蜜蜂匀浆中磷脂酶 C 活性的检测

为了检验药理学药物对蜜蜂脑不同区域磷脂酶 C (plc) 的抑制作用, 我们提出了一种生化检测方法来测量这些地区的 plc 活性。该方法可用于比较组织中的 PLC 活动, 以及不同行为的蜜蜂之间的对比。

蜜蜂是一种评估复杂行为和更高的大脑功能的模型有机体, 如学习、记忆和分工。蘑菇体 (MB) 是一个更高的大脑中心, 被建议成为复杂蜜蜂行为的神经基质。尽管以前的研究发现了在 MBs 和其他脑区表达差异的基因和蛋白质, 但每个区域的蛋白质的活动尚未完全理解。为了揭示这些蛋白质在大脑中的作用, 药理学分析是一种可行的方法, 但首先必须确认药理操作确实改变了这些脑区的蛋白质活动。

我们以前发现在 MBs 中, 编码磷脂酶 C (PLC) 的基因的表达比其他脑区更高, 药理评估了 PLC 参与蜜蜂行为的情况。在这项研究中, 我们生化测试了两个药理剂, 并证实他们降低了在 MBs 和其他大脑区域的 PLC 活动。在此, 我们详细介绍了如何检测蜜蜂脑匀浆中的 PLC 活性。在该检测系统中, 由不同脑区产生的组织匀浆与合成荧光基板反应, 并对由 PLC 活动引起的荧光进行量化, 并对脑区进行比较。我们还描述了我们对某些药物对 PLC 活动的抑制作用的评估, 使用相同的系统。虽然该系统可能受到其他内源荧光化合物和/或测定成分和组织的吸收, 使用该系统的 PLC 活动的测量比使用传统的检测更安全和容易, 这需要核素基板。通过简单的程序和操作, 我们可以检查在不同社会任务中参与的蜜蜂大脑和其他组织中的 PLC 活动。

欧洲蜜蜂 (api 蜜蜂L) 是一种群居昆虫, 雌性蜜蜂显示种姓依赖的生殖和年龄依赖性的分工。例如, 在被称为 "工人" 的蜜蜂的无菌种姓中, 年轻的个体喂养巢, 而年长的人则在蜂巢¹外觅食花蜜和花粉。学习和记忆能力在蜜蜂的生命中至关重要, 因为觅食必须反复往返于食物来源和巢穴之间, 然后通过舞蹈将好的食物来源的位置传达给他们的 nestmates。通信¹。以前的研究表明, MB, 一个更高的大脑中心, 昆虫, 参与的学习和记忆能力的蜜蜂^2,3,4。不同的表达基因和蛋白质已经在蜜蜂的各个脑区被发现^{5,6,7,8,9,10 ,11}, 表明它们与每个脑区的独特功能有关。虽然药物的药理抑制或活化蛋白的兴趣是一个良好的方法来揭示蛋白质的功能在蜜蜂行为^12,13,14, 它是未知的是否所有药物在蜜蜂大脑的不同区域有功能效应。这种药物的功能验证将加强行为药理学研究的结论。

在这里, 我们专注于 PLC, 其中一项涉及老鼠认知的酶^15,16,17,18。PLC 通过将磷酸肌醇 45-bisphosphate (PIP₂) 降解为肌醇14、5-trisphosphate (IP₃) 和甘油 (达格·哈马舍尔德)^19、20、21, 从而触发钙信号。ip₃在内质网 (er) 上打开 ip₃受体, 导致钙离子从 ER 中释放出来。释放钙激活钙/钙调素依赖性蛋白激酶 II (CaMKII) 与钙调素和蛋白激酶 C (PKC) 在存在的达格·哈马舍尔德。两种蛋白激酶都参与学习和记忆^22,23, 符合 PLC 参与这个过程。PLCs 分为子类型, 包括 PLCβ、PLCγ和 PLCε, 其结构为²⁰。每个 PLC 子类型在不同的上下文²⁰中激活, 编码这些亚型的基因在不同的组织中表现出差异。我们以前证明, 蜜蜂 MBs 表达基因编码 PLCβ和 PLCε亚型在较高的水平比其余的大脑区域²⁴, 和两个 pan-PLC 抑制剂 (edelfosine 和新霉素硫酸 [新霉素]) 降低 plc 活动不同的大脑区域, 事实上, 影响蜜蜂的学习和记忆能力²⁴。

