Bir flavonol türevi sağlık ve gıda sektöründe uygulanması için çok önemlidir. Burada, flavanondan bir flavonolün biyosentezi için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz ve diğer yaklaşımlara göre önemli adımları ve avantajlarını tartışıyoruz.

Flavonoller çeşitli biyolojik ve farmakolojik aktivitelere sahip flavonoidlerin önemli bir alt sınıfıdır. Burada, bir flavonol in vitro enzimatik sentezi için bir yöntem sağlar. Bu yöntemde, Atf3h ve Atfls1, flavonollerin biyosentetik yolu iki anahtar genler, klonlanmış ve Escherichia coliaşırı ifade edilir. Rekombinant enzimler bir yakınlık sütunu ile saflaştırılır ve daha sonra belirli bir sentetik tampon da bienzimatik basamak kurulur. Bu sistemde iki flavonol örnek olarak sentezlenir ve TLC ve HPLC/LC/MS analizleri ile belirlenir. Yöntem diğer yaklaşımlar üzerinde flavonoller türeyen belirgin avantajlar görüntüler. Bu zaman ve emek tasarrufu ve son derece uygun maliyetli. Reaksiyonun doğru bir şekilde kontrol edilmesi kolaydır ve böylece seri üretim için ölçeklendirilir. Hedef ürün, sistemdeki basit bileşenler sayesinde kolayca saflaştırılabilir. Ancak, Bu sistem genellikle bir flavanon bir flavonol üretimi ile sınırlıdır.

Flavonoller bitki flavonoidlerin önemli bir alt sınıfıdır ve bitkigeliştirme ve pigmentasyon 1,^2,3katılır. Daha da önemlisi, bu bileşikler sağlık açısından yararlı faaliyetleri geniş bir yelpazede sahip, anti-kanser gibi^4,5, anti-oksidatif⁶, anti-inflamatuar⁷, antiobezite⁸, anti-hipertansif⁹ , ve bellek hatırlama özellikleri¹⁰, bu bitki kaynaklı ikincil metabolitleri üzerinde çalışmalar çok sayıda yol açan. Geleneksel olarak, bu bileşikler esas olarak organik çözücüler kullanılarak bitki çıkarma elde edilir. Ancak, bitkilerde çok düşük içeriği nedeniyle^11,12,13, en flavonoller için üretim maliyeti yüksek kalır, hangi sağlık ve gıda uygulamaları üzerinde büyük kısıtlamalar empoze Sanayi.

Son yıllarda, bilim adamları flavonoidler 14,¹⁵türetmek için yöntemler oldukça sayıda geliştirdik. Ancak, bu karmaşık moleküllerin kimyasal sentezi içsel dezavantajları çeşitli sahip¹⁶. Sadece toksik reaktifler ve aşırı reaksiyon koşulları gerektirir, ama aynı zamanda bir hedef flavonoid bileşik üretmek için birçok adım^14,17. Ayrıca, bu stratejide bir diğer önemli sorun aktif flavonoid moleküllerin chiral sentezidir. Bu nedenle, kimyasal sentez ihrama yoluyla ticari bir ölçekte flavonoidler üretmek için ideal bir strateji değildir^16,17.

Son zamanlarda, bilim adamları flavonoid biyosentez için bir yol ile mühendislik mikroplartarafından bu karmaşık doğal bileşikler üretmek için umut verici bir alternatif strateji geliştirdik^{18,19,20, 21.000 , 22}, hangi başarıyla bitkilerde deşifre edilmiştir²³. Örneğin, Duan ve ark kaempferol üretmek için tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae içine biyosentetik bir yol tanıttı (KMF)²⁴. Malla ve ark.flavanone 3-hidroksilaz (f3h),flavonol synthase(fls1)ve UDP-glukoz:flavonoid 3-O-glukoziltransferaz UGT78K1 genleri ile tanıştırarak, glikozile flavonol, bir glikozile flavonol üretti Escherichia coliBL21(DE3)¹⁷. Oldukça az paradigma olmasına rağmen, tüm genetiği değiştirilmiş mikroplar hücresel bir platformun karmaşıklığı, yapay olarak sentezlenen genetik elementler ve konaklar arasındaki uyumsuzluk, inhibitör nedeniyle ilgi ürünleri üretmek konak hücrelere karşı hedef ürünlerin etkisi ve tasarlanmış bir hücresel sistemin kendisi istikrarsızlığı¹⁶.

Flavonoid üretimi için umut verici bir alternatif strateji in vitro multienzymatik bir basamak kurmaktır. Cheng ve ark. enterocin poliketides başarıyla bir pot²⁵tam bir enzimatik yol montajı ile sentezlenebilir bildirdin. Bu hücre içermeyen sentetik strateji bir mikrobiyal üretim fabrikasının kısıtlamaları afordan ve böylece büyük miktardabazı flavonoidler üretmek için mümkün 16 .

