Un modello in vitro per lo studio dell'aggregazione Tau utilizzando la trasduzione dei neuroni umani mediata da lentivirali

Questo protocollo descrive una procedura in cui le colture neuronali umane vengono trasmutate con costrutti lentivirali che codificano per i Tau umani. Le colture traslegate mostrano aggregati Tau e patologie associate.

L'aggregazione aberrante della proteina tau è coinvolta patogenicamente in una serie di malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD). Anche se i modelli murini di tauopatia hanno fornito una preziosa risorsa per indagare sui meccanismi neurotossici del Tau aggregato, sta diventando sempre più evidente che, a causa delle differenze tra le specie nella neurofisiologia, il cervello del topo non è adatto per modellare la condizione umana. I progressi nei metodi di coltura cellulare hanno reso le colture neuronali umane accessibili per uso sperimentale in vitro e hanno aiutato nello sviluppo di neuroterapeutici. Tuttavia, nonostante l'adattamento delle colture cellulari neuronali umane, i modelli in vitro di tauopatia umana non sono ancora ampiamente disponibili. Questo protocollo descrive un modello cellulare di aggregazione Tau in cui i neuroni umani vengono trasborsi con vettori lentivirali-derivati che il codice per Tau mutata patogenicamente fusa a una proteina gialla fluorescente (YFP) reporter. Le colture trasmarcate producono aggregati Tau che si macchiano positivamente per la Tioflavina e mostrano marcatori di neurotossicità, come la diminuzione della lunghezza assonale e l'aumento del volume lisosomiale. Questa procedura può essere un modello utile e conveniente per studiare le tauopatie umane.

L'aggregazione patologica della proteina Tau associata al microtubulo è una caratteristica determinante di molte malattie neurodegenerative, tra cui AD, demenza frontotemporale (FTD), malattia di pick e paralisi sopranucleare progressiva (PSP)¹. In uno stato non malato, Tau si lega e stabilizza i filamenti di microtubuli in assoni neuronali². Tuttavia, l'iperfosforilazione di Tau associata alla malattia favorisce l'aggregazione Tau, la dissociazione dai microtubuli e la tossicità neuronale³. Gli effetti tossici del Tau aggregato possono comportare l'attivazione aberrante dei recettori colinergici⁴ e glutamatergic⁵ con conseguente disregolazione del calcio intracellulare e, infine, morte cellulare. Nei modelli animali, la riduzione del cervello Tau migliora la patologia nei topi AD⁶ e nei modelli murini di trauma cranico lieve ripetitivo⁷.

Le prove di montaggio dimostrano che la struttura e l'affinità di legame del Tau derivato dal topo sono distinte dal Tau derivato dall'uomo e che il Tau del topo non è adatto per modellare le tauopatie umane⁸. Tuttavia, i modelli di tauopatia cellulare umana non sono ampiamente disponibili in commercio. L'obiettivo generale di questo lavoro è quello di descrivere un modello in vitro di aggregazione Tau in cui i neuroni umani sono trasverti con vettori lentivirali-derivati contenenti costrutti Tau umani mutanti⁹. L'aggregazione Tau che causa costrutti lentivirali codifica per il dominio di ripetizione Tau che harnoioso P301L e V337M mutazioni fuse con un reporter YFP (Tau-RDLM-YFP) mentre il controllo costruisce il codice per il dominio di ripetizione Tau (WT) di tipo selvaggio fuso con un reporter YFP (Tau-WT-YFP). Le colture neuronali trasite usando questo metodo esprimono circa nove volte più Tau rispetto alle colture non trasdette. Anche se la quantità di espressione Tau iperespressa è approssimativamente uguale tra le cellule di Tau-RDLM-YFP-e Tau-WT-YFP-trasate, solo i neuroni trasati con Tau-RDLM-YFP mostrano aggregati. Le colture con Tau-RDLM-YFP si macchiavano positivamente per la Tioflavina e mostrano riduzioni della lunghezza assonale e della densità sinaptica. Pertanto, questo modello cellulare può essere uno strumento utile per studiare l'aggregazione Tau in vitro.

1. preparazione di supporti e reagenti

1. Scongelare il rivestimento della matrice della membrana del seminterrato per le piastre di coltura a 4 ° c (non permettere che la matrice della membrana del seminterrato si riscaldi o si solidifichi). Fare 1 mL di aliquote e conservarle a-20 ° c o-70 ° c.
2. Ricostituire il fattore di crescita fibroblasti di base (bFGF) in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) a 10 μg/mL e fare 10 μL di aliquote. Conservarli a 4 ° c.
3. Ad un nuovo flacone da 500 mL, non aperto, di DMEM/F12 con glutammina, aggiungere B27 (10 mL), N2 (5 mL) e penicillina-streptomicina (5 mL). Inserire 50 mL di questo supporto per cellule staminali neurali (NSC) in un tubo conico e aggiungere 10 μL di 10 μg/μL (2 μg/mL Final) bFGF. Conservare il supporto NSC (+) bFGF a 4 ° c.
4. Per creare (-) supporti bFGF, utilizzare la stessa ricetta descritta al punto 1,3 ma non aggiungere bFGF. Questo supporto sarà utilizzato per differenziare le NSCs ai neuroni e per mantenere le colture neuronali dopo la differenziazione.

2. costrutti lentivirali

Nota: Prima di iniziare a lavorare con i costrutti lentivirali, assicurarsi che il laboratorio sia stato approvato per l'uso di agenti di biosicurezza Level-2 (BSL-2). Inoltre, le cappe di coltura BSL-2, i dispositivi di protezione individuale (dpi) e i metodi di smaltimento devono essere utilizzati quando si lavora con vettori lentivirali.

1. Ottenere costrutti Tau confezionati in lentivirus da una fonte preferita (vedere Sanders et al.¹⁰ per informazioni di costruzione).

3. coltura di cellule staminali umane neurali

Nota: Le NSCs sono tipicamente seminate a 100.000 – 150000 cellule/cm² e la maggior parte delle NSC commercialmente disponibili sono vendute come 1 x 10⁶ cellule/flaconcino. Questo protocollo è stato ottimizzato per i piatti di coltura cellulare di 10 cm (anche se possono essere utilizzate altre dimensioni di piatti); Pertanto, se vengono utilizzate le NSC commercialmente disponibili, le NSCs potrebbero dover essere ampliate prima di essere coltivate in piatti di sei-pozzo per portare a sufficienza le cellule per seminare piatti da 10 cm. Questo protocollo può essere adattato in alternativa per una varietà di dimensioni dei piatti di coltura cellulare (ma non contiene istruzioni per le NSCs di passaging poiché questi protocolli sono disponibili altrove^11,12).

