Method Article
Bal arısı beyin farklı bölgelerinde farmakolojik ajanların inhibitör etkileri Fosfolifaz C (PLC) üzerinde test etmek için biz bu bölgelerde PLC etkinliği ölçmek için biyokimyasal bir tahlil mevcut. Bu tahlil PLC etkinlik dokular arasında hem de farklı davranışlar sergileyen arılar arasında karşılaştırmak için yararlı olabilir.
Balarısı karmaşık davranış ve öğrenme, bellek ve iş bölümü gibi daha yüksek beyin fonksiyonları değerlendirmek için bir model organizmadır. Mantar (MB) daha yüksek bir beyin merkezi sinir substrat karmaşık bal arısı davranışların olmak için önerilen organıdır. Genler ve proteinler differentially MBs ve diğer beyin bölgeleri ifade önceki çalışmalarda tespit rağmen her bölgedeki proteinlerin faaliyetleri henüz tam olarak anlaşılır değil. Bu proteinler beyin fonksiyonları ortaya çıkarmak için farmakolojik analizidir uygun bir yaklaşım farmakolojik manipülasyonlar gerçekten bu beyin bölgeleri protein etkinliğinde alter onaylamak için ilk gerekli değildir
Biz daha önce Fosfolifaz C (PLC) MBs diğer beyin bölgeleri içinde kodlama genlerin daha yüksek bir ifade tanımlanmış ve farmakolojik PLC katılımı bal arısı davranış değerlendirildi. Bu çalışmada, biyokimyasal olarak iki farmakolojik ajanlar test ve PLC MBs ve diğer beyin bölgeleri etkinliğinde azalma doğruladı. Burada, bal arısı beyin homogenate PLC bir etkinlik tespit nasıl ayrıntılı bir açıklama mevcut. Bu tahlil sistemdeki farklı beyin bölgelerden elde edilen homogenates sentetik fluorogenic substrat ile tepki ve PLC aktivitesinden kaynaklanan floresans sayılabilir ve beyin bölgeleri arasında karşılaştırıldığında. Ayrıca aynı sistemi kullanarak PLC faaliyete değerlendirmemizi bazı ilaçlar inhibitör etkilerinin açıklar. Bu sistem diğer endojen floresans bileşikler ve/veya tahlil bileşenleri ve dokuların absorbans tarafından etkilenen olasılığı olmasına rağmen bu sistemi kullanarak PLC etkinlik ölçümü daha güvenli ve bu geleneksel tahlil kullanarak daha kolay olan radiolabeled yüzeylerde gerektirir. Basit bir prosedür ve manipülasyonlar PLC aktivite beyni ve arıları farklı sosyal görevleri dahil diğer dokuların incelemek için bize izin verir.
Avrupa bal arısı (Apis mellifera L.) eusocial böcek ve dişi arılar kast bağımlı üreme ve yaş bağımlı işbölümü göstermek. Örneğin, büyük olanlar yem nektar ve polen kovan1dışında iken 'işçi' olarak anılacaktır arılar steril kast içinde genç bireyler broods yem. Öğrenme ve hafıza toplayıcılar art arda gıda kaynakları ve onların yuva arasında ileri geri gidin ve onların nestmates dans aracılığıyla için iyi gıda kaynaklarının konumları iletişim kurmak çünkü bal arısı, hayatta önemli yeteneğidir iletişim1. Önceki çalışmalar MB, böcekler, daha yüksek bir beyin merkezinde bal arısı2,3,4öğrenme ve bellek yeteneği ilgilenmektedir gösterdi. Bal arısı5,6,7,8,9,10 , çeşitli beyin bölgelerinde differentially ifade genler ve proteinler tespit edilmiştir ,11her beyin bölgesi benzersiz işlevleri için ilişkili düşündüren,. Farmakolojik inhibisyon veya aktivasyon bir protein ilgi bal arısı davranış12,13,14proteinin işlevini ortaya çıkarmak için kullanılmış bir yaklaşım olmakla birlikte, bu olup tüm uyuşturucu bilinmiyor bal arısı beyin farklı bölgelerinde işlevsel etkileri vardır. Bu tür ilaçların fonksiyonların doğrulama çalışmaları sonuçlarını davranış Farmakoloji güçlendirecektir.