Son zamanlarda, naringenin dönüştürmek için bir bienzim sentetik sistem geliştirdik (NRN) kmf içine bir pot¹⁶. Burada, bu sistemi büyük ayrıntılarla ve ürünlerin analizinde yer alan yöntemlerle tanımlıyoruz. Ayrıca bu sistemi eriodictyol'dan NRN ve quercetin (QRC) kmf üretmek için kullanan iki örnek salıyoruz. Buna ek olarak, flavonoidlerin biyosentezinde bu yöntemin önemli adımlarını ve gelecekteki araştırma yönlerini tartışıyoruz.

1. Toplam RNA'yı bitki dokularından izole et^26,27

1. Bitki dokularını homojenize edin.
   1. Taze bir bitki dokusu (örneğin, Arabidopsis thaliana4 haftalık fideler) 100 mg toplamak. Doku ve sıvı azot ile bir havaneli ve harç dondurun, toz içine doku taşlama takip.
   2. Harcın içine 1 mL RNA izolasyon reaktifi ekleyin (Bkz. MalzemeTablosu). Reaktif hemen dondurulacak. Dondurulmuş reaktif eridiğinde doku örneğini zararlı ile homojenize edin.
   3. Homojeni 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın, numuneyi 12.000 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin ve temizlenmiş homojen çözeltiyi başka bir taze 1,5 mL'lik tüpe aktarın.
   4. Homojenize numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
2. Toplam RNA'yı yalıtın.
   1. Homojene 0,2 mL kloroform ekleyin, tüpü güvenli bir şekilde kaplayın, tüpü 15 dakika boyunca elle sallayın ve numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
   2. Numuneyi 12.000 x g'de 4 °C'de 15 dakika için santrifüj edin ve renksiz üst sulu fazı 1,5 mL'lik taze bir tüpe aktarın. Örnek santrifüjden sonra üç aşamaya ayrılır.
   3. Sulu faza 0,5 mL isopropil alkol ekleyin, tüpü güçlü bir şekilde elle sallayın ve karışımı 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
   4. Karışımı 12.000 x g'de 4 °C'de 10 dk olarak santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın.
   5. RNA peletini girdap la 1 mL %75 etanol ile yıkayın ve ardından 4 °C'de 5 dk için 7.500 x g'de santrifüj edin.
   6. Adımı 1.2.5'i tekrarlayın.
   7. Hava 5-10 dakika pelet kuru ve diethylpyrocarbonate (DEPC) ile işlem görmüş su da Yukarı ve aşağı borulama tarafından RNA yeniden eritin, bir mikro-spektrofotometre ile toplam RNA konsantrasyonu ölçme takip (Malzeme Tablosubakınız).

2. Sentez tamamlayıcı DNA (cDNA)²⁸

1. CDNA'nın ilk iplikçiğini bir kit kullanarak sentezle (bkz. MalzemeTablosu). Tablo 1'de gösterildiği gibi 20-l reaksiyon sistemi kurun ve 42 °C'de 50 dakika bir PCR cihazındaki reaksiyon tüpünü kuluçkaya yatırın ve ardından reaksiyonu 85 °C'de 5 dk olarak sonlandırmak. Reaksiyon ürününü genlerin gelecekteki amplifikasyonu için -20 °C'de saklayın.

Tablo 1: Toplam RNA'nın cDNA'ya ters transkripsiyonu

3. Rekombinant plazmidler 29^yapılışı

1. PCR astarları tasarla.
   1. GenBank veritabanından elde edilen anahtar enzim genlerinin dizilerine göre bir yazılım kullanarak PCR astarlarını tasarla (bkz. Astarın 5' sonunda, bir restriksiyon enzim bölgesi (örneğin, BamHI veya EcoRI bu protokolde) ekleyin.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan astarlar Tablo2'de gösterilmiştir.

