Vitro Osteoclastogenesis üzerinde doğal uranyum etkileri analiz yöntemleri

Uranyum kemik metabolizması etkilediği bilinmektedir. Burada, doğal uranyum pozlama etkisini canlılığı, farklılaşma ve Osteoklastlar, kemik rezorpsiyonu sorumlu hücrelerin fonksiyonlarını araştıran amaçlı bir iletişim kuralı mevcut.

Uranyum kemik fizyolojisi ile müdahale için gösterilmiştir ve de bu metal kemik içinde birikir kuruldu. Ancak, az kemik hücreleri davranışını doğal uranyum etkisi hakkında bilinir. Özellikle, uranyum Osteoklastlar, kemik matrisi rezorpsiyonu için sorumlu hücreler üzerinde etkisini belgelenmemiştir. Bu sorunu araştırmaya, uranyl asetat bir kaynak doğal uranyum ve fare ham 264.7 hücre satırı Osteoklast öncüleri bir model olarak kullanarak yeni bir protokol kurduk. Burada, uranyum sitotoksisite Osteoklast öncüleri üzerinde test etmek ve etkisini osteoclastogenesis ve olgun Osteoklastlar resorbing işlevini değerlendirmek için gerekli bütün testleri ayrıntılı. Koşullar biz geliştirdik, özellikle uranyl içeren kültür medya hazırlanması ve ham 264.7 tohum hücreleri güvenilir ve yüksek üreme sonuçları elde etmek için izin vermek. Ayrıca, Osteoklastlar boyutunu veya resorbed matris yüzdesi gibi çeşitli parametrelerin analiz kolaylaştırmak için yazılım araçları kullanımı optimize.

Uranyum doğal olarak meydana gelen radyoaktif element toprak, hava ve su mevcut olduğunu; Bu nedenle, insan ve hayvanlar doğal uranyum besinlerinde maruz kalır. Doğal kaynaklara ek olarak, uranyum antropojenik aktiviteler hangi ortamda onun bereket artar kaynaklanır. Uranyum kimyasal ve radyolojik tehlike teşkil etmektedir. (Bu bir izotopik karışımı içeren %99.27 ²³⁸U, %0,72 ²³⁵U ve %0,006 ²³⁴U) doğal uranyum düşük özel etkinlik (25.10³ Bq.g^-1) olduğundan, ancak, sağlık üzerinde etkileri atfedilir onun kimyasal toksisitesi.

Ne olursa olsun onun giriş rota (inhalasyon, yenmesi veya dermal pozlama), çoğu uranyum, vücut girerek dışkı ile atılır ve yalnızca küçük bir bölümü sistemik dolaşım ulaşır. Uranyum kan yaklaşık % 67 sırayla böbrekler tarafından süzülür ve vücut idrar 24 h¹içinde bırakır. Geri kalan, çoğunlukla böbrek ve kemikler, iki ana hedef organlar uranyum toksisite^2,3,4yatırılır. İskelet uranyum uzun süreli saklama^2,3,4,5,6birincil site belirlenmiştir çünkü çeşitli çalışmalar keşfetmek için yapılmıştır kemik Fizyoloji⁷uranyum etkisi.

Ömrü sürekli remodeled mineralized doku kemiktir. Kemik remodeling özel hücre tipleri üzerinde bağlıdır ve çoğunlukla iki aşamadan oluşmaktadır karmaşık bir süreç olduğunu: rezorpsiyonu önceden varolan eski Matrix Osteoklastlar tarafından takip de novo kemik İnşaat tarafından dokusunu tarafından. Osteoklastlar nerede onlar⁸kemik eklemek rezorpsiyonu sitelere göç öncül hücreleri hematopoetik kökenli füzyonu kaynaklanan büyük multinuclear hücrelerdir. Kendi eki aynı anda onların sitoiskeleti⁹kapsamlı bir yeniden yapılanma ile oluşur. Bu yeniden yapılanma içine Osteoklast salgılar proton, hidroksiapatit ve proteaz bozulması dahil dağılmasına yol açan kemik yüzeyi arasındaki hücre izole bir bölme kurulması için gereklidir Organik matris. Ortaya çıkan bozulma ürünleri endocytosed, membran alanı kemik yüzeyine ters hücreye aracılığıyla taşınan ve salgılanan, transcytosis^10,11adı verilen bir işlem.