Burada, PLC, fare biliş15,da16,17,18karıştığı enzimler ele. PLC tarafından aşağılayıcı phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) ve diacylglycerol (DAG)19,20,21sinyal kalsiyum tetikler. IP3 kalsiyum iyonları serbest bırakmak--dan ER önde gelen IP3 reseptörleri endoplazmik retikulum (ER), üzerinde açılır. Yayımlanan kalsiyum kalsiyum/calmodulin-bağımlı protein kinaz II (CaMKII) ile calmodulin ve protein kinaz C (PKC) huzurunda DAG'ı etkinleştirir. Her iki protein kinaz öğrenme ve bellek22,23, PLC tutulumu bu süreçte tutarlı katılmaktadırlar. PLC'ler içine alt türlerinden, PLCβ, PLCγ ve PLCε, onların yapıları20tarihinde dayalı gibi kategorize edilir. Her PLC alt türü farklı bir bağlamda20dakikaya etkinleştirilir ve bu alt türlerinden kodlama genler differentially farklı dokularda ifade edilir. Biz daha önce bal arısı MBs kalan beyin bölgeleri24daha yüksek düzeyde PLCβ ve PLCε alt türlerinden kodlama genler express ve iki pan-PLC inhibitörleri (edelfosine ve paromisin sülfat [paromisin]) PLC aktivitesinde azalma gösterdi farklı beyin bölgelerini ve gerçekten de, bal arısı24öğrenme ve bellek yeteneğini etkiler.
Geleneksel olarak, PLC enzimatik aktivite uygun eğitim, ekipman ve tesisleri gerektiren radiolabeled PIP225, kullanarak ölçülen. Son zamanlarda, PLC, sentetik fluorogenic substrat kurulan26Standart laboratuvar PLC etkinliğini değerlendirmek kolaylaştırır, olmuştur. Burada, detaylı bir protokol PLC faaliyet fluorogenic substrat kullanarak bal arısı, farklı beyin bölgelerinde tespit etmek ve daha sonra bu dokularda edelfosine ve paromisin PLC inhibitör etkilerini test etmek için mevcut. Protokol yalnızca temel işlemler gerektirdiğinden, PLC aktivite diğer dokularda veya farklı sosyal görevler için ayrılan arılar beyin alanlarında çalışmaları için geçerli olabilir.
1. yiyecek arıları yakalama
2. bal arısı beyin diseksiyon
3. beyin Homogenates hazırlanması
4. PLC tepki olarak beyin Homogenates
5. PLC aktivitesinden kaynaklanan floresans tespiti
6. farmakolojik ajanların inhibitör eyleminin testi
7. istatistiksel analiz
Protein konsantrasyonları beyin Homogenates içinde:
Forager arılar kullanarak homogenates hazırladık. Orijinal homogenates hesaplanan protein konsantrasyonlarda Şekil 3' te gösterilmektedir. Orijinal homogenate yaklaşık protein konsantrasyonlarda aşağıdaki gibidir: 1,5 mg/mL MBs ve 2.3 mg/mL diğer beyin bölgeleri. Lot başına iki arılar kullandık ve altı çok analiz edildi.
Beyin Homogenates PLC aktivite tespiti:
Pilot deneyde, diğer beyin bölgelerinde MBs daha yüksek floresans tespit ettik. Bu nedenle, diğer beyin bölgeleri homogenate kullanarak ön deneyler tekrarladı ve reaksiyon süresi (yani, 30 min) ve protein miktarı (yani, 1.3 µg) belirledi. Bu koşullar altında reaksiyon sonucu Şekil 4' teAgösterilir. İçeren doku homogenate ve fluorogenic substrat reaksiyon karışımları sergilenen > doku homogenate veya PLC etkinlik olduğunu düşündüren fluorogenic substrat içeren denetim karışımları daha 4.2-fold daha yüksek floresan reaksiyon karışımları algıladı. Göreli floresans MBs (Şekil 4B) diğer beyin bölgelerinde yaklaşık 3.4-fold daha yüksek.