Tablo 2: Mevcut çalışmada kullanılan oligonükleotid astarlar

2. Genleri prokaryotik ifade vektörü haline getirin.
   1. Sentezlenen cDNA'nın ilk ipliğindeki genleri yüksek doğrulukta dna polimeraz kullanarak yükseltin (bkz. Tablo 3'te gösterildiği gibi 100°L PCR reaksiyon sistemi ayarlayın ve aşağıdaki PCR döngüsünü çalıştırın: başlangıç denatürasyonu için 2 dk için 94 °C; daha sonra denatürasyon için 30 s için 94 °C'lik 35 devir, annelik için 2 dk için 55 °C ve uzatma için 1 dk için 72 °C; 10 dk. Reaksiyon karışımını 12 °C'ye kadar 72 °C'de son bir uzama takip edin.
      NOT: Uzatma süresi değişkendir ve çoğu DNA polimeraz için min başına yaklaşık 1000 baz polimerizasyonu ile gen uzunluğu ile belirlenir.
   2. PCR ürünlerini (en sık %5 ΜL) %1 agarose jel üzerinde görselleştirin ve dna temizleme kiti kullanarak kalan ürünlerden belirli DNA parçasını arındırın (Bkz. MalzemeTablosu).
   3. Bu protokoldeki restriksiyon enzimleri (örn. BamHI veya EcoRI) ile saflaştırılmış DNA parçasını ve vektörünü (örn. pET-32a(+)) sindirin. Tablo 4'te gösterildiği gibi 0,2 mL PCR tüpte 50-l reaksiyon sistemi ayarlayın ve karışımı 37 °C'de 3 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
   4. Bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA bandı kurtarmak (Malzemeler Tablosubakınız). DNA temizleme kiti kullanarak DNA'yı daha da arındırın (Bkz. MalzemeTablosu), ardından dna konsantrasyonunun mikro-spektrofotometre ile ölçülmesi (Bkz. MalzemeTablosu).
   5. Gen parçasını T4 DNA ligaz kullanarak doğrusallaştırılmış vektör DNA'sına indirin (bkz. MalzemeTablosu). Tablo 5'te gösterildiği gibi 1,5 mL'lik bir tüpte bir ligasyon reaksiyonu ayarlayın ve tüpü 2 - 3 saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
      NOT: Bir kesici ucun vektöre molar oranı değişkendir ve 3:1 ile 10:1 arasında değişmektedir.
   6. Ligasyon karışımının 2,5 μL'sini kimyasal olarak yetkin Escherichia coli hücrelerinin 50°L'sine ekleyin (örn. TOP10 veya DH5α), hafifçe karıştırın ve tüpü 30 dk.
   7. Tüpe antibiyotik siz 200 μL sıvı LB ortamı ekleyin ve tüpü 220 rpm'de 37 °C'lik bir çalkalayıcıya 1 saat boyunca tüpe inkübedin.

Tablo 3: PCR reaksiyon sisteminin kurulması

Tablo 4: BIR DNA parçasının/vektörünün çift sindirimi

Tablo 5: Bir gen parçasının doğrusallaştırılmış vektöre bağlanması

3. Ekran pozitif koloniler.
   1. LB plakasından tek bir koloniyi 100 μg/mL ampisilin içeren 200 μL sıvı LB ortamına ve 37 °C'de 2 - 3 saat boyunca 250 rpm'de kuluçkaya yatırın.
      NOT: Genel olarak pozitif kolonileri taramalariçin 4 - 8 koloni seçin.
   2. Adım 3.2.1'dekine benzer bir 10-l koloni PCR reaksiyonu ayarlayın.
      NOT: CDNA şablonunun 1 μL'si yerine 1 μL LB kültürü kullanın.
   3. PCR ürünlerini %1 agarose jel üzerinde görselleştirin. Kalan kültürü 100 μg/mL ampisilin içeren 3 mL sıvı LB ortamına pozitif bir sonuçla aşılayın ve 14 - 16 saat boyunca 250 rpm'de 37 °C'lik bir çalkalayıcıda inkübedin.
   4. Plazmid DNA'sını plazmid miniprep kiti kullanarak rekombinant E. coli kültürlerinden izole edin (Bkz. MalzemeTablosu).
   5. Bu protokolde saflaştırılmış rekombinant plazmidleri çift restriksiyon enzim analizi (örneğin, BamHI ve EcoRI) ile tanımlayın. 3.2.3 adımındakine benzer bir 10-l reaksiyon sistemi kurup, ardından 37 °C'de 37 °C'de kuluçka ya da %1 agarose jel üzerinde rekombinant plazmidden salınan spesifik bandı görselleştirin.
4. Pozitif rekombinant plazmiddizilerini doğrulayın.
   1. Plazmidleri sıralama için bir şirkete gönderin. Dna dizianalizi yazılımı (bkz. MalzemelerTablosu) kullanarak sonuçları, sıralama şirketinden elde edilen sırayı GenBank veritabanından elde edilen referans sırası ile karşılaştırarak analiz edin.

4. Ekspres rekombinant enzim proteinleri³⁰

1. Doğru rekombinant plazmidi yetkin E. coli BL21'e (DE3) dönüştürün.
   1. Plazmidin 0,1 μL'sini 10 μL'lik yetkin E. coli BL21(DE3) buz üzerinde 1,5 mL'lik bir tüpe ekleyin ve tüpü 5 dakika boyunca buzüzerinde tutun.
   2. Isı 90 s için 42 °C su banyosu hücreleri şok ve 2 dakika tekrar buz üzerine yerleştirin.
   3. Antibiyotiksiz 200 μL likl sıvı ortam ekleyin ve 5 dakika boyunca 220 rpm'de 37 °C'lik bir çalkalayıcıya kuluçkaya yatırın.
   4. 100 μg/mL ampisilin içeren lb agar plakasına 50 μL dönüşüm yayın ve bir gecede 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde plakayı kuluçkaya yatırın.
2. Genlerin ekspresyonunu indükler.
   1. 3 - 5 kolonileri bir gecede 37 °C shaker 250 rpm 100 μg/mL ampisilin ve kuluçka ile LB sıvı orta 3 mL içeren bir tüp içine plaka dan inoculate.
   2. 600 nm'deki kültürün optik yoğunluğu 0,4 - 0,6 arasında olana kadar tüm gece kültürünü 300 mL LB sıvı ortama aktarın ve 250 rpm'de 37 °C'lik bir çalkalayıcıda kuluçka yada 0,4 - 0,6 arasında olana kadar kuluçkaya yatırın.
   3. İzopropil β-D-tiogalaktoiti (IPTG) 0,2 mM'lik son konsantrasyonla kültüre ekleyin ve genlerin 250 rpm, 20 - 22 °C'de 3 saat boyunca ekspresyonu indükleyin.