传统上, PLC 的酶活性已被测量使用核素 PIP₂²⁵, 这需要适当的培训, 设备和设施。目前, 已建立了 plc 的合成荧光基板²⁶, 便于对标准实验室的 plc 活动进行评估。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以检测在不同的大脑区域的蜜蜂使用荧光基质, 并随后测试 edelfosine 和新霉素对 plc 在这些组织的抑制效应。因为该协议只需要基本的操作, 它可能适用于对不同的社会任务分配给蜜蜂的其他组织或脑区的 PLC 活动的研究。

1. 捕食蜜蜂的捕获

1. 从当地经销商那里购买蜜蜂殖民地。
2. 使用昆虫网, 捕捉只觅食蚂蚁蜜蜂返回蜂巢与花粉袋在他们的后腿。将蜜蜂转移到标准的50毫升塑料锥形管上, 并盖上管 (图 1)。把管子放在冰上麻醉蜜蜂。
   注: 为养蜂人佩戴指定的夹克以避免蜂蜇。哺乳蜜蜂也可以根据实验收集。为了捉到护士蜜蜂, 观察蜜蜂在蜡梳上的行为, 抓住护士蜂, 用镊子将他们的头戳进育雏细胞喂养幼虫, 由机翼或胸腔。然后, 把蜜蜂放进一个50毫升的塑料管里, 把管子盖上, 放在冰上, 如步骤1.2 所述。
3. 随机捕获12觅食。
   注: 本协议每批次使用两只蜜蜂, 造成六多种。多只蜜蜂可以被捕获在一个管, 和蜜蜂的数量在一个单一的管是不重要的, 因为蜜蜂在每一个批次以后组合 (见步骤 3.1.1)。夏天要保持管子凉爽, 因为管子里的高温会伤害蜜蜂。

2. 蜜蜂脑的解剖

1. 在实验室里, 将50毫升的管子放在冰上, 至少30分钟⁶麻醉蜜蜂。
2. 要准备解剖阶段, 将一块牙科蜡对折 (产生的大小约为 3.5 x 7.5 厘米), 并将其推入塑料盘 (60 x 15 毫米)。
   注: 折叠蜡牢固地持有昆虫别针。
3. 在双目显微镜下, 用镊子将蜜蜂的头部从其身体中分离出来, 通过在每个天线的底部插入昆虫别针, 将头部的前部固定在牙齿蜡上 (图 2a)。
   注: 使用前应先清洗镊子, 使用乙醇或灭菌水。
4. 倒入足够的盐水溶液 (0.13 摩尔/升氯化钠, 5 毫摩尔/升氯化钾, 1 毫摩尔/升 CaCl₂-2H₂O) 的头部, 以覆盖它。如果头部漂浮在溶液中, 用针脚再次刺穿头部。如有必要, 使用冷盐水溶液。
   注意: 然而, 这个协议的工作没有冷盐水解决方案。
5. 使用镊子去除天线 (图 2B)。
6. 用手术刀在触角的基座附近进行水平切割, 并纵向在复合眼睛的边界处。然后, 在头部的顶端进行水平切口。取下角质层, 在大脑上打开一个窗口 (图 2C)。
   注: 如有必要, 在使用前用乙醇或灭菌水冲洗手术刀。
7. 使用镊子 (图 2D) 从大脑前表面的单眼和气管中取出视网膜。
8. 使用手术刀 (图 2E) 在复合眼睛背和腹部的边框上展开切口。接下来, 通过在眼睛角质层下直接插入镊子 (图 2F), 去除复合眼睛和视网膜的角质层之间的结缔组织。
9. 丢弃复合眼睛的角质层。用镊子摘下复合眼视网膜的背尖, 将镊子移到腹侧方向, 仔细剥离视网膜 (图 2G)。
10. 用镊子小心地去除大脑前表面的剩余气管 (图 2H)。
11. 用镊子切开大脑和组织周围的结缔组织, 并从头部囊中解剖大脑 (图 2H)。
12. 使用镊子 (图 2) 剥去大脑后表面的气管。
13. 使用手术刀, 切断 mbs 与垂直裂片旁边的其他大脑区域之间的连接, 这是 mbs 的一部分 (图 2J)。
14. 将被解剖的 MBs 和剩余的脑组织放入1.5 毫升管中, 用干冰或液氮快速冷冻它们 (图 2K)。将冷冻组织保存在-80 摄氏度, 直到使用。
    注: 用指定的手套和通风处理液氮, 避免冷烧伤和窒息。干冰也应该用手套小心处理。协议可以在这里暂停。脑组织的解剖和贮存应同时进行一只蜜蜂, 以避免蛋白质的降解。