1. Per la preparazione di piastre di coltura cellulare, rimuovere una aliquota di rivestimento della matrice della membrana del seminterrato congelato per le piastre di coltura cellulare e lasciare scongelare a 4 ° c (le aliquote possono essere posizionate a 4 ° c durante la notte del giorno prima che le cellule siano seminate). Aggiungere 385 μL di rivestimento a matrice di membrana seminterrato a 5 mL di DMEM/F12 media + penicillina-streptomicina.
   Nota: 5 ml di DMEM/F12 media + penicillina-streptomicina è sufficiente per rivestire un singolo piatto da 10 cm (1 ml di questa soluzione di rivestimento a matrice di membrana seminterrato è sufficiente per rivestire un pozzo di un piatto di sei ben). In alternativa, se le cellule devono essere fissate e immunizzate, o macchiate per la Tioflavina, le cellule di coltura su vetrerie di vetro in piatti di cultura 24-well.
   1. Mantenere il supporto e la matrice di rivestimento freddo prima e mentre aggiungendoli ai piatti della cultura. Aggiungere il rivestimento a matrice di membrana seminterrato ai piatti della cultura e posizionare i piatti in un incubatore (a 37 ° c) per 1 h. Per un rivestimento ottimale, non Incubare la matrice della membrana seminterrato per più di o meno di 1 h. Dopo 1 h, aspirare il rivestimento della matrice della membrana seminterrato dai piatti delle colture cellulari. Accertarsi che questo coincida con le NSCs pronte per essere placcate.
      Nota: Se le celle non vengono scongelati da scorte congelate, saltare il passaggio 3,2 e continuare con il passaggio 3,3.
2. Se le cellule vengono scongelati da scorte di NSC congelate, prendere una fiala di cellule congelate e riscaldarla in un bagno d'acqua riscaldato a 37 ° c spostando il flaconcino avanti e indietro nell'acqua. Una volta scongelati, spruzzare il flaconcino con 70% di etanolo e posizionarlo in una cappa di coltura cellulare. Trasferire le cellule a ~ 10 mL di media DMEM/F12 + penicillina-streptomicina e centrifugare il tubo a temperatura ambiente a 1.000 x g per 5 min. aspirare il supporto e risospendere le cellule nei supporti NSC.
3. Diluire le celle nei supporti NSC per ottenere la densità di semina appropriata per il vaso di coltura cellulare in uso.
   Nota: Ad esempio, se le NSC sono state placcate su una piastra a sei-pozzo — un pozzo su un piatto di coltura a sei-pozzo ha una superficie di 9 cm²— 900.000 a 1.350.000 cellule sono tenuti a seme. Quindi, un flaconcino contenente 1 milione cellule può essere risospeso in 2 mL di media e aggiunto ad un singolo pozzo di un piatto di sei ben.
4. Aggiungere abbastanza celle sospese nei supporti NSC per seminare i piatti della coltura della membrana del seminterrato (100.000 cellule/cm²) e cambiare i media ogni altro giorno (se si utilizza un brodo congelato, cambiare i media il giorno dopo la placcatura e successivamente ogni altro giorno). Far crescere le cellule fino al 75% – 80% confluente.
   Nota: Le cellule raggiungeranno probabilmente la confluenza del 75% – 80% poco dopo la placcatura, ma ciò potrebbe richiedere più tempo se vengono utilizzati stock congelati.
5. Una volta che le NSCs sono confluenti al 75% – 80%, iniziano la differenziazione neuronale rimuovendo i supporti NSC (+) bFGF e sostituendoli con i supporti NSC (-) bFGF. Cultura le cellule in questo media (sostituendo i media ogni altro giorno) per almeno 4 settimane.
   Nota: Le cellule continueranno a dividersi per alcuni giorni dopo il ritiro di bFGF; Pertanto, le cellule possono raggiungere il 90 – 100% confluenza. Dopo la coltura per 4 settimane, le cellule avranno raggiunto un destino neuronale e saranno pronte per il trattamento del lentivirus.

4. trasduzione e mantenimento delle colture neuronali

1. Per trasdurre i neuroni con lentivirus, utilizzare un conteggio di titolo di 3,4 x 10⁵ unità transriducibili/cellula (un 100% confluente 10 cm piatto conterrà ~ 10 milioni neuroni). Diluire le unità transriducibili alla concentrazione necessaria nei mezzi di coltura cellulare e aggiungerle alle cellule (utilizzare il volume normale di media per il piatto di coltura cellulare). Due giorni dopo l'aggiunta del lentivirus, lavare le cellule 1x con media (-) bFGF fresco (senza lentivirus) e continuare la coltura in (-) bFGF media come al solito.
2. Per il trattamento post-lentivirale, nutrire i neuroni trasati cambiando i mezzi di coltura cellulare ([-] bFGF Media) ogni altro giorno. Mantenere le cellule per ~ 8 settimane dopo la trasduzione. Visualizzare regolarmente le cellule sotto un microscopio leggero per garantire la redditività.
   Nota: La spartezza o le rotture dendritiche sono segni che le cellule non sono più vitali.