5. Rekombinant enzim proteinlerini arındırMak³¹

1. Bakterileri 4 °C'de, 12.000 x g'da 10 dk için merkezleince hasat edin.
2. %0.1 Triton X-100 içeren Bakteriyel Lizis Tamponunun 15 mL'lik peletini yeniden askıya almak, 1 mM EDTA, %10 gliserol, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 1 μg/mL aprotinin, 1 μg/mL lül löpeptin ve 50 mM Tris-Cl'de 1 μg/mL pepstatin (pH 8.0).
3. Rekombinant enzim proteinlerini serbest bırakmak için bakteriyel süspansiyonu sonicate, ardından 13.000 x g, 4 °C 10 dakika boyunca santrifüj.
4. 1 mL/tüpte 1,5 mL tüplerde süpernatant'ı hasat edin ve aliquot yapın ve ileride kullanılmak üzere -70 °C'de saklayın.
5. 500 μL His-tag arınma reçinesini (Bkz. MalzemeTablosu) yeniden kullanılabilir boş bir yakınlık sütununa uygulayın. Reçiyiyi 5 yatak hacminde deiyonize suyla yıkayın ve etanolü stok çözeltisine atın. Tris-Cl (20 mM, pH 7.9), imidazol (10 mM) ve NaCl (0.5 M) içeren bağlayıcı tamponun 10 yatak hacmi ile rekarindengesi.
6. Yukarıdaki reçinenin bir bulamaç için Adım 5.4 supernatant 4 mL uygulayın ve stoperler ile sütunun iki ucunu kapatın.
7. Karışımı 4 °C'de bir rotator üzerinde 2 saat düşük hızda kuluçkaya yatırın.
8. Füzyon proteini bağlı reçiyiyi 4 °C'de 15 yatak hacmi ile yıkamaişleminden önce 1 mL/dk akış hızında yıkayın.
9. Kolona 500 μL elüsyon tamponu (20 mM Tris-Cl (pH 7.9), 500 mM imidazol, 0.5 M NaCl içeren) ekleyin ve bulamacı 10 dakika boyunca düşük bir hızda bir rotatörde 4 °C'de inkümal olarak kuluçkaya yatırın.
10. Adım 5.5'i dört kez daha tekrarlayın.
11. Reçiyiyi 10 yatak hacmi deiyonize su ve %20 etanol 3 yatak hacmi ile sırayla yıkayın. Resenini %20 etanolle ıslatın. Kolondurdurucu ile blok ve 4 °C'de saklayın.
12. Bradford protein stoyonu ile saflaştırılmış proteinlerin konsantrasyonu ölçün. %10'luk SDS-PAGE jelindeki proteinlerin saflığını belirleyin ve Coomassie maviboyama tayini ile bantları görselleştirin.
13. Enzim aktivitesini stabilize etmek için% 10 nihai konsantrasyona saflaştırılmış protein çözeltisine gliserol ekleyin. Aliquot ve -80 °C'de saklayın.

6. Bir in vitro bienzim sentetik sistemdebir flavanondan flavonol üretmek¹⁶

1. Arabellekleri hazırlayın.
   1. 200 mM Tris-HCl (pH 7.2), 16.4 mM α-ketoglutarik asit, %0.8 sodyum askorbat ve %20 gliserolden oluşan demir sülfatolmadan 2 x sentetik tampon yapın. 1.938 g Tris baz, 0.640 g sodyum askorbat, 0.250 g α-ketoglutarik asit ve 16 mL gliserol ile 64 mL deiyonize su çözün. PH'ı hidroklorik asit (HCl) ile 7,2'ye ayarlayın ve 80 mL'ye kadar deiyonize su ekleyin. Arabelleği ileride kullanılmak üzere 4 °C'de saklayın.
   2. 2 mM demir sülfat100x stok çözeltisi yapın. 50 mL deiyonize suda 55,6 mg demir sülfat heptahidrat çözün, karıştırın ve 100 mL'ye kadar su ekleyin.
   3. 25 mM flavonoid bir stok çözeltisi yapın. Bir flavonoidi metanolde iyice eritin ve -20 °C'de depolayın.
2. Bir flavanondan flavonol üretmek için sentetik bir sistem kur.
   1. Tablo6'da gösterildiği gibi sentetik sistemi hazırlayın.
   2. Reaksiyonu 40 dakika boyunca 600 rpm 'de (sallayarak ısı bloğunda) açık 2.0 mL tüpte 40 °C'de kuluçkaya yatırın.
   3. 10 μL asetik asit ve 100 μL etil asetat ekleyerek reaksiyonu sonlandırın.
   4. İki saat sonra, oda sıcaklığında bir başlık içinde hava kurutma için 1.5-mL tüpler için organik aşamaları aktarın.

Tablo 6: Bu protokolde kullanılan sentetik sistem.

