (+) bFGF medyasını kaldırarak ve NSC (-) bFGF medyasını değiştirerek nöronal farklılaşma başlar. Bu medyada hücreleri Kültür (her gün ortam değiştirme) en az 4 hafta.
   Not: Hücreler bFGF çekilmesi aşağıdaki birkaç gün bölmek devam edecektir; Bu nedenle, hücreler% 90-100 konfluence ulaşabilir. 4 hafta boyunca kültür sonrası, hücreler nöronal bir kader elde edecek ve lentivirüs tedavisi için hazır olacak.

4. nöronal kültürlerin iletim ve Bakımı

1. Lentivirus ile nöronlar transduce için, 3,4 x 10⁵ transkif birimler/hücre (bir 100% confluent 10 cm çanak ~ 10.000.000 nöronlar içerir) bir titresi sayısı kullanın. Hücre kültürü medyasında gerekli konsantrasyona dönüştürücü birimleri seyreltin ve hücrelere ekleyin (hücre kültürü çanak için medya normal hacmi kullanın). Lentivirus ekledikten iki gün sonra, hücreler 1x ile taze (-) bFGF medya (Lentivirus olmadan) yıkayın ve (-) bFGF medya her zamanki gibi kültür devam.
2. Post-lentiviral tedavi için, hücre kültürü medya ([-] bFGF medya) her gün değiştirerek transed nöronlar yem. Hücreleri korumak için ~ 8 hafta sonra iletim. Işlilik sağlamak için rutin bir ışık mikroskop altında hücreleri görselleştirin.
   Not: Sparseness veya dendritik kırılma hücreleri artık uygulanabilir olduğunu işaretler.

5. hücrelerin görüntülenmesi

1. Canlı hücre görüntüleme
   1. Dönüştürücü (Lentivirus eklendikten sonra 4 gün) sonra, canlı hücre görüntüleme yeteneğine sahip bir floresan mikroskop altında YFP sinyalleri gözlemlemek. İnkükalörün hücre kültürü yemekleri alın ve kültür kuyuları kültür yemekleri üstünde kapak tutarak steril kalmasını sağlayın. ~ 514 nm bir uyarma dalga boyu ve ~ 527 nm Emisyon filtresi ile 10X objektif kullanarak hücreleri görselleştirin.
      Not: Toplamları genellikle transkual hücre kültürlerinde görülebilir 6 – 8 Lentivirus uygulamadan sonra gün.
2. Sabit hücreli boyama (β-tubulin III etiketleme ve Tiyoflavin boyama)
   1. Paraformaldehit hücreleri düzeltmek için (PFA), cam Cover, üzerinde yetiştirilen traned nöronların kültür medyasını çıkarın. Hücreleri 1x PBS ile yıkayın, yıkamayı çıkarın ve% 4 PFA (PBS 'de seyreltilmiş) ile Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 300 – 500 μL (24-kuyu plakaları kullanıyorsanız) ekleyin. PFA çıkarın ve PBS ile Cover, 2x yıkayın.
   2. PBS,% 3 Sığır serum albümin (BSA) ve 0,3% Triton X-100 içeren bir engelleme çözümü hazırlayın. Kuyulara çözüm için 300 – 500 μL ekleyin ve 4 °C ' de 2 h için coverları inküt. 2 saat sonra, engelleme solüsyonundaki primer antikorları (1:500 antikor konsantrasyonunda) seyreltin ve her bir kuyu için 300 – 500 μL primer antikor çözeltisi ekleyin. Tabağı 4 °C ' de bir gecede sallanan veya dönen bir platforma (düşük hızda) yerleştirin.
   3. Ertesi gün, primer antikor çözeltisi çıkarın ve PBS ile 5 dakika her biri için 3x Cover, yıkayın. Bir engelleme tampon solüsyonundaki ikincil antikorları seyreltir (1:1000 konsantrasyonunda) ve her bir kuyu için ikincil antikor çözeltisi ekleyin. YFP sinyali ile örtüşmeyen bir floresan etiketi kullanarak uygun ikincil antikor seçin (örneğin, CY-3). Hücreleri, sallanan veya dönen bir platformda 2 saat boyunca oda sıcaklığında kulyur. 2 saat sonra, ikincil antikor çözeltisi çıkarın ve PBS ile her biri için 10 dk Cover, 3x yıkayın.
   4. 10 dakika boyunca çift deiyonize suda (DDW) coverfları yıkayın. DDW 'yi çıkarın ve 300 μL/kuyu% 0,015% Tiyoflavin-S% 50 etanol içinde seyreltilmiş 10 dk. Tiyoflavin solüsyonu çıkarın ve 4 dk,% 50 Etanol, bir 4 dk takip ile her biri için 2x Cover % 30 etanol ile 5 dk her biri için% 30 etanol ve iki yıkaması ile yıkayın. Montajdan önce 1 adet DDW ile coverfiş yıkayın.
      Not: 5.2.4 adımda açıklanan Tiyoflavin boyama isteğe bağlıdır.
   5. Coverfaları cam slaytlara takmak için, cam kaydırağın "+" tarafına tek bir damla montaj ortamı yerleştirin. İyi cam lamel magazini içeren tüm sıvı çıkarın ve ince forseps kullanarak, dikkatle cam lamel magazini kaldırmak, hangi tarafın kültürlü hücrelere sahip takip tutmak.
   6. Herhangi bir aşırı nemi kaldırmak için lamel magazini kenarını bir kimwipe 'e hafifçe bastırın. Hala ince forseps ile lamel magazini sürükleyici, montaj ortamına lamel magazini (hücre tarafı montaj medya damlası doğru bakacak şekilde) kenarına dokunun, ve daha sonra, hafifçe montaj ortamına lamel magazini yerleştirin (montaj içine kültürlü hücreleri yerleştirerek Medya ve lamel magazini ve cam slayt arasında onları sandviç). Montaj ortamının görüntüleme işleminden önce 30 dakika boyunca sertleşmesine izin verin. Slaytlar, gelecekteki kullanım için-20 °C ' de depolanabilir.
   7. Görüntü hücreleri floresan mikroskop ve uygun uyarma/emisyon Spectra kullanarak (YFP = ~ 514/527 Nm, Cy-3 = ~ 555/568 Nm, ve Tiyoflavin S = ~ 390/426 Nm).

6. Opsiyonel Yöntemler

1. Her 2 günde bir kültürler tarafından yayımlanan Tau türlerinin gelecekteki analizleri için kültürlerden oluşan ortamlar toplayın ve-20 °C ' de saklayın.

Tau-RDLM-YFP-traned nöronlar floresan YFP ile etiketlendi ve RDLM-dönüştürücü kültürler transksiyon sonra toplamları gösteriliyor. Bu inlüzyonlar Tiyoflavin için pozitif lekelenmiş (Şekil 1). Şekil 1 ' in gösterdiği gibi, bu protokol thioflavin pozitif Tau toplamları görüntüleyen nöronal kültürler üretir. İlk deneyler için, nörolojik farklılaşma nöron özgü Marker β-tubulin III kültürlerde immünolabeling tarafından teyit edilmesi önerilir. Önemlisi, floresan etiketli ikincil antikorlar YPF ile çakışmayan bir uyarılma/emisyon spektrumuna sahip olmalıdır (örneğin, Cy3). Sarı floresan Tau agregaları boyama yokluğunda görünür olmasına rağmen, Tiyoflavin de floresan sinyalinin Tau ve hücresel enkaz toplanmış olduğunu onaylamak için görüntüleme için kullanılmalıdır. Ayrıca, Şekil 1 ' deki örnek, dapi 'nin Excitation/emisyonu thioflavin-S ile çakışıyor olarak hücre çekirdeğini etiketlemek IÇIN dapi boyama içermez; Alternatif çekirdeğin lekeleri istenirse thioflavin-S ile kullanılmalıdır.

Resim 1: Transtibe edilen kültürlerin Thioflavin boyama. Tau-RDLM-YFP Lentivirus ile traned nöronlar sabit ve nöron özgü Marker β-tubulin III (kırmızı) ile immünolabeled. Ayrıca, Tau toplamları (yeşil YFP sinyali) Tiyoflavin (mavi) için lekelenmiş. Ölçek çubukları = 25 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Bu protokol, gümüş-leke-pozitif agregalar ve thioflavin-pozitif neurofibriller Tangles (NFTs) sergiler insan tauopati bir in vitro model nesil açıklar. Dahası, dönüştürücü hücreler, morfolojik kusurları, azaltılmış synaptogenez ve artmış lizozomal hacmi gibi Tau kaynaklı patolojileri görüntüler. Bu protokolün ana avantajı, ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilecek, hem de Tau toksisitesi analizi için kullanılan nöronal tauopati erişilebilir ve uygun maliyetli bir model sağlar olmasıdır. İnsan tauopati hücre hatları henüz yaygın olarak mevcut değildir ve fare kaynaklı nöronların transgenik Tau kullanımı hayvan ıslahı gerektirir ve nöronal farklılıklar nedeniyle sınırlıdır bu model nörodejeneratif araştırma malzeme ihtiyacı doldurur türler arasında özellikleri.