PLC etkinlik farmakolojik ajanların inhibitör etkilerinin Analizi:
PLC etkinlik pan-PLC inhibitörleri edelfosine ve paromisin etkilerini incelemek için biz aynı homogenate gibi yukarıda analiz kullanarak tepki 1.0 mmol/L edelfosine veya 0.55 mmol/L paromisin, huzurunda gerçekleştirilen. Edelfosine huzurunda, floresans düzeyi yaklaşık %6.0 ve % 5,4 MBs ve diğer beyin bölgeleri için sırasıyla, denetimleri olmadan edelfosine (Şekil 4C) kıyasla azalmıştır. Paromisin tedavi azalmış floresan düzeyi % 44 ve tedavi edilmezse, MBs ve denetleyen diğer beyin bölgeleri içinde sırasıyla % 20 (Şekil 4D).
Resim 1 : Forager bal arısı yakalama. Onu kovana geri dönen bir forager bir böcek net yakalanmış ve bir 50 mL Plastik Konik tüp içine sınırlı oldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Diseksiyon yordam şematik Gösterim. (A)eksenler iletişim kuralında belirtilen bal arısı beyin gösterilir. Baş bee anterior toraks ile yan taraftan görülüyor. (B - K) Fotoğraf ve illüstrasyonlar diseksiyon yordamlar gösterilir. Ayrıntılı bilgi için ana metne bakın. Sadece balarısı Başkanı sunulur. Tracheae bir örnek atlandı. MBs mantar organları =. Ölçek çubukları 1 mm. için karşılık gelen Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Protein konsantrasyonları içinde beyin dokusu homogenates. Orijinal homogenates protein konsantrasyonları BCA tahlil tarafından ölçülen ve hesaplanan. Standart sapma ile ortalama konsantrasyonları gösterilir. İki forager arılar her birçok için kullanıldı ve altı çok analiz edildi. MBs mantar organları =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Floresan tespit tepkileri. (A) Bu paneli gösterir floresans her doku veya fluorogenic olmadan alt katman. Reaksiyon 30 dk protein 1.3 µg kullanılarak gerçekleştirildi. Floresans Mikroplaka Okuyucu tarafından ölçüldü. Örnek kuyu değerleri boş wells tarafından düzeltildi ve rasgele birimlerinde (AUs) gösterilir. (B) Bu panel floresans beyin doku arasında bir karşılaştırmasını gösterir. Masası'a A veri çıkarma tarafından denetim karışımları için düzeltilmiş ve içinde MBs. hesaplanan floresans tarafından normalleştirilmiş * P < 0.005, Mann-Whitney U testi. Panelleri C ve D (C) 1.0 mmol/L edelfosine ve (D) 0.55 mmol/L paromisin huzurunda göreli floresans göster. A ve B panellerde kullanılan aynı homogenates analiz edildi. Floresans değerleri her doku için ilaç tedavisi olmadan denetim deney sonuçlarına göre normalleştirilmiş. Denetim reaksiyonlar panelinde C veri paneli Bile aynıdır. Dpanelinde tüm homogenates daha farklı bir deneyde analiz edildi. Standart sapma ile ortalama floresans değerler gösterilir. İki arılar her birçok için kullanıldı ve altı çok analiz edildi. P < 0,05, Wilcoxon imzaladı-sırada testi. Hiçbir Hg denetim karışımı homogenate; içeren değil = MBs mantar organları =. Panelleri B - D Suenami ve ark. değiştirildi publisher'ın izni ile 24 . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Bir enzim aktivitesinin yüzeylerde ve inhibitörleri, gibi çeşitli moleküller tarafından etkilenen ve böylece, ile birlikte değiştirebilirsiniz çünkü moleküler beyin, sinyal anlamak için son derece önemli protein faaliyet biyokimyasal incelenmesidir hayvan davranışları5(Örneğin, öğrenme ve hafıza). Bal arısı çalışmalarda, siklik AMP bağımlı protein kinaz A, siklik GMP-bağımlı protein kinaz, PKC, fosforile CaMKII ve adenilat cyclase gibi enzimler differentially dayalı çeşitli beyin bölgeleri ifade bildirilmiştir immünhistokimya5,10,29,30,31. Enzimatik aktivite beyin bölgeleri arasında farklılıklar ancak, sadece kısmen bildirilen6vardır. Burada, PLC aktivite tespit ve farmakolojik ajanların MBs ve diğer beyin bölgeleri inhibitör etkileri değerlendirmek için detaylı bir protokol açıklanan.