7. Reaksiyon ürünlerini analiz etmek

1. İnce tabaka kromatografisi (TLC) analizi.
   1. Adım 6.2.4'ten flavonoid örneklerinden oluşan 5 tüp havuz ve hava kurutma için 300 μL'lik bir alan. Flavonoid tozu 160 μL metanolde yeniden çözün. Metanolde seri konsantrasyonları 12.5, 25, 50, 100 ve 200 ng/μL olan otantik flavonoid numuneleri hazırlayın. Reaksiyon örneklerinden 1 μL'yi ve otantik flavonoid örneklerini poliamid 6 plakaya yükleyin.
   2. Numune yüklü plakaları kloroform/metanol/etil asetat/formik asitten oluşan bir çözücü sistemde 5.0:1.5:1.0.0.5 oranında çalıştırın.
   3. Oda sıcaklığında tabakları hava kurutun. Sprey alüminyum klorür% 1 etanolik çözeltisiile (AlCl 3), oda sıcaklığında tekrar kuruyan hava takip.
   4. Otuz dakika sonra, 254 nm'de uv ışığı altında plakadaki lekeleri görselleştirin ve görüntü alın.
   5. Bir görüntü işleme yazılımı (örneğin, ImageJ v1.51j8 bu protokolde) kullanarak görüntülerdeki her noktanın gri değerini analiz edin.
      1. Yazılım ImageJ'i açın. Analiz edilecek görüntüyü açmak için Dosya > Aç'ı tıklatın.
      2. ImageJ Kullanıcı Arabiriminde soldaki en Çok Rectangular Seçim Aracı'nı tıklatın. Görüntüdeki ilgi çekici bölgeyi (YG) fareyle anahat ve ilk YG'yi etiketlemek için basın.
      3. Dikdörtgen seçimi fareyle sağdan bir sonraki yg'ye taşıyın ve ikinci yg'yi etiketlemek için basın.
      4. Diğer tüm ROI'ları etiketlemek için önceki adımı yineleyin.
      5. Açılır penceredeki tüm RO'lar için profil çizimleri oluşturmak için basın.
         NOT: Şu anda ImageJ Kullanıcı Arabirimindeki Düz Çizgi Seçim Aracı otomatik olarak etkinleştirilir.
      6. İlginin her zirvesi için kapalı bir alan tanımlamak için taban çizgileri çizmek için Düz Çizgi Seçim Aracı'nı kullanın.
      7. ImageJ Kullanıcı Arabirimindeki ilgili simgeyi tıklatarak Değnek Aracı'nı etkinleştirin. Açılır penceredeki tüm zirvelerin sonuçlarını görüntülemek için tepenin içini tıklatın.
   6. 7.1.1 adımdaki ilgili flavonoid konsantrasyonlarına karşı 7.1.5.7 adımından gri değerleri çizerek otantik flavonoidin TLC tabanlı standart eğrisini yapın. Daha sonra, ortaya çıkan formüle göre bu protokolde üretilen faiz flavonoid verimi hesaplamak.
2. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve sıvı kromatografi/kütle spektrometresi (LC/MS) analizleri
   1. 7.1.1 adımdaki numuneleri 0,45 μm ve 0,22 μm filtreler arasında sırayla işleyin.
   2. Numuneleri bir HPLC/LC/MS sistemine yükleyin (bkz. MalzemelerTablosu) ve c18 (4,6 × 150 mm; i.d., 5 μm) sütun kullanarak 30 °C'deki numuneleri ayırın. 1.0 mL/dk'daki kolona % 10 - %85 (v/v) asetonitil (ACN) suda (0 - 10 dk) bir degrade ile elute, 10 - %25 ACN; 10 - 35 dk, 25 - %50 ACN; 35 - 45 dk, 50 - %85 ACN; 45 - 50 dk, 85 - %10 ACN; 50 - 60 dk , 10% ACN) ve 200 ila 800 nm eluate absorbansını izlemek. LC/MS analizini 300 °C'de 10 L/dk kuruyan azot akışı ve 250 °C'de 7 L/dk'lık bir kılıf gazı akışı ile negatif iyon modunda gerçekleştirin ve dahili bir yazılım kullanarak veri toplayın (bkz. MalzemeTablosu).
   3. Reaksiyon örneklerinin ve otantik flavonoid bileşiklerinin tepe alanlarını bir yazılım kullanarak hesaplamak için tek dalga boyu kromatografları ayıklayın (bkz.
      1. Nitel Analiz programını açın ve Dosya > Veri Dosyasını Aç'ı tıklatın. Açık Veri Dosyası penceresinde çözümlenecek dosya(lar)ı seçin ve dosyayı açmak için Aç'ı tıklatın.
      2. Kromatogram Results penceresindeki fareyi ve ardından açılır menüde Extract Chromatogramlarını sağ tıklatın.
      3. E xtract Chromatogramıiletişim kutusunu açın. Tür listesinde, Diğer Kromatogramlarıtıklatın. Dedektör açılan kutusunda DAD1'i seçin. Ardından Chromatogram Sonuçları penceresinde HPLC sonuçlarını görüntülemek için Tamam'ı tıklatın.
      4. Chromatogram Sonuçları penceresinin üst kısmında kenetlenmiş Myıllık Integration simgesini tıklatın. Fare ile el ile tümleştirme analizi için gereken tepe noktası için bir taban çizgisi çizin.
      5. Sonuçları görüntülemek için Görünüm > Tümleştirme Tepe Listesi'ni tıklatın.
   4. 7.2.1 adımdan ilgili flavonoid konsantrasyonlarına karşı 7.2.3.5 adımdan tepe alanlarını çizerek otantik flavonoidin HPLC tabanlı standart eğrisini yapın. Daha sonra, ortaya çıkan formüle göre bu protokolde üretilen faiz flavonoid verimi hesaplamak.
   5. Bir yazılım kullanarak flavonoid bileşiklerinin tam kütlesi için MS verilerini analiz edin (bkz. MalzemeTablosu).
      1. Adımları 7.2.3.1 - 7.2.3.3'e tekrarlayın.
      2. Chromatogram Sonuçları araç çubuğundaki Aralık Seç simgesini tıklatın.
      3. İlginin zirvesini seçin. Seçili aralıktaki fareyi sağ tıklatın ve sonuçları MS Spectrum Sonuçları penceresinde görüntülemek için açılır menüdeki Extract MS Spectrum'u tıklatın.