Yukarıda listelenenlere ek olarak, bu prosedürün başarısı için çok sayıda kritik adım vardır. İlk olarak, viral titresi çok düşük ise, kültürler toplamları oluşturmayacak çünkü doğru viral titresi kullanıldığını emin olun. İkinci olarak, NSC kültürlerinin düzgün şekilde korunduğundan ve ~ 80% Confluence 'ı aşmadığından emin olun. NSCs 'nin aşırı büyümesi erken farklılaşma neden olur. Son olarak, NSCs 'den bFGF medyasını geri çektikten sonra ayırt etmek için nöronal kültürler için tam 4 hafta bekleyin. Bu süre nöronların olgunlaşma sağlamak için gereklidir.

Yukarıda açıklanan prosedür bir in vitro tauopati modeli üretmek için etkili bir yöntemdir, ancak bu protokolle ilişkili bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, daha önce açıklandığı gibi, bu yöntem insan kaynaklı pluripotent kök hücre türetilen nöronlar ancak sıçan embriyonik (E18)-türetilen nöronlar NFTs üretir. Hatta üç kez daha fazla virüs insan nöronlar için kullanılan daha sıçan nöronlar transduce kullandıktan sonra, kemirgen hücre kültürler Tiyoflavin boyama için negatif kaldı, bu yöntem kemirgen kültürler için adapte edilemez olduğunu göstermektedir. Transed fare hücreleri ve insan nöronlar arasındaki farklar toplama doğru insan Tau artmış eğilimi nedeniyle olabilir¹³. Bu prosedürün ikinci sınırlaması, Tau toplamları kültürlerde oluşsa da, Tau-RDLM-dönüştürücü hücreler ve Tau-WT-YFP-traned kültürler arasında Tau fosforilasyon değişiklikleri protein PHF-1 kullanılarak algılanamaz oldu (hangi Tau algılar ser 396/ser 404 ' de fosforile) ve CP13 antikorları (ser 202 'de Tau fosforile algılar). Bu bulguların P301L ve V337M nedeniyle Tau-RDLM-YFP kültürlerinde Tau toplama hiperfosforilasyon bağımsız bir mekanizma veya endojen Tau fosforilasyon düzeyi immünoblot tarafından algılanabilir seviyede olduğunu göstermektedir. Tau-RDLM-YFP ve Tau-WT-YFP kültürler arasında PHF-1 ve CP13 immünoreactivity farklılıkları eksikliği nedeniyle, bu modelin, patoloji üzerinde Tau kinaz/fosfataz aktivitesinin etkilerini analiz eden çalışmalar için yararlı olup olmadığına belirsiz. Bununla birlikte, hem PHF-1 hem de CP13 antikorları, mutasyonları barındıran tekrarlama alanının dışındaki bölgeleri tanır; Bu nedenle, çeşitli Tau fosforilasyon sitelerine karşı yükseltilmiş ek antikorlar gelecekteki çalışmalar için yararlı olabilir.

Hücre kültürüne ek olarak, bu model hücre kültürü paradigma ötesinde çalışmalar için değerli bir araç olabilir. Örneğin, transformator hücrelerinden yalıtılmış exosomes toksik Tau türleri içerir. Exosomes neredeyse her hücre tipi serbest küçük salgı veziküller, ve exosomes Tau yayılma bulaşmış¹⁴. Tau-rdlm nöronal exosomes Batı leke⁹tarafından algılanabilir insan Tau içerir, ve bu dış, naif fare beyninde Tau kapanımlar üretmek için yeterlidir. Bu inlüzyonlar insan Tau için spesifik antikorlar için İmmünoreaktif (K9JA), ancak kapanımlar toplanan fare Tau dahil olup olmadığını belirsiz. Bulgu burada prosedür thioflavin-pozitif boyama toplar kemirgen nöronlar üretmek değil açıklanan fare beyninde gözlenen kapanımlar tamamen insan Tau oluşur olduğunu göstermektedir, gelecekteki çalışmalar onaylamak için gerekli olmasına rağmen in vivo mevduat bileşimi.

Tauopathies içinde eksozom-türetilen Tau belirgin rolü göz önüne alındığında, model burada açıklanan Tau kaynaklı nörodejenerasyon aracılık içinde eksozom rolünü incelemek için yararlı bir kaynak olabilir. Sonuç olarak, bu prosedür transjenik fare nöronal sistemleri üzerinde önemli avantajları vardır ve preklinik analiz çeşitli için istihdam edilebilir insan tauopati bir in vitro modeli üretir.

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Yazarlar, Tau yapıları sağlamak için PHF-1 ve CP13 antikorları ve Teksas Üniversitesi, Southwestern, Dr Marc Diamond tedarik için Albert Einstein Koleji tıp Dr Peter Davies teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma S.H.Y. için Alzheimer Derneği (NIRG-14-322164) ve California Enstitüsü rejeneratif tıp (TB1-01193) gelen hibe tarafından desteklenen oldu PR