Floresans algılama ile müdahale mümkün bazı faktörler vardır. İlk olarak, protein yıkımı biyokimyasal testleri gerçekleştirirken korumak önemlidir. Burada açıklanan protokolünde bir hızlı diseksiyon ve beyin dondurulması gereklidir. Bu doku örnekleri donmuş ve yakında diseksiyon her döngüsü sonra saklı önerilir. Homogenate donma/çözülme döngüsü indirilmesi de protein bozulmasını önlemek çok önemlidir.
PLC etkinliği bir floresan sinyal ile algıladığından protein yıkımı ek olarak, arka plan floresans ve absorbans tepki karışımı sonuçları bu tahlil sisteminde etkileyebilir. Örneğin, suda paromisin floresan algılama etkiler sarı bir renge sahiptir. 0.55 mmol/L paromisin, hisse senedi çözüm 1000-fold bir seyreltme kullanılmış olmasına rağmen konsantrasyonu daha fazla bir optimizasyon gerekli olabilir. Ayrıca, diğer dokular tarafından kirlenme sonucu etkileyebilir. Görsel uyaranlara algılar ve pigment içeren, retina, potansiyel olarak tahlil ile engelleyen bir doku türü kapsar.
Mevcut iletişim kuralı ile diğer beyin bölgelerinde MBs24daha yüksek PLC etkinlik algıladı. Bu MBs PLC genler yüksek düzeyde diğer beyin dokuları24daha hızlı ortaya nicel Ters transkripsiyon PCR analiz sonucu ile tutarsız. Bu çelişki WH-serbest yüzer substrat26ve biz membran ve beyin homogenates sitozolik kesirler ayrım değil ki aslında 15 nedeniyle, olabilir. PLCβ ve PLCε membran ilişkili enzimler32 ve endojen PIP2 substrat ile iletişim kurabilirim göz önüne alındığında, PLC ve WH-15 arasındaki reaksiyon olasılığı homogenate membran kesir miktarını etkiler. PLC konsantrasyonu diğer beyin bölgeleri protein üretim ve/veya bozulma oranlarındaki farklılıklar nedeniyle MBs içinde daha yüksek olabilir başka bir mantıklı açıklaması bu. Bu nedenle, beyin aktivitesinde bona fide PLC açıklık gerekir daha fazla ek deneyler tarafından son zamanlarda bildirilen yeni alt katman kullanarak membran33dahil gibi membran ilişkili ve sitozolik faaliyetini çözümleme PLC'ler ayrı olarak, ya da PLC'ler veya PIP içeriğini miktarının2 her beyin dokusu içinde.
Yukarıdaki noktaları dikkate alarak, burada açıklanan PLC tahlil sistem-ebilmek var olmak genişlemek burada, sindirim sistemi, kas ve üreme organı gibi değerlendirildi değil farklı dokularda PLC etkinliği ölçmek için. PLC faaliyet forager beyinlerinin ve PLC faaliyet farklı sosyal roller katılımı değerlendirmek için hemşire arılar arasında karşılaştırmak mümkündür.
Radiolabeled PIP2 kullanarak geleneksel bir yaklaşım gerektirir iken standart Laboratuar donanımları ile yapılabilir çünkü doku homogenates PLC aktivite tespit İhtisas için genel olarak, burada sunulan tahlil sistemi uygulanabilir bir seçenek olduğunu İmkanlar, eğitim ve ekipman için radioisotopes. Daha fazla değişiklikler ile sistem yararlanarak balarısı'nın karmaşık davranış temel moleküler mekanizmaları anlayışımızı derinleştirmek olacak.
Yazarlar ifşa gerek yok.
Şekil 4B - 4 D Suenami ve ark. güncellenmiştir 24 biyoloji açık izni ile. Yazarlar için yayımcı izni için minnettarız. Bu eser insan sınır bilim programı (RGY0077/2016) Shota Suenami ve Ryo Miyazaki tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır