La derivazione di un flavonolo è fondamentale per la sua applicazione nel settore sanitario e dell'industria alimentare. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per la biosintesi di un flavonolo da un flavanone e discutiamo i passi cruciali ei suoi vantaggi rispetto ad altri approcci.

I flavonomi sono una sottoclasse importante dei flavonoidi con una varietà di attività biologiche e farmacologiche. Qui, forniamo un metodo per la sintesi ezimatica in vitro di un flavonolo. In questo metodo, Atf3h e Atfls1, due geni chiave nel percorso biosintetico dei flavonomi, sono clonati e sovraespressi in Escherichia coli. Gli enzimi ricombinanti vengono purificati tramite una colonna di affinità e quindi una cascata bienzimatica viene stabilita in uno specifico buffer sintetico. Due flavonomi sono sintetizzati in questo sistema come esempi e determinati dalle analisi TLC e HPLC/LC/MS. Il metodo mostra evidenti vantaggi nella derivazione dei flavonoli rispetto ad altri approcci. Si tratta di risparmio di tempo e manodopera e altamente conveniente. La reazione è facile da controllare con precisione e quindi scalare per la produzione di massa. Il prodotto di destinazione può essere purificato facilmente grazie ai semplici componenti del sistema. Tuttavia, questo sistema è di solito limitato alla produzione di un flavonolo da un flavanone.

I flavonomi sono una sottoclasse importante dei flavonoidi vegetali e sono coinvolti nello sviluppo e nella pigmentazione delle piante^1,2,3. Ancora più importante, questi composti possiedono una vasta gamma di attività per la salute-benefica, come anti-cancro^4,5, anti-ossidativo⁶, anti-infiammatorio⁷, antiobesità⁸, anti-ipertensivo⁹ , e le proprietà di richiamo della memoria¹⁰, portando ad un gran numero di studi su questi metaboliti secondari derivati dalle piante. Tradizionalmente, questi composti sono principalmente derivati dall'estrazione delle piante utilizzando solventi organici. Tuttavia, a causa del loro bassissimo contenuto negli impianti^11,12,13, il costo di produzione per la maggior parte dei flavonomi rimane elevato, che impone grandi restrizioni sulla loro applicazione nel settore sanitario e alimentare industria.

Nel corso degli ultimi decenni, gli scienziati hanno sviluppato un certo numero di metodi per derivare flavonoidi^14,15. Tuttavia, la sintesi chimica di queste molecole complicate possiede una varietà di svantaggi intrinseci¹⁶. Richiede non solo reagenti tossici e condizioni di reazione estreme, ma anche molti passi per produrre un composto flavonoide bersaglio^14,17. Inoltre, un'altra sfida importante in questa strategia è la sintesi chirale delle molecole flavonoidi attive. Pertanto, non è una strategia ideale per produrre flavonoidi su scala commerciale tramite sintesi chimica^16,17.

Recentemente, gli scienziati hanno sviluppato una promettente strategia alternativa per produrre questi complicati composti naturali progettando microbi con un percorso per la biosintesi flavonoide^{18,19,20, 21 Mieto , 22}, che è stato decifrato con successo nelle piante²³. Ad esempio, Duan ealtri ha introdotto una via biosintetica nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae per produrre kaempferol (KMF)²⁴. Malla et al. ha prodotto astragalina, un flavonolo glicosillato glicosylato, introducendo i geniflavanone 3-idrossislasi (f3h), la sinteassi di flavonol (fls1) e UDP-glucosioide:flavonoid 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 Escherichia coliBL21(DE3)¹⁷. Anche se ci sono un bel po 'di paradigmi, non tutti i microbi geneticamente ingegnerizzati producono i prodotti di interesse a causa della complessità di una piattaforma cellulare, l'incompatibilità tra elementi genetici artificialmente sintetizzati e ospiti, l'inibitorio effetto dei prodotti di destinazione rispetto alle cellule ospiti e l'instabilità di un sistema cellulare ingegnerizzato stesso¹⁶.

Un'altra promettente strategia alternativa per la produzione di flavonoidi è quella di stabilire una cascata multienzimatica in vitro. Cheng et al. hanno riferito che i poliketi enterocin possono essere sintetizzati con successo assemblando un percorso enzimatico completo in un vaso²⁵. Questa strategia sintetica senza cellule aggira le restrizioni di una fabbrica di produzione microbica ed è quindi fattibile per produrre alcuni flavonoidi in grande quantità¹⁶.

Recentemente, abbiamo sviluppato con successo un sistema sintetico bienzima per convertire la naringenina (NRN) in KMF in un vaso¹⁶. Qui, descriviamo questo sistema in dettagli e i metodi coinvolti nell'analisi dei prodotti. Presentiamo anche due esempi che utilizzano questo sistema per produrre KMF da NRN e quercetina (QRC) da eriodictyol (ERD). Inoltre, discutiamo i passaggi cruciali di questo metodo e le future direzioni di ricerca nella biosintesi dei flavonoidi.

1. Isolare l'RNA totale dai tessuti vegetali^26,27

1. Omogeneizzare i tessuti vegetali.
   1. Raccogliere 100 mg di un tessuto vegetale fresco (ad esempio, piantine di 4 settimane dall'Arabidopsis thaliana). Congelare il tessuto e un pestello e malta con azoto liquido, seguito da macinare il tessuto in polvere.
   2. Aggiungere 1 mL di reagente di isolamento DELL'RNA (vedere Tabella deimateriali) nel mortaio. Il reagente verrà congelato immediatamente. Omogeneizzare il campione di tessuto con il pestello quando il reagente congelato si scioglie.
   3. Trasferire l'omolminato in un tubo da 1,5 mL, centrifugare il campione a 12.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, quindi trasferire la soluzione omogenea sgomberata in un altro tubo fresco da 1,5 mL.
   4. Incubare il campione omogeneizzato a temperatura ambiente per 5 min.
2. Isolare l'RNA totale.
   1. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio all'omogeneità, chiudere il tubo in modo sicuro, agitare il tubo vigorosamente a mano per 15 s e incubare il campione a temperatura ambiente per 5 min.
   2. Centrifugare il campione a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi e trasferire la fase acquosa superiore incolore in un tubo fresco da 1,5 mL. Il campione si separa in tre fasi successive alla centrifugazione.
   3. Aggiungere 0,5 mL di alcool isopropile alla fase acquosa, agitare il tubo a mano in modo vigoroso e incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 min.
   4. Centrifugare la miscela a 12.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e rimuovere il supernatante.
   5. Lavare il pellet di RNA una volta con 1 mL del 75% di etanolo mediante vortice, seguito dalla centrifugazione a 7.500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
   6. Ripetere il passaggio 1.2.5.
   7. Asciugare l'aria del pellet per 5-10 minuti e riscioglierla nell'acqua trattata con dietirobicarbonato (DEPC) pipetting su e giù, seguita misurando la concentrazione totale di RNA con un microspettrofotometro (vedi Tabella dei materiali).

2. Sintetizzare IL DNA complementare (cDNA)²⁸

1. Sintetizzare il primo filamento di cDNA utilizzando un kit (vedere Tabella dei materiali). Impostare un sistema di reazione a 20 gradi, come mostrato nella tabella 1 e incubare il tubo di reazione in uno strumento PCR per 50 min a 42 gradi centigradi, seguito terminando la reazione a 85 gradi centigradi per 5 min.

Tabella 1: Trascrizione inversa dell'RNA totale in cDNA

3. Costruire plasmichi ricombinanti²⁹

1. Progettare primer PCR.
   1. Progettare i primer PCR utilizzando un software (vedi Tabella dei materiali) basato sulle sequenze dei geni enzimatici chiave ottenuti dal database GenBank e sintetizzare i primer da un'azienda (vedi Tabella dei materiali). Alla fine 5' del primer, aggiungere un sito enzimatico di restrizione (ad esempio, BamHI o EcoRI in questo protocollo).
      NOTA: i primer utilizzati in questo studio sono riportati nella tabella 2.