3. 脑组织匀浆的制备

1. 添加10µL 均匀缓冲, 包括50毫摩尔/升 HEPES (pH 7.2), 70 毫摩尔/升氯化钾, 1.0 毫摩尔/升 CaCl₂到冷冻脑组织和融汇的组织在1.5 毫升管通过手动施加压力与塑料杵。中风组织至少200x。
   注: 执行冰上3节所描述的操作。在管中使用杵管, 以充分粉碎组织, 这很容易漂浮在均匀缓冲。
   1. 将匀质组织溶液转移到该地段的下一组织, 并以同样的方式融汇组织。
      注意: 在这个步骤中, 每个批次中的蜜蜂组合在一起。该协议使用六个批次。
2. 添加30µL 的均匀化缓冲区。
3. 离心机的匀质组织样品在大约 900 x g²⁷和4°c 10 分钟。
4. 转移上清到一个新的1.5 毫升管和离心机再次为20分钟在大约 9500 x g²⁷和4°c。
5. 将上清在一个新的1.5 毫升管。将匀浆保存在-20 摄氏度, 直到使用。
   注意: 协议可以在这里暂停。
6. 使用二辛可宁酸测定法测定蛋白质浓度。
   1. 稀释2.5 µL 的匀浆与17.5 µL 的消毒水 (从而稀释的匀浆八) 和使用所有稀释匀浆。
      注: 使用微进行匀浆, 必须小心, 因为它的高粘度。
   2. 使用 0, 0.1, 0.2, 0.4, 1.0, 2.0 毫克/毫升的牛血清白蛋白 (BSA) 在20µL 作为标准进行。
      注: 根据所需的匀浆量和标准样品, 改变所需要的合格品测定的规模。协议可以在这里暂停。

4. PLC 在脑组织匀浆中的反应

1. 准备 WH-15²⁶溶解在灭菌水中的荧光基板的库存溶液, 并将其存储在-80 摄氏度。
   注: 用箔覆盖含有衬底的溶液以防止褪色。
2. 在所需体积内制备反应 premixture, 在反应混合物的10µL 中达到以下成分:50 毫摩尔/升 HEPES (pH 7.2), 70 毫摩尔/升氯化钾, 1.0 毫摩尔/升 CaCl₂, 2.0 毫摩尔/升 dithiothreitol, 50 毫克/升 BSA, 12.5 µmol/升 WH-15。
3. 如果需要, 稀释匀浆和均匀缓冲。
4. 在聚合酶链反应 (PCR) 管中混合含有1.3 µg 蛋白质的反应 premixture 和匀浆, 以达到10µL 的反应混合物的最终体积。
   1. 为统计分析准备两种类型的控制混合物: 将匀浆但不 WH-15 成混合物 (控制混合物 1),反之亦然(控制混合物 2)。
      注: 在冰上准备反应混合物和控制混合物, 以防止蛋白质降解和 PLC 的反应。控制混合物1和2是用来检测荧光从匀浆和自由基板, 分别。
5. 冲洗管和孵化它在热循环仪30分钟, 在25摄氏度。
6. 通过添加2µL 25 毫摩尔乙二醇双 (β-aminoethylether)-n, n, n ', 四乙酸四酸, 停止反应。
   注: 适当的蛋白质含量和反应时间在实验中有所不同。因此, 为了优化反应条件, 可能需要重复步骤 4.1-5.3 在初步实验中描述的过程, 改变蛋白质数量和孵化时间, 直到荧光增加线性。为参考, 当使用从其他脑子区域提取的匀浆时, 反应通常在30分钟内线性地与1.3 µg 或较少蛋白质, 但线性减少要么与至少2.7 µg 蛋白质或以潜伏期的90分钟或 longer。