F3H ve FLS1, Şekil1'de gösterildiği gibi bitkilerde flavanonun flavonole dönüştürülmesinde iki önemli anahtar enzimdir. Bir flavanone bir flavonol üretmek için bir in vitro biyosentetik sistem geliştirmek için, Atf3h (GenBank katılım no. NM_114983.3) ve Atfls1 (GenBank katılım no. NM_120951.3) genleri 4 haftalık A. thaliana fidelerinden prokaryotik ekspresyon vektörü pET-32a(+) içine klonlandı. Rekombinant plazmidler E. coli BL21(DE3) dönüştürüldü ve füzyon proteinleri IPTG indüksiyonundan sonra ifade edildi ve ardından Ni-IDA agarose reginler kullanılarak saflaştırma yapıldı. Şekil2'de gösterildiği gibi, saflaştırılmış füzyon proteinleri % 10 SDS-PAGE jelüzerinde %95'in üzerinde yüksek saflık gösterdi, bu da in vitro bienzimatik kaskad ın kurulması için yeterince saftı.

Şekil 1: Bir flavonolünvitrobir flavanone biyosentezi için şematik gösterim . F3H, flavanone 3-hidroksilaz; FLS1, flavonol synthase 1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Rekombinant AtF3H ve AtFLS1 proteinlerinin saflaştırılması. Atf3h ve Atfls1 genleri Arabidopsis thaliana'nın 4 haftalık fidelerinden prokaryotik ekspresyon vektörü pET-32a(+) içine klonlandı ve Escherichia coli BL21(DE3) ile ifade edildi. Rekombinant proteinler Ni-IDA agarose reçinelerle dolu bir afinite kromatografi kolon uğrama yoluyla saflaştırılmıştı. Saflık % 10 SDS-PAGE jel iã§in de belirlendi. M, protein belirteçleri; 1, rekombinant AtF3H protein; 2, rekombinant AtFLS1 protein. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Saflaştırılmış rekombinant proteinlerkullanılarak bienmatik bir basamak oluşturmak için Tablo6'da gösterildiği gibi sentetik bir sistem hazırlanmıştır. Bu sistemin flavanonun flavonole dönüştürülmesi için kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için sisteme NRN eklendi ve TLC ve HPLC/LC/MS analizleri ile KMF biyosentezi saptandı. Şekil3A'da gösterildiği gibi, poliamid TLC plakasında iki yeni nokta ortaya çıkmıştır. Bir nokta dihydrokaempferol benzer bir göç mesafesi gösterdi (DHK), ve diğer KMF benzer. HPLC ve LC/MS tarafından yapılan ek analizler, yeni kimyasalların sırasıyla 11,91 dk ve 20,16 dk tutma süresi gösterdiğini ve sırasıyla (Şekil3B)ve yarı moleküler iyon zirvesi [M H−]⁻ m/z 287.0500 ve 285.0500'de olduğunu göstermiştir (Şekil 3C ), sırasıyla DHK ve KMF ile aynıydı. Veriler KMF'nin bu sistemde NRN'den üretildiğini ve verimin 34.94 mg/L'ye kadar yüksek olduğunu göstermektedir.