Tabella 2: Primer Oligonucleotidi utilizzati nello studio attuale

2. Clonare i geni in un vettore di espressione procariotica.
   1. Amplificare i geni dal primo filamento del cDNA sintetizzato utilizzando una polimerasi del DNA ad alta fedeltà (vedere Tabella dei materiali). Impostare un sistema di reazione PCR da 100 gradi come mostrato nella tabella 3 ed eseguire il seguente ciclo PCR: 94 c per 2 min per la denaturazione iniziale; poi 35 cicli di 94 s per 30 s per la denaturazione, 55 gradi centigradi per 2 min per l'annealing e 72 s per 1 min per l'estensione; seguita da un'allungamento finale a 72 gradi centigradi per 10 min. Raffreddare la miscela di reazione a 12 gradi centigradi.
      NOTA: Il tempo di estensione è variabile e determinato dalla lunghezza del gene con polimerizzazione di circa 1000 basi al centesimo per la maggior parte delle polimerasi del DNA.
   2. Visualizzate i prodotti PCR (più comunemente 5 l) su un gel di garose dell'1% e purificate il frammento specifico di DNA dai restanti prodotti utilizzando un kit di pulizia del DNA (vedere Tabella dei materiali).
   3. Digerire il frammento di DNA purificato e il vettore (ad es., pET-32a() con enzimi di restrizione (ad esempio, BamHI o EcoRI in questo protocollo). In un tubo PCR da 0,2 mL, come mostrato nella tabella 4, disponete di un sistema di reazione da 50 mL, incubare la miscela a 37 gradi centigradi per 3 h. Separare il DNA digerito su un gel di agarose dell'1%.
   4. Recuperare la banda di DNA utilizzando un kit di estrazione gel (vedere Tabella dei materiali). Purificare ulteriormente il DNA utilizzando un kit di pulizia del DNA (vedi Tabella deimateriali), seguito misurando la concentrazione di DNA con un microspettrofotometro (vedi Tabella dei materiali).
   5. Ligate il frammento di gene nel DNA vettoriale linearizzato utilizzando una ligase del DNA T4 (vedere Tabella dei materiali). Impostare una reazione di legatura in un tubo da 1,5 mL come mostrato nella tabella 5 e incubare il tubo a temperatura ambiente per 2 - 3 h.
      NOTA: il rapporto molare di un inserto a un vettore è variabile e varia da 3:1 a 10:1.
   6. Aggiungete 2,5 l della miscela di ligazione in 50 gradi di cellule Escherichia coli chimicamente competenti (ad esempio, TOP10 o DH5), mescolate delicatamente e conservate il tubo sul ghiaccio per 30 minuti.
   7. Aggiungete 200 l di mezzo lB liquido senza antibiotici nel tubo e incubate il tubo in uno shaker di 37 gradi centigradi a 220 giri per una notte di 1 h- 100 L.

Tabella 3: Impostazione di un sistema di reazione PCR

Tabella 4: Doppia digestione di un frammento/vettore di DNA

Tabella 5: Legatura di un frammento genico in un vettore linearizzato

3. Schermate colonie positive.
   1. Inoculare una singola colonia dalla piastra LB in 200 l. di mezzo Liquido LB contenente 100 g/mL di annicillina e incubare a 37 , 250 rpm per 2 - 3 h.
      NOTA: In generale, scegliere 4 - 8 colonie per lo screening delle colonie positive.
   2. Impostare una reazione PCR colonia 10-l simile a quella nel passaggio 3.2.1.
      NOTA: Utilizzare 1 l di coltura LB invece di 1 l del modello cDNA.
   3. Visualizza i prodotti PCR su un gel di agarose dell'1%. Inoculare la coltura rimanente con un risultato positivo in 3 mL di liquido LB medio contenente 100 g/mL di ampicillina e incubare in uno shaker a 37 gradi centigradi a 250 rpm per 14 - 16 h.
   4. Isolare il DNA plasmide dalle colture ricombinanti di E. coli utilizzando un kit di miniprep plasmico (vedere Tabella dei materiali).
   5. Identificare i plasmidi ricombinanti purificati mediante un'analisi degli enzimi a doppia restrizione (ad esempio, BamHI ed EcoRI in questo protocollo). Impostare un sistema di reazione a 10 gradi simile a quello del passo 3.2.3, seguito da incubazione a 37 gradi centigradi per 3 h. Visualizza la banda specifica rilasciata dal plasmide ricombinante su un gel di agarose dell'1%.
4. Verificare le sequenze di plasmidi ricombinanti positivi.
   1. Mandate i plasmidi a un'azienda per il sequenziamento. Analizzare i risultati utilizzando un software di analisi della sequenza del DNA (vedere Tabella deimateriali) confrontando la sequenza ottenuta dalla società di sequenziamento con la sequenza di riferimento ottenuta dal database GenBank.

4. Esprimere proteine enzimatiche ricombinanti³⁰

1. Trasformare il plasmide ricombinante corretto in competente E. coli BL21(DE3).
   1. Aggiungete 0,1 l del plasmide a 10 gradi di competente E. coli BL21(DE3) in un tubo da 1,5 mL sul ghiaccio e tenete il tubo sul ghiaccio per 5 min.
   2. Il calore colpisce le cellule in un bagno d'acqua a 42 gradi centigradi per 90 s e lo riporre sul ghiaccio per 2 minuti.
   3. Aggiungere 200 l di lb di mezzo liquido senza antibiotici e incubare in uno shaker 37 c a 220 rpm per 5 min.
   4. Stendere 50 - L di trasformazione su una piastra di agar LB contenente 100 g/mL di ampicillina e incubare la piastra per una notte in un'incubatrice a 37 gradi centigradi.
2. Indurre l'espressione dei geni.
   1. Inoculare 3 - 5 colonie dalla piastra in un tubo contenente 3 mL di supporto liquido LB con 100 g/mL di ampicillina e incubare a 250 rpm in uno shaker 37 C durante la notte.
   2. Trasferire tutta la coltura durante la notte in 300 mL di lB mezzo liquido contenente 100 g/mL di ampicillina e incubare a 250 rpm in uno shaker 37 c fino a quando la densità ottica della coltura a 600 nm è tra 0,4 - 0,6.
   3. Aggiungere isopropile z-D-thiogalactoside (IPTG) nella coltura con una concentrazione finale di 0,2 mM e indurre l'espressione dei geni a 250 giri/m, 20 - 22 gradi centigradi per 3 h.

5. Purificare le proteine enzimatiche ricombinanti³¹

1. Raccogliere i batteri con centricazione della coltura a 4 gradi centigradi, 12.000 x g per 10 min.
2. Risospendere il pellet in 15 mL di buffer di lisi batterica contenente 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10% glicerol, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 1 aprotina g/mL, 1 g/mL leupeptina e 1 pepstatina di g/mL in 50 mM Tris-Cl (pH 8.0).
3. Sonicare la sospensione batterica per rilasciare le proteine enzimatiche ricombinanti, seguita da centrifugazione a 13.000 x g, 4 gradi centigradi per 10 min.
4. Raccogliere e l'aliquota in tubi da 1,5 mL a 1 mL/tubo e conservarli a -70 gradi centigradi per un uso futuro.
5. Applicare 500 l di resina di purificazione dei tag His (vedere Tabella dei materiali) in una colonna di affinità vuota riutilizzabile. Lavare la resina con 5 posti letto di acqua deionizzata per scartare l'etanolo nella soluzione di riserva. Bilanciare la resina con 10 volumi di letto del buffer di rilegatura che comprende Tris-Cl (20 mM, pH 7,9), imidazole (10 mM) e NaCl (0,5 M).
6. Applicare 4 mL del supernatante dal passo 5.4 a un liquame della resina di cui sopra e bloccare due estremità della colonna con tappi.
7. Incubare la miscela a 4 gradi centigradi su un rotatore a bassa velocità per 2 h.
8. Lavare la resina legata alla proteina di fusione con 15 volumi di letto del tampone di legame a una velocità di portata di 1 mL/min prima dell'elusione.
9. Aggiungere 500 l di tampone di eluizione (contenente 20 mM Tris-Cl (pH 7,9), 500 mM imidazole, 0,5 M NaCl) alla colonna e incubare i liquami a 4 gradi centigradi su un rotatore a bassa velocità per 10 min. Raccogliere l'eluente come campioni proteici purificati.
10. Ripetere il passaggio 5.5 altre quattro volte.
11. Lavare la resina in sequenza con 10 posti letto di acqua deionizzata e 3 comodini di 20% di etanolo. Immergere la resina nel 20% di etanolo. Bloccare la colonna con i tappi e conservarla a 4 gradi centigradi.
12. Misurare la concentrazione delle proteine purificate dall'analizzatore della proteina Bradford. Determinare la purezza delle proteine su un gel 10% SDS-PAGE e visualizzare le bande dal coomassie blu colorazione saggio.
13. Aggiungere glicerolo alla soluzione proteica purificata a una concentrazione finale del 10% per stabilizzare l'attività degli enzimi. Aliquota e conservarlo a -80 gradi centigradi.

6. Produrre un flavonolo da un flavanone in un sistema sintetico in vitrobiere ¹⁶

1. Preparare i buffer.
   1. Crea 2x tampone sintetico senza solfato ferroso composto da 200 mM Tris-HCl (pH 7,2), 16,4 m di acido z-ketoglutaric, 0,8% ascorbate di sodio e 20% di glicerolo. Sciogliere 1,938 g di base di Tris, 0,640 g di ascorbate di sodio, 0,250 g di acido z-ketoglutarico e 16 mL di glicerolo a 64 mL di acqua dionizzata. Regolare il pH a 7,2 con l'acido cloridrico (HCl) e aggiungere acqua deionizzata fino a 80 mL. Conservare il buffer a 4 gradi centigradi per un uso futuro.
   2. Crea una soluzione di riserva 100x di 2 mM di solfato ferroso. Sciogliere 55,6 mg di eptaidrato ferroso in 50 mL di acqua deionizzata, mescolare e aggiungere acqua fino a 100 mL.
   3. Crea una soluzione stock di 25 mM flavonoidi. Sciogliere accuratamente un flavonoide nel metanolo e conservarlo a -20 gradi centigradi.
2. Impostare un sistema sintetico per produrre un flavonolo da un flavanone.
   1. Preparare il sistema sintetico come illustrato nella tabella 6.
   2. Incubare la reazione a 40 gradi centigradi in un tubo aperto da 2,0 mL a 600 giri/mm (in un blocco di calore tremante) per 40 min.
   3. Terminare la reazione aggiungendo 10 l di acido acetico e 100 L di acetato etilico.
   4. Due ore dopo, trasferire le fasi organiche a tubi da 1,5 mL per l'essiccazione dell'aria in un cappuccio a temperatura ambiente.

Tabella 6: Il sistema sintetico utilizzato in questo protocollo.

7. Analizzare i prodotti di reazione

1. Analisi della cromatografia a strati sottili (TLC).
   1. Piscina 5 tubi dei campioni di flavonoide dal passo 6.2.4 e estrarre 300 gradi centigradi per l'essiccazione dell'aria. Sciogliere la polvere di flavonoide in 160 o lofillo. Preparare autentici campioni di flavonoidi con concentrazioni seriali di 12,5, 25, 50, 100 e 200 ng/L in metanolo. Caricare 1 ll dei campioni di reazione e i campioni flavonoidi autentici su piastre di poliammide 6.
   2. Eseguire le piastre caricate campione in un sistema di solventi comprendente cloroformio/metanolo/acido formica etico con un rapporto di 5.0:1.5:1.0:0.5.
   3. Asciugare l'aria le piastre a temperatura ambiente. Spruzzare le piastre con soluzione etanolica dell'1% di cloruro di alluminio (AlCl_3),seguita da un'asciugatura dell'aria a temperatura ambiente.
   4. Trenta minuti dopo, visualizzare le macchie sulle piastre sotto una luce UV a 254 nm e scattare immagini.
   5. Analizzare il valore grigio di ogni punto sulle immagini utilizzando un software di elaborazione delle immagini (ad esempio, ImageJ v1.51j8 in questo protocollo).
      1. Aprire il software ImageJ. Fare clic su File > Apri per aprire l'immagine da analizzare.
      2. Fare clic sullo strumento di selezione R piùa sinistra nell'interfaccia utente ImageJ. Delineare l'area di interesse (ROI) nell'immagine con il mouse e premere per etichettare il primo ROI.
      3. Spostare la selezione rettangolare con il mouse verso destra al ROI successivo e premere per etichettare il secondo ROI.
      4. Ripetere il passaggio precedente per etichettare tutte le altre ROI.
      5. Premere per generare grafici di profilo per tutte le ROI in una finestra popup.
         NOTA: in questo momento, lo strumento di selezione lineare nell'interfaccia utente ImageJ verrà attivato automaticamente.
      6. Utilizzare lo strumento Selezione linea retta per disegnare linee di base in modo da definire un'area chiusa per ogni picco di interesse.
      7. Attivare lo strumento di bacchetta facendo clic sull'icona corrispondente nell'interfaccia utente ImageJ. Fare clic all'interno del picco per visualizzare i risultati per tutti i picchi in una finestra popup.
   6. Creare una curva standard basata su TLC dell'autentico flavonoide tracciando i valori grigi del passaggio 7.1.5.7 rispetto alle concentrazioni di flavonoidi corrispondenti dal punto 7.1.1. Quindi, calcolare la resa del flavonoide di interesse prodotto in questo protocollo in base alla formula risultante.
2. Analisi della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e della cromatometria liquida/spettrometria di massa (LC/MS)
   1. Elaborare i campioni dal punto 7.1.1 in sequenza a 0,45 m e 0,22 m filtri.
   2. Caricare i campioni in un sistema HPLC/LC/MS (vedere Tabella deimateriali) e separarli a 30 gradi centigradi utilizzando una colonna C18 (4,6 x 150 mm; i.d., 5 m). Elute la colonna a 1,0 mL/min con un gradiente di 10 - 85% (v/v) acetonitrile (ACN) in acqua (0 - 10 min, 10 - 25% ACN; 10 - 35 min, 25 - 50% ACN; 35 - 45 min, 50 - 85% ACN; 45 - 50 min, 85 - 10% ACN; 50 - 60 min , 10% ACN) e monitorare l'assorbimento dell'eluato da 200 a 800 nm. Eseguire l'analisi LC/MS in una modalità ione negativo con un flusso di azoto di essiccazione di 10 L/min a 300 gradi centigradi e un flusso di gas di guaina di 7 L/min a 250 gradi centigradi e raccogliere dati utilizzando un software integrato (vedere Tabella dei materiali).
   3. Estrarre croromatogrammi a lunghezza d'onda singola per calcolare le aree di picco dei campioni di reazione e i composti flavonoidi autentici utilizzando un software (vedere Tabella dei materiali).
      1. Aprire il programma Analisi qualitativa e fare clic su File > Apri file di dati. Selezionare i file da analizzare nella finestra Apri file di dati e fare clic su Apri per aprire i file.
      2. Fare clic con il pulsante destro del mouse nella finestra Cromatogramma R e quindi sull'hromatogramma Extract C in un menu a comparsa.
      3. Aprire la finestra di dialogo Extract Chromatograms. Nell'elenco Tipo fare clic su Altri cromatogrammi. Nella casella combinata Rilevatore selezionare DAD1. Quindi fare clic su OK per visualizzare i risultati HPLC nella finestra Risultati hromtogramma C.
      4. Fare clic sull'icona Mannuale Integration ancorata nella parte superiore della finestra Risultati hromtogramma C. Disegnare una linea di base per il picco necessario per l'analisi manuale dell'integrazione con il mouse.
      5. Fare clic su Visualizza > Elenco picco integrazione per visualizzare i risultati.
   4. Creare una curva standard basata su HPLC dell'autentico flavonoide tracciando le aree di picco dal punto 7.2.3.5 rispetto alle concentrazioni di flavonoidi corrispondenti dal punto 7.2.1. Quindi, calcolare la resa del flavonoide di interesse prodotto in questo protocollo in base alla formula risultante.
   5. Analizzare i dati MS per l'esatta massa di composti flavonoidi utilizzando un software (vedere Tabella dei materiali).
      1. Ripetere i passaggi da 7.2.3.1 a 7.2.3.3.
      2. Fare clic sull'icona Selezione intervallo sulla barra degli strumenti Risultati hromtogramma C.
      3. Selezionare il picco di interesse. Fare clic con il pulsante destro del mouse nell'intervallo selezionato e fare clic su Estrai MS Spectrum nel menu a comparsa per visualizzare i risultati nella finestra Risultati ms Spectrum.