5. Imaging delle cellule

1. Imaging in Live-Cell
   1. Dopo la trasduzione (4 giorni dopo l'aggiunta di lentivirus), osservare i segnali YFP sotto un microscopio fluorescente in grado di imaging a cellule vive. Prendete i piatti della coltura cellulare dall'incubatrice e assicuratevi che i pozzi della cultura rimangano sterili mantenendo il coperchio sopra i piatti della cultura. Visualizza le celle utilizzando un obiettivo 10x con una lunghezza d'onda di eccitazione di ~ 514 nm e un filtro di emissione di ~ 527 nm.
      Nota: Gli aggregati sono tipicamente visibili nelle colture cellulari trasstate 6 – 8 giorni dopo l'applicazione del lentivirus.
2. Colorazione a cellule fisse (etichettatura β-tubulina III e colorazione della Tioflavina)
   1. Per fissare le cellule in paraformaldeide (PFA), rimuovere i mezzi di coltura dai neuroni trasati coltivati su vetrerie di vetro. Lavare le cellule 1x con PBS, rimuovere il lavaggio, e aggiungere 300 – 500 μL (se si utilizzano piastre 24 pozzetti) di 4% PFA (diluito in PBS) ai coprioggetti per 20 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il PFA e lavare i coprioggetti 2x con PBS.
   2. Preparare una soluzione di blocco composta da PBS, 3% di albumina sierica bovina (BSA) e 0,3% Triton X-100. Aggiungere 300 – 500 μL della soluzione ai pozzetti e incubare i coprioggetti per 2 h a 4 ° c. Dopo 2 h, diluire gli anticorpi primari (ad una concentrazione anticorpale di 1:500) nella soluzione bloccante e aggiungere 300 – 500 μL di soluzione anticorpale primaria a ciascun pozzetto. Posizionare la piastra su una piattaforma oscillante o rotante (a bassa velocità) per una notte a 4 ° c.
   3. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare i coprioggetti 3x per 5 min ciascuno con PBS. Diluire gli anticorpi secondari in una soluzione tampone bloccante (ad una concentrazione di 1:1000) e aggiungere una soluzione anticorpale secondaria ad ogni pozzetto. Selezionare l'anticorpo secondario appropriato utilizzando un tag fluorescente che non si sovrapponga al segnale YFP (ad esempio CY-3). Incubare le cellule a temperatura ambiente per 2 h su una piattaforma oscillante o rotante. Dopo 2 h, rimuovere la soluzione anticorpale secondaria e lavare i coprioggetti 3x per 10 min ciascuno con PBS.
   4. Lavare i coprioggetti in acqua a doppia deionizzazione (DDW) per 10 minuti. rimuovere il DDW e aggiungere 300 μl/pozzo di 0,015% Tioflavina-S diluito in 50% etanolo per 10 min. rimuovere la soluzione di tioflavina e lavare i coprioggetti 2x per 4 min ciascuno con il 50% di etanolo, seguito da un 4 min lavare con etanolo al 30% e due lavaggi per 5 min ciascuno con il 30% di etanolo. Lavare i coprioggetti 1x con DDW prima del montaggio.
      Nota: La colorazione di tioflavina descritta al punto 5.2.4 è facoltativa.
   5. Per montare i coprioggetti sui vetrini in vetro, posizionare una singola goccia di supporti di montaggio sul lato "+" di uno scivolo di vetro. Rimuovere tutto il liquido dal pozzo contenente il vetrino coprioggetti e, utilizzando pinze sottili, rimuovere con cautela il vetrino coprioggetti, tenendo traccia di quale lato ha le cellule coltivate.
   6. Premere delicatamente il bordo del vetrino coprioggetti contro un Kimwipe per rimuovere l'umidità in eccesso. Ancora afferrando il vetrino coprioggetti con pinze sottili, toccare il bordo (con il lato della cella rivolto verso la goccia di supporto di montaggio) del vetrino coprioggetti al supporto di montaggio, e quindi, posizionare delicatamente il coprioggetti sul supporto di montaggio (mettendo le cellule coltivate nel montaggio supporti e schiacciandoli tra il vetrino coprioggetti e lo scivolo di vetro). Lasciare indurire il supporto di montaggio per 30 minuti prima dell'imaging. Le diapositive possono essere conservate a-20 ° c per un uso futuro.
   7. Immagini le cellule utilizzando un microscopio fluorescente e gli spettri di eccitazione/emissione appropriati (YFP = ~ 514/527 nm, CY-3 = ~ 555/568 Nm, e Tioflavina S = ~ 390/426 nm).