Vivo ve in vitro çalışmalar sonuçları uranyum kemik oluşumunu engeller ve numarayı ve etkinlik dokusunu^7,12değiştirir gösterir. Buna ek olarak, kemik rezorpsiyonu ve Osteoklastlar uranyum etkileri kötü araştırılmalıdır. Çeşitli in vivo çalışmalarda kemik rezorpsiyonu bir donanım, fare ya da sıçan^13,14uranyl nitrat yönetimi sonra bildirdin. Ayrıca, bir epidemiyolojik araştırma uranyum alımı içme suyu ile artış erkekler¹⁵kemik rezorpsiyonu işaretleyicisinde serum düzeyinde bir artış ile ilişkili olma eğilimi önerdi. Birlikte ele alındığında, bu bulgular kemik içinde biriken uranyum kemik rezorpsiyonu teşvik verebilecek sonuca yol açtı. Ancak, hücresel mekanizmaları uranyum bu potansiyel etkisi içinde yer alan bir açık soru kalır. Bu nedenle, uranyum kemik hücreleri resorbing davranışı üzerinde etkisini incelemeye karar verdik.

Burada, biz biz kurduk Protokolü tarif karakterize ve doğal uranyum etkileri öncesi Osteoklastlar canlılığı, Osteoklastlar farklılaşma ve resorptive etkinliği ölçmek için. Hangi kolayca ne zaman 4 veya 5 gün boyunca sitokin RANKL huzurunda kültürlü Osteoklastlar içine ayırt edebilir ve hangi klasik incelemek için kullanılır ham 264.7 fare dönüştürülmüş makrofaj hücre satırıyla, burada açıklanan deneyler yapmış Osteoklast¹⁶farklılaşma ve işlev. Geliştirilen yordamlar güvenilir, vermek son derece tekrarlanabilir sonuçlar ve are için birincil Osteoklastlar tam olarak uygulanabilir. Tüm bu nedenlerden dolayı bu metodoloji moleküler mekanizmaları kemik uranyum toksisite dahil daha iyi anlaşılmasını almak için yararlı olduğunu düşünüyoruz. Ayrıca, bu yaklaşım yeni uranyum şelat ajanlar tanımlamak için bir tarama aracı olarak adapte olabileceğini düşünüyorum.

1. Uranyl asetat çözüm hazırlanması

1. Uranyl asetat (UO₂(OCOCH₃)₂, 2 H₂O; 85 mg 2 mL 100 mM uranyl asetat çözeltisi hazırlamak için Ekle M 424 g.mol^-1=) 5 mL plastik tüp için sağlam durumda.
2. Plastik tüp 2 mL distile su ekleyin ve plastik bir tıpa ile uygun.
3. Tüp katı toplam dağılmasına kadar şiddetle çalkalanır. Çözüm 24 h için buzdolabına koyun.
   Dikkat: Uranyl [U(VI)] manipülasyonu bazı kimyasal ve radyolojik tehlike sunar. Tüm örneklerini hazırlanan ve belirli laboratuarlarında özel ekipman ile karakterize. Tüm U VI içeren sıvılar ve özel olarak atanan atık kaplarda toplanan olmalıdır zehirli atık bertaraf. Kuru atık (pipets, tüpler, vb) 0.1 N HNO₃ çözüm ile solubilize ve U(VI) kaldırmak yıkanmış.
4. Bir elektrot ve pH-metre kullanarak çözüm pH doğrulayın.
   Not: Elektrot daha önce ticari tampon çözeltiler kullanarak ayarlanması (pH = 4 ve pH = 7).