5. 由 PLC 活动引起的荧光检测

1. 离心反应混合物和控制混合物为5分钟在大约 310 x g²⁸和转移10µL 的上清到不同的井在384井微板块适用于荧光检测。
   注: 为了防止褪色和灰尘污染, 盖板与箔。
2. 用离心机冲洗微板块微板块。
3. 将该板块设置成一个微板块的阅读器, 用一组技术检测荧光。
   注: 激发和发射波长分别为 344 nm 和 530 nm。如果适用 (根据微板块读取器), 在每次检测前混合样品混合物5秒。协议可以在这里停止。

6. 药理制剂抑菌作用试验

1. 在适当的浓度下准备 edelfosine 和新霉素的库存解决方案, 并储存到使用: edelfosine 5.0 毫摩尔/升和-20 °c;新霉素在550毫摩尔/升和4摄氏度。
2. 当准备反应 premixture 如步骤4.2 所述, 添加抑制剂到 premixture, 以达到适当的最终浓度: edelfosine, 1.0 毫摩尔/升;新霉素, 0.55 毫摩尔/升。
3. 添加匀浆到反应 premixture 和适当的控制混合物如步骤4.4。
   1. 准备三种类型的控制混合物: 把匀浆剂和抑制剂, 而不是基质进入控制混合物 1;添加基质和抑制剂, 而不是匀浆成控制混合物 2;并把抑制剂, 但不是匀浆或基质进入控制混合物3。
4. 执行步骤 4.5-5.3 中描述的 PLC 反应和荧光检测。

7. 统计分析

1. 对于使用4节中描述的混合物检测 plc 活动, 通过减去匀浆或自由基板上的荧光, 计算出由 plc 与基体反应产生的荧光。
   
   fl (PLC 活动) = fl (反应组合)-{fl (ctrl 1) + fl (ctrl 2)}
   
   注: fl (PLC 活动)、fl (反应混合)、fl (ctrl 1) 和 fl (ctrl 2) 表示从 PLC 活动中提取的善意荧光, 反应混合物中检测到的荧光, 分别控制混合物1和2。
   1. 在测量了混合物中的荧光, 如步骤 4.1-5.3 中所述, 根据步骤7.1 中的方程式计算 fl (plc 活动), 然后按照每种匀浆技术的平均 Fl (plc 活动)。
   2. 利用步进7.1.1 获得的三项技术的平均 fl (plc 活性), 再次计算了 MBs 和其他脑区生物复制的平均 fl (plc 活性), 并比较了脑组织之间的价值。
2. 对于在使用6节所述的混合物抑制剂的情况下对 PLC 活动的检查, 计算从匀浆、基质和抑制剂中的反应产生的荧光, 如下所示。
   
   fl (PLC 活性与抑制剂) = fl (反应混合)-{fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} + fl (ctrl 3)
   