6. metodi opzionali

1. Ogni 2 giorni, Raccogli i media condizionati dalle culture e conservalo a-20 ° c per le future analisi delle specie Tau rilasciate dalle culture.

I neuroni trasmarcati Tau-RDLM-YFP sono stati contrassegnati in modo fluorescente con YFP, e le colture con RDLM-trasduzione hanno mostrato aggregati dopo la trasazione. Queste inclusioni macchiate positive per Tioflavina (Figura 1). Come illustrato nella figura 1 , questo protocollo produce colture neuronali che visualizzano aggregati Tau positivi alla Tioflavina. Per gli esperimenti iniziali, si raccomanda che la differenziazione neuronale sia confermata da immunomarcatura il marcatore specifico del neurone β-tubulina III nelle colture. È importante sottolineare che gli anticorpi secondari con tag fluorescenti devono avere uno spettro di eccitazione/emissione che non si sovrapponga a quello di YPF (Cy3, per esempio). Anche se gli aggregati di Tau fluorescenti gialle saranno visibili in assenza di colorazione, la Tioflavina deve essere utilizzata anche per l'imaging al fine di confermare che il segnale fluorescente è aggregato Tau e non detriti cellulari. Inoltre, l'esempio in Figura 1 non include la colorazione DAPI per etichettare i nuclei della cella come l'eccitazione/emissione di DAPI si sovrappone a quella di tioflavina-S; le macchie di nuclei alternativi devono essere utilizzate con thioflavin-S se lo si desidera.

Figura 1: colorazione Thioflavina delle colture traslatate. I neuroni trasati con il lentivirus Tau-RDLM-YFP sono stati fissati e immunolabeled con il marcatore specifico per il neuroni β-tubulina III (rosso). Inoltre, gli aggregati Tau (segnale YFP in verde) sono stati macchiati per la Tioflavina (blu). Barre di scala = 25 μm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo protocollo descrive la generazione di un modello in vitro di tauopatia umana che esibisce gli aggregati di argento-macchia-positivi e i grovigli di neurofibrillari positivi alla Tioflavina (NFTs). Inoltre, le cellule trasdotte mostrano patologie indotta da Tau come difetti morfologici, ridotta sinaptogenesi e un aumento del volume lisosomiale. Il vantaggio principale di questo protocollo è che fornisce un modello accessibile e conveniente di tauopatia neuronale, che può essere utilizzato per gli studi di screening dei farmaci, nonché per l'analisi della tossicità Tau. Questo modello riempie un bisogno materiale nella ricerca neurodegenerativa come linee cellulari di tauopatia umana non sono ancora ampiamente disponibili e l'uso di Tau transgenico da neuroni derivati dal topo richiede l'allevamento di animali ed è limitato a causa di differenze di neuronale caratteristiche tra le specie.

Oltre a quelli sopra elencati, ci sono una serie di passaggi critici per il successo di questa procedura. Innanzitutto, assicurati che il titolo virale corretto venga utilizzato perché se il titolo virale è troppo basso, le colture non formeranno aggregati. In secondo luogo, assicurarsi che le colture NSC siano adeguatamente mantenute e non superino ~ 80% di confluenza. La crescita eccessiva delle NSC causerà una differenziazione prematura. Infine, attendi un totale di 4 settimane per le colture neuronali da differenziare dopo aver ritirato i media bFGF dalle NSCs. Questa durata è necessaria per garantire la maturazione dei neuroni.