2. ham 264.7 hücre kültürü

1. Bakım hücre.
   1. 75 cm² şişeler aşağıdaki büyüme orta ham 264.7 hücreler (ATCC, TIB-71) yetiştirmek: Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) %5 Fetal sığır Serum ve antibiyotik ile desteklenmiş: 100 IU/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin. Kuluçka 37 ° c, % 5 CO₂hücreleri korumak.
   2. Orta 2-3 günde değiştirin. Hücreleri % 85-90 birleşmesi olduğunuzda, mekanik bir hücre kazıyıcı (ATCC tarafından önerilen gibi) kullanarak kültür şişeye onları kaldırmak ve 1:6 oranında bölüp.
      Not: yalnızca hücreleri pasajlar 3 ile 10 arasındaki farklılaşma denemeleri için kullanılır.
2. Deneyler için hücreleri hazırlanması
   1. Yukarıda açıklandığı gibi şişesi substrat hücrelerden çıkarmak ve steril 50 mL tüp aktarabilirsiniz. Hücreleri yukarı ve aşağı kümeleri kırmaya pipetting tarafından karıştırın. Bir hemasitometre ile Sayın. 75 cm² şişe başına 35-40 milyon hücre bekliyoruz.
   2. Birim hücre süspansiyon her deneme için gerekli, aşağıdaki gibi hesaplar:
      Deneysel sayısı x 3 (triplicates) x 1 mL/iyi + 3-4 mL (pipetting zararları) koşulları.
      Not: Bu protokol için açıklanan tüm deneyleri için yoğunluğu tohum 5000 hücre/cm²' dir. Bu nedenle, bir 24-şey plaka orta 1 mL bir kuyu başına 10.000 hücre anlamına gelir, ve hücre süspansiyon böylece 10.000 hücre/mL yoğunluğudur.
   3. Gerekli hacmi 10.000 hücre/mL hücre süspansiyon hazırlamak ve hücreleri 24-şey kalıplara temel olarak belirler. Sitotoksisite deneyleri için normal büyüme aracı kullanın. Farklılaşma ve rezorpsiyonu deneyleri için en az gerekli orta (2 mM L-glutamin, 5 ile desteklenmiş αMEM) kullanım Alfa değiştiren % FBS ve GST-RANKL¹⁷50 ng/mL.
      Not: GST-RANKL şirket içinde üretilen protein herhangi bir ticari olarak mevcut RANKL sitokin tarafından değiştirilebilir. Yeni bir RANKL toplu işlemi ile çalışırken, 20 ila 150 ng/mL aralığında değişen RANKL konsantrasyon ile bir doz yanıt deney yaparak osteoclastogenesis inducing etkinliğini test etmek yararlı olabilir.

3. Kültür orta 100 mM Uranyl asetat çözümde seyreltme

Not: Uranyl iyonu [U(VI)] kültür orta onun hücresel toksisite^18,19,20,21değiştirebilir orta diğer bileşenleri ile birden fazla kompleksler oluşturur. Bu nedenle, uranyl içeren medya altercations atlama veya denge adımları kısaltmak hazırlanmalıdır.

1. Pozlama konsantrasyonları uranyl seçti ve kültür (her koşul nüsha gerçekleştirilir dikkate alarak) deney için gerekli ortam birimleri hesaplamak.
2. Steril hücre kültüründen başlayarak test % 7.5 sodyum bikarbonat sulu çözüm ([HCO₃^-] = 893 mM), 100 mM HCO₃^- çözüm su hazırlamak ve buz üzerinde sakin ol.
3. Damla damla 1 birim uranyl asetat 100 mM hisse senedi çözüm buz gibi 100 mM HCO₃^- çözüm, hafifçe sallayarak karıştırma tüp 9 birimleri için ekleyin. Bu işlem uranyl asetat hisse senedi çözüm seyreltik ([UO₂^{2 +}] = 100 mM, pH 4) 10 mm ve pH 7'ye getir.
4. Buz gibi 100 mM HCO₃^- çözüm denetimi hazırlamak için hizmet edecek 90 mM HCO₃^- (HCO₃^- konsantrasyonu 10 mM uranyl çözümünde eşit), ulaşmak için 9 birimlerine steril su 1 birim ekleme Orta.
5. Denge için (RT) oda sıcaklığında 3 h için durmak hazırlanan çözümleri sağlar.
6. Bu arada, temel pozlama orta hazırlamak: 2 mM L-glutamin ve % 5 ile αMEM FBS.
   Not: farklılaşma ve rezorpsiyonu deneyleri için temel pozlama orta GST-RANKL 50 ng/mL ekleyin.
7. 3 saat sonra uygun miktarda 10 mM uranyl çözüm konsantrasyonları çalışma istenilen uranyl elde etmek için pozlama ortamda damla damla seyreltik. Aynı anda kontrol orta pozlama orta en yoğun uranyl tedavi durumda kullanılan bikarbonat miktarının ekleyerek hazırlayın.
8. Denge için RT, 3 h için durmak hazırlanan medya izin.
9. Kuyulardan büyüme ortamını çıkarın ve denetimi ve uranyl içeren medya ile değiştirin.

4. analiz ham 264.7 öncüleri canlılık U(VI) (ÇMT sitotoksik deneyleri) huzurunda

Dikkat: Her iki MTT ve DMSO cilt neden ve tahriş göz. Eldiven ve göz koruma onları ele alırken giymek. Atık ürünler özel olarak atanan atık konteyner içinde toplamak.

1. Uygun bir miktar 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromür (MTT) toz içinde 5 mg/mL, 10 x hisse senedi çözüm elde etmek için PBS çözülür. 0,22 µm filtrenin filtrasyon tarafından sterilize ve aliquots-20 ° C'de depolayın
2. 24-şey plakaları (deneysel koşul plaka başına başına 3 Kuyu) plaka hücreleri. Spektrofotometre bulunmasını içeren sorulardan plaka başına 3 boş wells rezerve etmek unutmayın.
3. 22-24 h önce hücreleri eklemek bildirmek için uranyum pozlama için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
4. Uranyl içeren medya madde 3 te açıklandığı şekilde hazırlayın.
5. Uranyl ile içeren hücre numaralı seribaşı plakaları büyüme orta yerine medya. 24 saat kuluçkaya.
6. 1 x MTT çözüm gerekli hacmi aşağıdaki gibi hesaplar:
   (Deneysel koşullar + boşluk sayısı) x 3 (triplicates) x 0.4 mL/iyi + % 10 birim pipetting kayıplar için.
7. 1 x MTT çözüm gerekli hacmi 10 x hisse senedi MTT çözüm içinde kartal'ın en az gerekli orta (EMEM) fenol red olmadan sulandrarak hazırlayın.
   Not: başarılı bir Renkölçer tahlil için MTT ışıktan korunmalıdır. Bu arka plan sinyal sınırlamak için MTT EMEM içine DMEM ziyade sulandırmak için tavsiye edilir.
8. Kuyulardan uranyl içeren medyayı çıkarın, PBS ile yıka ve 400 µL MTT çözüm (3 boş kuyular için boşluklar da dahil olmak üzere) her şey ekleyin. Karanlıkta 37 ° C'de 2,5 h kuluçkaya. Mikroskop altında koyu mor formazan kristalleri hücrelerin içinde oluşmuş doğrulayın.
9. MTT çözüm atın ve dimetil sülfoksit iyi (DMSO) 220 µL ekleyin. Tabak gelen ışık onları korumak ve yavaşça formazan kristalleri çözülmeye 10 dakikadır kışkırtmak alüminyum folyo şal.
10. Mikroplaka Spektrometre okuyucu 570, optik yoğunluk (OD) belirlemek için kullanın nm (formazan özel) ve 690 nm (arka plan). Her şey için olası belirsiz OD değer dalgalanma nedeniyle çizik veya bulanıklık²²için ayarlamak için 570 nm OD dan 690 nm OD çıkarma.
11. Her şey için boş düzeltilmiş OD önceki adımda elde OD dan boş demek OD çıkararak hesaplar. Demek OD değeri deneysel her koşul için belirleyin.
12. Ayarla denetim durumu kötü OD ([UO₂^{2 +}] = 0 mM) için % 100 canlılık ve hücre canlılığı diğer test uranyl konsantrasyonları için karşılık gelen yüzdesini hesaplamak. Bir doz-yanıt eğrisi çizmek. Sitotoksisite dizin 50 (CI₅₀), uranyl konsantrasyonu % 50 hücre ölümüne 24 h maruz kaldıktan sonra lider olarak tanımlanan değerlendirin.