Şekil 3: NRN'den KMF sentezi bienzimatik bir basamakta. (A) Poliamid TLC ile tek pot reaksiyon ürünlerinin analizi. 1, NRN standardı; 2, DHK standardı; 3, KMF standardı; 4, reaksiyon karışımı. (B) Reaksiyon ürünlerinin HPLC analiz profilleri. NRN, DHK ve KMF'de sırasıyla 18,74 dk, 11,91 dk ve 20,16 dk bekletme süresi saptandi. (C) Reaksiyon karışımlarında flavonoid bileşiklerin MS analiz profilleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu in vitro sistemin diğer flavanonların ilgili flavonollere dönüştürülmesi için kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için, ERD'nin quercetin'e (QRC) dönüştürülüp dönüştürülemeyeceğini belirlemek için sisteme eriodictyol (ERD) eklendi. Şekil4A'da gösterildiği gibi, poliamid TLC plakasındaki iki yeni nokta, sırasıyla dihidroquercetin (DHQ) ve QRC'ye benzer bir geçiş mesafesi göstermiştir. HPLC ve LC/MS analizleri, bu yeni kimyasalların sırasıyla 10,03 dk ve 16,23dk tutma süresi ve yarı moleküler iyon zirvesi [M−H]⁻ m/z 303.1000 ve 301.1000 olarak saptandığını göstermiştir (Şekil 4C) , tam olarak bu DHQ ve QRC, sırasıyla karşılık gelir. Veriler, bu sistemin ERD'yi QRC'ye dönüştürebileceğini ve verimin 25.55 mg/L olduğunu göstermektedir.

Şekil 4: Erd'den bienzim li sentetik sistemde QRC üretimi. (A) Reaksiyon ürünlerinin poliamid TLC ile analizi. 1, ERD standardı; 2, DHQ standardı; 3, QRC standardı; 4, reaksiyon karışımı. (B) Reaksiyon ürünlerinin HPLC analiz profilleri. ERD, DHQ ve QRC sırasıyla 15,45 dk, 10,03 dk ve 16,23 dk bekletme süresi görüntülendi. (C) Reaksiyon karışımlarında bileşiklerin MS analiz profilleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Pek çok çalışma, sağlık ve gıda endüstrisindeki potansiyel uygulamaları nedeniyle flavonollerin türemesi üzerine odaklanmıştır. Ancak, organik çözücüler ve kimyasal sentez kullanarak geleneksel bitki çıkarma flavonolüretiminde kullanımını kısıtlayan içsel dezavantajları vardır. Burada, bir in vitro bienzymatik kaskad kurarak bir tencerede bir flavanone flavonol üretmek için ayrıntılı bir yöntem rapor. Bu protokoldeki kritik adımlar şunlardır: 1) yüksek aktivite ile saf rekombinant enzimler elde ve 2) bir pot bienzimatik reaksiyon basamak lama kurma. Genel olarak konuşursak, bakterilerde bitki kaynaklı genlerin ekspresyonu enzim aktivitesinin kaybına yol açacak olan dahil etme gövdesi oluşturmayı tercih eder. Bildiğimiz gibi, TrxA ve SUMO gibi bazı peptidler, bakteri¹⁶ifade rekombinant proteinlerin ifade ve çözünürlüğünü artırmak için yardımcı olur. Bu nedenle, pET-32a(+) ve pET SUMO (Step 3.2.3) gibi bu ifade etiketlerini içeren plazmidlere hedef genleri klonlamak yararlı olacaktır. IpTG konsantrasyonu ve indüksiyon sıcaklığının prokaryotik olarak ifade edilen proteinlerin çözünürlüğünü etkileyen iki önemli parametre olduğu bilinmektedir^16. Dahil lenme gövdesioluşumunu daha da azaltmak için IPTG konsantrasyonu ve indüksiyon sıcaklığı optimize edilmelidir. Optimum IPTG konsantrasyonu ve indüksiyon sıcaklığı esas olarak plazmidlerin türüne ve bakteri suşlarına bağlıdır. Bu protokolde IPTG konsantrasyonu ve indüksiyon sıcaklığı sırasıyla 0,2 mM ve 20 - 22 °C olarak optimize edilmiştir (Adım 4.2.3). Buna ek olarak, sıcaklık ve gliserol arıtma ve rekombinant enzimleri depolama istikrar ve aktivite korumak için iki önemli parametrelerdir. Bu protokolde, rekombinant proteinlerin 4 °C'de (Adım 5.5 - 5.12) arındırılması, saflaştırılmış enzimlerin çözeltisine %10 gliserol eklenmesi (Adım 5.13) ve çözeltiyi -80 °C'de (Adım 5.13) depolamak çok önemlidir. Bir-pot reaksiyon basamak, pH ve sıcaklık kurulması iki hayati parametrelerdir. Bu ferrous iyonları (Fe^{2 +}), rekombinant F3H ve FLS1^16,32,33enzim aktivitesi için gerekli bir bileşen, çünkü çok yüksek pH dönüşüm için zararlı olduğu açıktır , tarafından çökelti böyle bir durumda demir hidroksit bir bulamaç oluşturan. Nispeten daha yüksek bir sıcaklık enzim katalize reaksiyonunun ilerlemesini kolaylaştırsa da, çok yüksek sıcaklık enzimi inaktive edecektir. Bu nedenle, dönüştürme nin pH ve reaksiyon sıcaklığını sabitlemesi çok önemlidir. Önceki yayınımız optimum pH ve sıcaklığı sırasıyla 7,2 ve 40 °C olarak ayarlar (Adım 6)^16.