F3H e FLS1 sono due importanti enzimi chiave nella conversione di un flavanone in un flavonolo nelle piante, come mostrato nella Figura 1. Sviluppare un sistema biosintetico in vitro per la produzione di un flavonolo da un flavanone, Atf3h (GenBank accession no. NM_114983.3) e Atfls1 (Nr. adesione del GenBank NM_120951.3) sono stati clonati dalle piantine di A. thaliana di 4 settimane in un vettore di espressione procariotica pET-32a. I plasmidi ricombinanti sono stati trasformati in E. coli BL21(DE3) e le proteine di fusione sono state espresse dopo l'induzione IPTG, seguite dalla purificazione utilizzando resine agarose Ni-IDA. Come mostrato nella Figura 2, le proteine di fusione purificate hanno mostrato un'elevata purezza di oltre il 95% su un gel SDS-PAGE del 10%, che erano abbastanza puri per la creazione di una cascata bienzimatica in vitro.

Figura 1: Rappresentazione schematica per la biosintesi di un flavonolo da un flavanonein vitro. F3H, flavanone 3-idrossissia; FLS1, sintetizzatore flavonolo 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Purificazione delle proteine tra scombinanti AtF3H e AtFLS1. I geni Atf3h e Atfls1 sono stati clonati da piantine di 4 settimane dell'Arabidopsis thaliana in un vettore di espressione procariotica pET-32a( ) ed espresso in Escherichia coli BL21(DE3). Le proteine ricombinanti sono state purificate attraverso una colonna di maromografia di affinità piena di resine di agarose Ni-IDA. La purezza è stata determinata su un gel SDS-PAGE 10%. M, marcatori proteici; 1, proteina AtF3H ricombinante; 2, proteina AtFLS1 ricombinante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per stabilire una cascata bienzimatica utilizzando le proteine ricombinanti purificate, è stato preparato un sistema sintetico come mostrato nella tabella 6. Per determinare se questo sistema può essere utilizzato per la conversione di un flavanone in un flavonolo, NRN è stato aggiunto al sistema, e la biosintesi di KMF è stata rilevata dalle analisi TLC e HPLC/LC/MS. Come mostrato nella Figura 3A, ci sono stati due nuovi punti emersi su una piastra TLC poliammide. Un punto ha mostrato una distanza di migrazione simile a quella di dihydrokaempferol (DHK), e l'altro simile a quello di KMF. Un'ulteriore analisi da parte di HPLC e LC/MS ha dimostrato che le nuove sostanze chimiche hanno mostrato un tempo di ritenzione di 11,91 min e 20,16 min, rispettivamente (Figura 3B) e un picco iogene quasi molecolare [M-H]^- a m/z 287.0500 e 285.0500, rispettivamente (Figura 3C . ), identici a quelli rispettivamente di DHK e KMF. I dati indicano che KMF è stato prodotto da NRN in questo sistema e il rendimento è stato fino a 34,94 mg/L.

Figura 3: Sintesi di KMF da NRN in una cascata bienzimatica. (A) Analisi dei prodotti di reazione a un vaso mediante il TLC poliammide. 1, standard NRN; 2, standard DHK; 3, standard KMF; 4, miscela di reazione. (B) Profili di analisi HPLC dei prodotti di reazione. NRN, DHK e KMF hanno mostrato un tempo di ritenzione rispettivamente di 18,74 min, 11,91 min e 20,16 min. (C) Profili di analisi della SM dei composti flavonoidi nelle miscele di reazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per determinare ulteriormente se questo sistema in vitro può essere utilizzato per la conversione di altri flavanoni nei loro flavonomi corrispondenti, è stato aggiunto eriodictyol (ERD) nel sistema per determinare se ERD può essere convertito in quercetina (QRC). Come illustrato nella Figura 4A, due nuovi punti su una piastra TLC poliammide mostravano una distanza di migrazione simile a quella di dihydroquercetina (DHQ) e QRC, rispettivamente. Le analisi hp'HLC e LC/MS hanno dimostrato che queste nuove sostanze chimiche hanno rivelato un tempo di ritenzione rispettivamente di 10,03 min e 16,23 min (Figura 4B) e un picco iogene quasi molecolare [M-H] a m/z 303.1000 e 301.1000, rispettivamente ( Figura4C) , che corrispondevano esattamente a quelli di DHQ e QRC, rispettivamente. I dati indicano che questo sistema può convertire ERD in QRC e il rendimento è stato di 25,55 mg/L.

Figura 4: Produzione di QRC da ERD in un sistema bieagistino sintetico. (A) Analisi dei prodotti di reazione mediante Polyamide TLC. 1, standard ERD; 2, standard DHQ; 3, standard QRC; 4, miscela di reazione. (B) Profili di analisi HPLC dei prodotti di reazione. ERD, DHQ e QRC visualizzavano un tempo di conservazione rispettivamente di 15,45 min, 10,03 min e 16,23 min. (C) Profili di analisi della SM dei composti nelle miscele di reazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Una serie di studi si concentra sulla derivazione dei flavonomi a causa della loro potenziale applicazione nell'assistenza sanitaria e nell'industria alimentare. Tuttavia, l'estrazione tradizionale delle piante con solventi organici e la sintesi chimica possiedono svantaggi intrinseci, che ne limitano l'uso nella produzione di flavonomi. Qui, riportiamo un metodo dettagliato per produrre un flavonolo da un flavanone in un vaso stabilendo una cascata bienzimatica in vitro. I passaggi critici di questo protocollo sono: 1) ottenere enzimi ricombinanti puri con attività elevate e 2) stabilire una cascata di reazione biezimatica a un vaso. In generale, l'espressione dei geni di origine vegetale nei batteri preferisce formare il corpo di inclusione, che porterà alla perdita di attività enzimatica. Come sappiamo, alcuni peptidi, come TrxA e SUMO, aiutano a migliorare l'espressione e la solubilità delle proteine ricombinanti espresse nei batteri¹⁶. Pertanto, sarà utile clonare i geni bersaglio nei plasmidi contenenti questi tag di espressione, ad esempio pET-32a e pET SUMO (Passaggio 3.2.3). È ben noto che la concentrazione e la temperatura di induzione di IPTG sono altri due parametri cruciali che influenzano la solubilità delle proteine procyoticamente espresse¹⁶. Per ridurre ulteriormente la formazione del corpo di inclusione, la concentrazione di IPTG e la temperatura di induzione dovrebbero essere ottimizzate. La concentrazione ottimale di IPTG e la temperatura di induzione dipende principalmente dal tipo di plasmidi e dai ceppi batterici. In questo protocollo, la concentrazione IPTG e la temperatura di induzione sono ottimizzate rispettivamente a 0,2 mM e 20 - 22 gradi centigradi (passo 4.2.3). Inoltre, la temperatura e il glicerolo sono due parametri importanti per mantenere la stabilità e l'attività durante la purificazione e la conservazione degli enzimi ricombinanti. In questo protocollo, è fondamentale purificare le proteine ricombinanti a 4 gradi centigradi (Passi 5,5 - 5,12), aggiungere il 10% di glicerolo nella soluzione degli enzimi purificati (Passaggio 5.13), e immediatamente aliquotare e conservare la soluzione a -80 gradi (Passo 5.13). In stabilimento di una cascata di reazione one-pot, pH e temperatura sono due parametri vitali. È ovvio che un pH troppo elevato è dannoso per la conversione perché gli ioni ferrosi (Fe²⁾sono una componente necessaria per l'attività enzimatica di F3H ricombinante e FLS1^16,32,33, sono precipitati da formando un liquame di idrossido ferroso in tale condizione. Anche se una temperatura relativamente più elevata facilita il progresso di una reazione enzimatica-catalizzato, la temperatura troppo elevata inattiverà l'enzima. Pertanto, è fondamentale che la conversione stabilizzi il pH e la temperatura di reazione. La nostra pubblicazione precedente fissa il pH e la temperatura ottimali rispettivamente a 7,2 e 40 gradi centigradi (passo 6)¹⁶.

Questo protocollo potrebbe essere convenientemente modificato per biosintetizzare un certo numero di flavonomi provenienti da vari flavanone utilizzando diversi substrati. In questo protocollo vengono forniti due esempi. Come mostrato nella Figura 3, quando si aggiunge NRN come substrato in questo sistema, sono state prodotte nuove sostanze chimiche. Le analisi TLC e HPLC/LC/MS indicano che le nuove sostanze chimiche erano DHK e KMF, e la NRN è stata convertita nel KMF in questo sistema. Per rafforzare ulteriormente la fiducia nei risultati, la caratterizzazione spettrale di ¹H NMR (risonanza magnetica nucleare a idrogeno-1), ¹³C NMR (risonanza magnetica nucleare di carbonio-13), NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY), XRD (X-ray diffrazione in polvere), analizzatore CHN e simili possono essere necessari per attestare la presenza di sostanze chimiche in una nuova entità. Analogamente, ERD potrebbe essere convertito correttamente in QRC in questa cascata bienzimatica (Figura 4).

Esiste una limitazione importante per questo metodo. Secondo il noto percorso biosintetico dei flavonoidi, un flavonolo può essere prodotto da questo sistema da un amminoacido aromatico o dai suoi derivati a valle. Ad esempio, KMF può essere prodotto da acidop-coumarico da una serie di enzimi chiave, tra cui 4-coumaroyl:CoA-ligase (4CL), chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), F3H e FLS²³. Allo stesso modo, il QRC può essere prodotto dall'acido caffeico utilizzando lo stesso pannello di enzimi chiave (dati inediti). Tuttavia, il coenzima A (CoA), l'ATP e il manonil-CoA devono essere inclusi nel sistema per convertire l'acido p-coumarico in KMF, il che aumenterà notevolmente il costo di produzione. Pertanto, questo sistema è di solito limitato a convertire un flavanone in un dihydroflavonol o un flavonolo. Inoltre, la conversione completa dei materiali di partenza è un'altra sfida. Per migliorare ulteriormente l'efficienza di questo sistema, la ricerca futura dovrebbe essere focalizzata sullo screening degli enzimi chiave con alte attività di altre piante, sulla mutazione dei geni che codificano gli enzimi chiave, sull'immobilizzazione degli enzimi altamente attivi ai portatori di inerti e sviluppo di un sistema di buffer migliore.

Questo sistema sintetico bienzima one-pot possiede evidenti vantaggi intrinseci rispetto ad altri approcci per produrre un flavonolo, come la sintesi chimica, fabbrica di cellule microbiche, e l'estrazione di piante utilizzando solventi organici¹⁶. In primo luogo, il tempo di reazione è molto breve e ha bisogno solo di 40 min, quindi questo sistema di produzione è laborioso e risparmio di tempo. In secondo luogo, non esiste una regolazione fisiologica complessa in questo sistema come si è verificato nella fabbrica di cellule microbiche e inoltre, tutti i componenti sono chiari. Pertanto, è facile controllare la reazione in modo accurato e quindi conveniente per fare ulteriore ottimizzazione in futuro. In terzo luogo, poiché questo sistema di reazione contiene solo semplici sostanze chimiche ed enzimi ricombinanti purificati e genera solo un intermediario principale, come illustrato nella Figura 3 e Figura 4, si prevede che sia più facile purificare le molecole bersaglio generato in questo sistema rispetto a quelli delle fabbriche e delle piante cellulari. In quarto luogo, i principali componenti del sistema sono sostanze chimiche comuni ed economiche ed enzimi ricombinanti prokaryoticically espressi, quindi è altamente conveniente per questo metodo derivare flavonoidi desiderati. In quinto luogo, grazie alla semplicità dei componenti di questo sistema, è facile scalare per la produzione di massa di flavonoidi bersaglio, indicando un enorme potenziale di industrializzazione. Inoltre, questo sistema fornisce una guida per la produzione economica di altri metaboliti secondari.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da Yangzhou University Specially-Appointed Professor Start-up Funds, Jiangsu Specially-Appointed Professor Start-up Funds, Six Talent Peaks Project nella provincia di Jiangsu (Grant no. 2014-SWYY-016), e un progetto finanziato da il programma accademico prioritario sviluppo degli istituti di istruzione superiore di Jiangsu (medicina veterinaria). Ringraziamo il Testing Center dell'Università di Yangzhou per le analisi HPLC e MS dei flavonoidi.