5. analiz U(VI) huzurunda Osteoklast farklılaşma

1. HAM 264.7 farklılaşma hücreleri uranyl ve tuzak varlığında (tartarat-dayanıklı asit fosfataz) boyama.
   1. Plaka ham 264.7 hücreleri deneysel koşul başına 3 Kuyu 24-şey tabakta. Yaklaşık 6 h, 37 ° C'de kuluçkaya hazırlamak ve uranyl içeren pozlama medya equilibrate vakti.
   2. Farklılaşma medya bölümünde 3 (GST-RANKL ortamına Ekle unutmayın) açıklandığı gibi istenen uranyl konsantrasyonları ile hazırlayın.
   3. Yavaşça uranyl içeren ile Wells temel orta yerine orta. Bu gün mediatörlerin farklılaşma günü 0 olarak kabul edilir.
   4. Orta günde 2 veya 3 mediatörlerin farklılaşma 5.1.2 ve 5.1.3 adımları yineleyerek değiştirin. Multinucleated Osteoklastlar 3 ve 4 gün arasında görünmelidir.
   5. TUZAK üreticinin yönergeleri izleyerek ticari olarak mevcut lökosit asit fosfataz kiti ile boyama gerçekleştirmek.
      Not: tartarat-asit fosfataz 5, tartarat dayanıklı (ACP5) olarak da adlandırılan dayanıklı asit fosfataz (tuzak) son derece olgun Osteoklastlar dile getirdi ve yoğun Osteoklast farklılaşma avans olarak kullanılan. Bu nedenle, tuzak boyama Osteoklastlar görselleştirmek için gerçekleştirilir. Deneysel koşullar ve osteoclastogenesis hızına bağlı olarak, 4 gün veya gün 5 farklılaşma süreci üzerinde yapılabilir.
   6. TUZAK lekeli wells (onlar 3 veya 4 hafta kadar bu koşullarda muhafaza edilebilir) daha fazla çözümleme için 4 ° C'de PBS içinde tutun.
2. Osteoklast boyutu/Morfoloji analizi.
   1. Her şey bütün yüzeyi görüntüsünü elde etmek. Resmin çözünürlüğünü hücre çekirdeği ayırt etmek için yeterli olmalıdır. TUZAK-pozitif hücreler ile 3 veya daha fazla hücre çekirdeği, Osteoklastlar düşünün.
   2. ImageJ yazılımında bir şey görüntüsünü açın: "Dosya" → "Aç".
   3. Görüntünün sol üst köşesinde ölçek birimlerini doğrulayın. Göreli miktar için herhangi bir birimi kullanılabilir. Osteoklast boyutu mutlak değerini gerekli ise, µm için ölçek birimlerini dönüştürün: "Resim" → "özellikleri". Daha sonra tüm resimlere uygulanan yeni ölçek birimler için açılan pencerede "küresel" kutuyu işaretleyin.
      Not: mikroskop resim alma için kullanıldıysa, düşsel bilgisayar yazılımı her amaç için µm piksel boyutunda gösterilir.
   4. Çözümlenmesi için ölçüm parametreleri belirtin: "→"ölçümleri ayarla"analiz". Ölçümler ayarla penceresinde "Alan" ve "Etiketi göster" kutuları işaretleyin ve diğerleri uncheck kutuları.
   5. Yatırım Getirisi (faiz bölgesi) Yöneticisi'ni açın: "→"Araçlar"analiz" → "ROI Yöneticisi".
   6. Ana penceresinde, dikdörtgen seçim aracını seçin. Yaklaşık 1000 x 1000 µm bir sektör anahat için görüntünün içinde her yerde kullanın. Bu seçim şimdi hangi Osteoklast boyutu analiz edilecek ilk bölge tanımlar.
   7. ROI Yöneticisi penceresinde, yörenin ilgi ROI Yöneticisi'ne ekleyin ve "Daha fazla" → "Kaydet" tıklayarak kaydetmek için "Ekle" düğmesini tıklayın. Kaydedilmiş ROI şimdi ROI Yöneticisi her zaman "Daha fazla" → "Aç" ı tıklatarak yeniden yüklenebilir.
   8. Aygıtlarından 5.2.5 - Osteoklast boyut analizi için 4 ek bölge tanımlamak için 5.2.6 (şekil 2A ve 2D).
      Not: Tüm görüntüleri boyutlarda Osteoklast çözümlemek için tanımlanmış bölgeleri kullanılacaktır.
   9. Analiz edilecek 5 bölgelerinden biri bir kopyasını oluşturun: Bu ROI (karşılık gelen seçimi ana görüntü görünür) ROI Yöneticisi ana açmadı → seçimi → "Yinelenen" içinde sağ tıklatın. Bu yinelenen daha ayrıntılı bir çözümleme için kullanın.
   10. ROI Yöneticisi penceresinde kutuları "Göstermek Al" l ve "Etiketler" kontrol.
   11. Ana pencerede bir seçimdeki Osteoklastlar anahatlarını el ile belirlemeniz çokgen seçim aracını seçin. Bu anahat ROI Yöneticisi için "Ekle" ROI Yöneticisi penceresinde tıklatarak ekleyin. Benzer şekilde tamamen seçilen bölge içinde yalan tüm Osteoklastlar için devam (şekil 2B ve 2E).
   12. ROI Yöneticisi penceresinde tüm anahatlar seçin ve "Ölçü" tıklayarak onların yüzey ölçmek. Yeni bir pencere (sonuçları penceresi, şekil 2C ve 2F) göründüğü ölçümleri bir e-tabloya aktarmak.
       Not: Bu noktada, analiz Osteoklastlar anahatları ile bölge bağımsız bir resim olarak kaydedilmiş olabilir: "Dosya" → "Farklı Kaydet" tercih biçimi.
   13. 5.2.8 - 5.2.12'den analiz geçerli görüntünün kalan bölgeler için yineleyin. Sonra tüm diğer resimler için tüm prosedürü tekrarlayın.
3. Osteoklast numara analizi ImageJ yazılımı ile.
   Not: Osteoklast dağıtım iyi nadiren homojen olduğu gibi bütün iyi yerine birkaç seçilen bölgeler üzerinde sayım gerçekleştirin. Osteoklastlar formu ve boyut, hücre yöntemi sayma Hayır otomatik olarak heterojen verilen uygulanabilir 's.
   1. Bütün iyi görüntü ImageJ yazılım (çözümlenmek kullanım imge--dan önceki alt bölümde) açın.
   2. Hücre sayaç penceresini açın: "Eklentiler" → "analiz" → "Hücre Counter". Tıklayın "Başlat" ve "tip 1" onay kutusunu (ya da her türlü sen tercih etmek sayı yazın). "Numarasını göster" onay kutusunun seçili olduğundan ve "Silme modu" kutusunun işaretli olmadığından emin olun.
   3. Resmin üzerine tıklayın bir Osteoklast: tıklandığında nerede renkli nokta ve bir sayı görünür. Benzer şekilde tüm Osteoklastlar için devam edin. Veri işaretleyicilerini düzenli olarak yanında tıkırtı üstünde "Kaydetmek işaretleri" hücre sayaç penceresinde Kaydet
      Not: son nokta sayımdan kaldırılacak ise, "Delete" hücre sayaç penceresinde tıklatın. Kaldırmak için birden fazla nokta ise, "Silme modu" kutuyu işaretleyin ve tüm geçersiz yanında tıkırtı üstünde onları gösteriyor. O zaman sayımı devam etmek için "Silme modu" kutunun işaretini kaldırın.
   4. Hücre sayaç penceresinde sonuçları tıklayarak sayım sonucu görüntüler. Son sayım sonuçları elektronik tabloya aktarmak.