Anche se la procedura descritta sopra è un metodo efficiente per la produzione di un modello di tauopatia in vitro, ci sono alcune limitazioni associate a questo protocollo. In primo luogo, come descritto in precedenza, questo metodo produce NFTs in neuroni di cellule staminali pluripotenti indotto dall'uomo, ma non in neuroni embrionali (E18)-derivati del ratto. Anche dopo aver usato tre volte più virus per trasdurre i neuroni del ratto rispetto a quello utilizzato per i neuroni umani, le colture cellulari dei roditori sono rimaste negative per la colorazione della Tioflavina, il che suggerisce che questo metodo non può essere adattato alle colture di roditori. Le differenze tra le cellule del topo trasato e i neuroni umani possono essere dovute alla maggiore propensione del Tau umano verso l'aggregazione¹³. La seconda limitazione di questa procedura è che, sebbene gli aggregati Tau siano formati nelle colture, i cambiamenti nella fosforilazione Tau tra le cellule trasformate Tau-RDLM e le colture di Tau-WT-YFP sono stati inosservabili usando la proteina PHF-1 (che rileva il Tau fosforilato a ser 396/ser 404) e anticorpi CP13 (che rilevano il Tau fosforilato a ser 202). Questi risultati suggeriscono che l'aggregazione tau nelle colture Tau-RDLM-YFP a causa di P301L e V337M coinvolge un meccanismo che è indipendente dall'iperfosforilazione, o il livello di fosforilazione Tau endogena è sotto il livello rilevabile da immunoblot. A causa della mancanza di differenze nell'immunoreattività PHF-1 e CP13 tra le colture Tau-RDLM-YFP e Tau-WT-YFP, non è chiaro se questo modello sia o meno utile per gli studi che analizzino gli effetti dell'attività della chinasi/fosfatasi Tau sulla patologia. Tuttavia, entrambi gli anticorpi PHF-1 e CP13 riconoscono le regioni al di fuori del dominio ripetuto che ospitano le mutazioni; Pertanto, ulteriori anticorpi generati contro vari siti di fosforilazione Tau possono essere utili per studi futuri.

Oltre ai saggi di coltura cellulare, questo modello può essere uno strumento prezioso per gli studi oltre il paradigma della coltura cellulare. Ad esempio, gli esosomi isolati dai media delle cellule trasmolate contengono specie tossiche di Tau. Gli esosomi sono piccole vescicole secretorie rilasciate da quasi ogni tipo di cellula, e gli esosomi sono stati implicati nella propagazione Tau¹⁴. Gli esosomi neuronali Tau-RDLM contengono Tau umana che è rilevabile da Western blot⁹, e questi esosomi sono sufficienti per produrre inclusioni tau nel cervello del topo ingenuo. Queste inclusioni sono immunoreattive per anticorpi specifici per il Tau umano (K9JA), ma non è chiaro se le inclusioni includano il topo Tau aggregato. La constatazione descritta qui che la procedura non produce aggregati di colorazione di tioflavina-positivi nei neuroni roditori suggerisce che le inclusioni osservate nel cervello del topo sono composte interamente di Tau umana, anche se sono necessari studi futuri per confermare la composizione dei depositi in vivo.

Dato il ruolo apparente del Tau derivato dall'esopsi nelle tauopatie, il modello qui descritto può essere una risorsa utile per esaminare il ruolo dell'espo nella mediazione della neurodegenerazione indotta da Tau. In conclusione, questa procedura produce un modello in vitro di tauopatia umana che ha notevoli vantaggi rispetto ai sistemi neuronali del topo transgenico e può essere impiegato per una varietà di analisi precliniche.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli autori vorrebbero ringraziare il dottor Peter Davies all'Albert Einstein College of medicine per aver fornito gli anticorpi PHF-1 e CP13 e il dottor Marc Diamond all'Università del Texas, nel sud-ovest, per aver fornito i costrutti Tau. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Alzheimer ' s Association (NIRG-14-322164) a S.H.Y. e dall'Istituto della California per la medicina rigenerativa (TB1-01193) a R.P.