   注: 在这里, Fl (plc 活性与抑制剂) 是真正的荧光产生的 plc 活动的存在的抑制剂。fl (反应混合), fl (ctrl 1), fl (ctrl 2) 和 fl (ctrl 3) 是在反应混合物中检测到的荧光信号, 控制混合物 1, 控制混合物 2, 并分别控制混合物3。
   1. 在测量的混合物中的荧光, 如步骤 6.1-6.4 所述, 计算 Fl (PLC 活性与抑制剂) 根据方程在步骤7.2。然后, 对每种匀浆进行技术上的平均 Fl (PLC 活性与抑制剂)。
   2. 利用步进7.2.1 计算的平均值, 计算出各脑组织的生物复制的平均 Fl (PLC 活性与抑制剂)。比较了7.1.2 在各脑组织中的作用 (plc 活性与抑制剂) 和 fl (plc 活性)。

脑组织匀浆中的蛋白质浓度:
我们准备用只觅食蚂蚁蜜蜂组织匀浆。在原组织匀浆中计算出的蛋白质浓度如图 3所示。原始匀浆中的近似蛋白质浓度如下: 1.5 毫克/毫升在 MBs 和2.3 毫克/毫升在其他脑区。我们用了两只蜜蜂, 并分析了六多。

脑组织匀浆中 PLC 活动的检测:
在实验中, 我们发现其他脑区的荧光比 MBs 高。因此, 我们重复使用其他脑区匀浆的初步实验, 确定反应时间 (即30 分钟) 和蛋白质量 (即1.3 µg)。在这些条件下反应的结果如图 4所示。含有组织匀浆和荧光衬底的反应混合物比含有组织匀浆或荧光基质的控制混合物显示 > 4.2 倍以上的荧光, 表明 PLC 活性是在反应混合物中检测到的。相对荧光在其他脑区比 MBs 高约3.4 倍 (图 4B)。

药理作用对 PLC 活性的抑制作用分析:
为了研究 pan-PLC 抑制剂 edelfosine 和新霉素对 plc 活性的影响, 我们在1.0 毫摩尔/升 edelfosine 或0.55 毫摩尔/升新霉素的情况下进行了反应, 使用了上述的匀浆。在 edelfosine 的存在下, 与无 edelfosine 的对照组相比, MBs 和其他脑区的荧光水平降低到大约6.0% 和 5.4% (图 4C)。新霉素治疗降低了44% 和20% 的荧光水平, 在 MBs 和其他脑区的未经治疗的控制 (图 4D)。

图 1: 捕捉只觅食蚂蚁蜜蜂.一个只觅食蚂蚁回到她的蜂巢被捕获在昆虫网, 她被限制在一个50毫升塑料圆锥管。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 解剖过程的示意图表示法.(A) 显示了议定书中提到的蜜蜂大脑的轴线。从头部到胸前的蜜蜂从侧面看。(B K)显示了解剖程序的照片和插图。有关详细信息, 请参阅正文。只显示蜜蜂的头。省略了气管的插图。MBs = 蘑菇身体。刻度条对应于1毫米.请点击这里查看这个数字的大版本.

图 3: 脑组织组织匀浆中的蛋白质浓度.用免疫分析法测定了原组织匀浆中的蛋白质浓度, 并进行了计算。显示标准偏差的平均浓度。两个只觅食蚂蚁蜂被用于每一个批次, 并分析了六个。MBs = 蘑菇身体。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: 反应中检测到荧光.(A) 本小组在每个组织中都显示有或没有荧光基底的荧光。用1.3 µg 蛋白进行了30分钟的反应。荧光是由微板块读取器测量的。样品井的值由空井改正, 以任意单位显示 (澳大利亚)。(B) 本小组显示脑组织之间的荧光比较。在 A 组中的数据通过减法对控制混合物进行了校正, 并由 MBs 中的计算荧光归一化. * P < 0.005, 曼-惠特尼的 U 测试。c和d面板在 (c) 1.0 毫摩尔 edelfosine 和 (D) 0.55 毫摩尔新霉素的存在下显示相对荧光。分析了在A和B板中使用的相同组织匀浆。对照试验结果对各组织的荧光值进行了规范化, 无药物治疗。C面板中控制反应的数据与面板B中的结果相同。在面板D中, 对所有组织匀浆进行了不同的实验分析。显示标准偏差的平均荧光值。两只蜜蜂被用于每一个批次, 并分析了六多种。* P < 0.05, 魏氏签定等级测试。无汞 = 控制混合物不含匀浆;MBs = 蘑菇身体。小组B D被修改了从 Suenami等。²⁴与出版商的许可。请单击此处查看此图的较大版本.