Bu protokol, farklı yüzeyler kullanarak çeşitli flavanonlardan gelen flavonolleri biyosentezlemek için uygun bir şekilde değiştirilebilir. Bu protokolde iki örnek verilmiştir. Şekil3'te gösterildiği gibi, bu sisteme substrat olarak NRN eklendiğinde yeni kimyasallar üretildi. TLC ve HPLC/LC/MS analizleri yeni kimyasalların DHK ve KMF olduğunu ve NRN'nin bu sistemde KMF'ye dönüştürüldüğünü göstermektedir. Sonuçlara olan güveni daha da güçlendirmek için, ¹H NMR (hidrojen-1 nükleer manyetik rezonans), ¹³C NMR (karbon-13 nükleer manyetik rezonans), NOESY (Nükleer Overhauser Etkisi SpektroscopY), XRD (X-ışını) spektral karakterizasyonu toz kırınım), CHN analizörü ve benzeri yeni bir varlık kimyasalların varlığını kanıtlamak için gerekli olabilir. Benzer şekilde, ERD bu bienzymatik basamakta (Şekil4)başarılı bir şekilde QRC'ye dönüştürülebilir.

Bu yöntem için önemli bir sınırlama vardır. Flavonoidlerin bilinen biyosentetik yolu göre, bir flavonol aromatik bir amino asit veya downstream türevleri bu sistem tarafından üretilebilir. Örneğin, KMF 4-coumaroyl:CoA-ligase (4CL), chalcone synthase (CHS), chalcone izobase (CHI), F3H ve FLS²³dahil olmak üzere bir dizi anahtar enzimler tarafından p-coumaric asitten üretilebilir. Benzer şekilde, QRC anahtar enzimlerin aynı panel (yayınlanmamış veri) kullanılarak kafeik asit üretilebilir. Ancak, koenzim A (CoA), ATP ve manonil-CoA büyük ölçüde üretim maliyetini artıracak KMF içine p-koumarik asit dönüştürmek için sisteme dahil edilmesi gerekir. Bu nedenle, Bu sistem genellikle bir dihidroflavonol veya flavonol içine bir flavanon dönüştürmek için sınırlıdır. Buna ek olarak, başlangıç malzemelerinin tamamen dönüştürülmesi de başka bir zorluktur. Bu sistemin verimliliğini daha da artırmak için, gelecekteki araştırmalar diğer bitkilerden yüksek aktivite ile anahtar enzimlerin taranması, anahtar enzimleri kodlayan genlerin mutasyonu, son derece aktif enzimlerin inert taşıyıcılara immobilizasyonu ve daha iyi bir tampon sistem geliştirilmesi.

Bu bir-pot bienzim sentetik sistem kimyasal sentez, mikrobiyal hücre fabrikası gibi bir flavonol üretmek için diğer yaklaşımlar üzerinde bariz içsel avantajlara sahip, ve organik çözücüler kullanarak bitki çıkarma¹⁶. İlk olarak, reaksiyon süresi çok kısa ve sadece 40 dakika ihtiyacı var, bu nedenle bu üretim sistemi emek ve zaman tasarrufu. İkinci olarak, mikrobiyal hücre fabrikasında meydana gelen bu sistemde karmaşık bir fizyolojik düzenleme yoktur ve dahası, tüm bileşenler açıktır. Bu nedenle, reaksiyonu doğru bir şekilde kontrol etmek kolaydır ve böylece gelecekte daha fazla optimizasyon yapmak kolaydır. Üçüncü olarak, bu reaksiyon sistemi sadece basit kimyasallar ve saflaştırılmış rekombinant enzimler içerdiğinden ve Şekil 3 ve Şekil4'te gösterildiği gibi sadece bir ana ara üretilmeye neden olduğundan, hedef moleküllerin arındırılanın daha kolay olması beklenmektedir. bu sistemde hücre fabrikaları ve fabrikalardan daha üretilir. Dördüncü olarak, sistemin ana bileşenleri ortak ve ucuz kimyasallar ve prokaryotik rekombinant enzimler ifade, bu nedenle istenen flavonoidler elde etmek için bu yöntem için son derece uygun maliyetlidir. Beşinci olarak, bu sistemin bileşenlerinin basitliği nedeniyle, büyük bir sanayileşme potansiyelini gösteren, hedef flavonoidlerin seri üretimi için ölçeklendirmek kolaydır. Buna ek olarak, bu sistem diğer ikincil metabolitlerin ekonomik üretimi için bir rehber sağlar.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Bu çalışma, Yangzhou Üniversitesi Özel Olarak Atanan Profesör Start-up Fonları, Jiangsu Özel Olarak Atanan Profesör Başlangıç Fonları, Jiangsu Eyaleti'ndeki Altı Yetenek Tepeleri Projesi (Grant No. 2014-SWYY-016) tarafından finanse edilen bir Proje tarafından finansal olarak desteklendi. Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının (VeterinerHenhenk) Öncelikli Akademik Program Gelişimi. Biz Flavonoidler HPLC ve MS analizleri için Yangzhou Üniversitesi Test Merkezi teşekkür ederiz.