蛋白质活性的生化检验对于理解大脑中的分子信号是非常重要的, 因为酶的活性受各种分子 (如基质和抑制剂) 的影响, 因此可以随动物行为 (例如, 学习和记忆)⁵。在蜜蜂研究中, 据报道, 在不同的脑区, 基于循环安培依赖性蛋白激酶 A、循环 GMP 依赖性蛋白激酶、PKC、磷酸化 CaMKII 和腺苷酸酶的酶有差异表达。免疫组化^{5,10,29,30,31}。然而, 大脑区域内酶活性的差异仅有部分报告为⁶。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 以检测 PLC 的活动和评估药物抑制剂在 MBs 和其他大脑区域的抑制作用。

有可能的因素干扰荧光检测。首先, 在进行生化化验时, 保护蛋白质不被降解是很重要的。在这里描述的协议中, 需要快速解剖和冻结大脑。建议在每一个解剖周期后, 组织样品被冷冻和储存。减少匀浆的解冻/冷冻循环对防止蛋白质的变质也至关重要。

除蛋白质降解外, 反应混合物中的背景荧光和吸光度可能会影响该检测系统的结果, 因为通过荧光信号检测到 PLC 的活性。例如, 溶解在水中的新霉素有一种黄色的颜色, 影响荧光检测。虽然我们使用了0.55 毫摩尔新霉素, 1000 倍稀释的库存解决方案, 进一步优化的浓度可能需要。此外, 其他组织的污染也可能影响结果。视网膜, 它检测视觉刺激和含有色素, 包括一种组织类型, 可能干扰的化验。

通过本协议, 我们发现其他脑区的 PLC 活动比 MBs²⁴更高。这与定量反转录 PCR 分析结果不一致, 表明 MBs 表达的 PLC 基因比其他脑组织高²⁴。这一矛盾可能是由于 WH-15, 这是一个自由浮动的基质²⁶, 和事实, 我们没有区分的细胞膜和胞浆部分的大脑组织匀浆。考虑到 PLCβ和 PLCε是膜相关酶³² , 可与内源性 PIP₂基板相互作用, 匀浆中膜的含量可能影响 PLC 与 WH-15 的反应。另一个可能的解释是, 由于蛋白质生产和/或降解率的差异, 在其他大脑区域, PLC 浓度可能高于 MBs。因此, 在大脑中的真正的 PLC 活动必须进一步澄清通过额外的实验, 如使用最近报告的新基质纳入膜³³, 分析的活动, 膜相关和胞浆PLCs 分开, 或量化的内容, PLCs 或 PIP₂在每个脑组织。

考虑到以上几点, 本文所描述的 plc 检测系统可以扩展到不同组织的 plc 活性测量, 如消化道、肌肉和生殖器官。还可以比较只觅食蚂蚁和护蜂大脑之间的 plc 活动, 以评估 plc 活动在不同社会角色中的参与程度。

总的来说, 这里提出的检测系统是一个可行的选择, 以检查 PLC 活动的组织组织匀浆, 因为它可以执行标准的实验室设备, 而传统的方法使用核素 PIP₂需要专门放射性同位素的设施、训练和设备。利用这个系统进行进一步的修改, 将加深我们对蜜蜂复杂行为的分子机制的理解。

作者没有什么可透露的。

图 4B - 4D从 Suenami等修改。²⁴以生物开放的允许。作者感谢出版商的许可。这项工作得到了人类前沿科学计划 (RGY0077/2016) 的支持, 索塔 Suenami 和宫崎骏。