6. Osteoklast işlevi U(VI) huzurunda analizi

1. Çukur rezorpsiyonu tahlil.
   1. Plaka ham 264.7 hücreleri Osteoklastlar tarafından resorbed bir sentetik inorganik osteomimetic yüzey sağlar bir 24-şey osteo tahlil plaka üzerinde.
      Not: hücreleri biomimetic yüzeye eklemek amacıyla, bu kez onları farklılaşma orta eklemeden önce gün plaka daha iyi olur.
   2. HAM 246.7 hücre Osteoklastlar 5 (Adım 5.1.2 - 5.1.4) bölümünde açıklandığı gibi ayırt etmek
   3. Günü osteoclastogenesis 5, % 10 çamaşır suyu Çözümle uranyl içeren orta değiştirerek kemik mimetic yüzeyden Osteoklastlar kaldırın. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Wells iki kez deiyonize su ile yıkayın ve onlara kuruması.
   4. Bir % 1 Alizarin Red S sodyum tuz solüsyonu kalsiyum tuzları resorbed olmayan alanlarda leke wells ekleyin. Sonra 10-15 s, kuluçka alizarin çözümü kaldırmak ve yavaşça wells 3 - 4 kez su ile yıkayın. Kuyuları kurumasına izin verin.
      Not: yukarıda açıklanan boyama yordamı ardışık analiz kolaylaştırmak için resorbed ve resorbed olmayan alanları arasındaki kontrastı artırmak için tasarlanmıştır. Boyama önce kuyu tamamen kuru değilseniz, kalan kemik mimetic yüzey bölümlerini yanlışlıkla kaldırılmış olabilir çünkü bu yordamı dikkatle yapılmalıdır. Alizarin çözüm wells çok uzun süre bırakılırsa, Ayrıca, non-spesifik kalıcı bir boyama-ecek gözükmek. Bu bölümde anlatılan test uranyum etkisi mediatörlerin farklılaşma ve fonksiyonu ilişkili olduğu unutulmamalıdır. Uranyum etkisi rezorpsiyonu Osteoklast oluşumu bağımsız olarak çalışmaya, ham 264.7 hücreleri ile uranyl içeren tedavi edilebilir orta boy olgun Osteoklastlar (gününde 4 ya da 5 farklılaşma süreci) sadece oluşmuş bir kez 24 saat ²³.
2. Çukur rezorpsiyonu analizi.
   1. Her şey osteo tahlil plaka tüm yüzeyi görüntüsünü elde etmek.
      Not: Görüntü edinme yöntemleri değişebilir ancak Çoğalt deneyler tutarlı olmalıdır. Onlar sabit bir kamera, yüksek çözünürlüklü bir tarama veya bir otomatik yüksek işlem hacmi mikroskobu ile yapılan bir mozaik görüntü makro amacı ile çekilen bir resim içerebilir.
   2. 5.2.2-5.2.4'ten önceki bölümdeki adımları yineleyerek çözümlemesi'ni başlatmak.
   3. RGB görüntüyü gri tonlama 8 bit biçimine dönüştürme: "Resim" → "Yazın" → "8 bit".
   4. Ana penceresinde, oval seçim aracını seçin. Rezorpsiyonu için analiz edilecek şey tüm yüzeyini özetleyen bir daire çizmek için kullanın.
   5. Bu yeni yatırım Getirisi olduğu gibi adım 5.2.6 kaydedin.
   6. Eşik seçimi kolaylaştırmak için tüm özellikleri dışında tanımlanmış ROI temizleyin: "Düzenle" → "Dış açık".
      Not: Bu noktada, bu kez bir kaç resim kopyalarının yapmak daha iyi olur: ROI seçilen bölge → sağ tıklayın görüntü → "Yinelenen" dışında tıklatarak seçimini kaldırın. Bu eylem bir sonraki adımda seçilen eşik tatmin edici ise yukarıda açıklanan resim tedavi tekrarı önlemek yardımcı olur.
   7. "Resim" → "Ayarlama" → "eşik" seçin. Eşik penceresinde, uygun bir eşik seçmek için kaydırma çubuğunu kullanın. Tüm resorbed alanları (beyaz) eşiğin altına olmalıdır ve sigara-, (kırmızı) resorbed. Eşik seçimi sonuçlandırmak için "Uygula" eşik penceresinde tıklatın.
   8. Son ikili görüntü kaydetmek: "Dosya" → "Farklı Kaydet" → biçimini seçtiğiniz.
   9. Faiz bölgede alınacak ölçüler tanımlayın: "→"ölçümleri ayarla"analiz". Ölçümleri ayarla penceresinde "Alanı", "Alan kesir" ve "Eşik sınırı" kutuları kontrol edin ve diğerleri işaretini kaldırın.
   10. "Resorbed" alan sonuçları penceresinde doğrudan kısmını elde etmek için ("→"Ters"Edit") ikili görüntü tersine çevirin. Ana yatırım Getirisi üzerinde son ikili resim seçili olduğundan emin olun (aksi takdirde resorbed alan kesir hesaplanabilir dayalı tüm görüntü penceresinin yüzeyinde). Ölçü resorbed alan kesir yanında ikisinden biri "Ölçü" ROI Yöneticisi penceresinde tıkırtı üstünde ya da "→"Tedbir"analiz". Sonucu kaydedin.

Tartarat dayanıklı asit fosfataz boyama Osteoklastlar 3 veya daha fazla hücre çekirdeği olan büyük mor hücreler olarak görselleştirmek için kullanıldı. Osteoklastlar temsilcisi görüntülerini RANKL huzurunda kültürlü ham 264.7 hücrelerden elde edilen ve uranyl iyonları şekil 1' de gösterilmiştir. Osteoklastlar uranyum yanıt boyutunu ve sayısını değişiklikleri bütün Wells bileşik görüntüler ve büyütülmüş resimler kolayca görülebilir.

Osteoklastlar boyutunu ImageJ yazılım (Şekil 2) kullanarak analiz edildi. Bu amaçla, Osteoklastlar lekeli tuzak bütün-şey görüntüleri kullanıldı ve aynı bölgeleri her kültür koşul her kuyuya tedavi edildi (şekil 2A ve 2D). Tüm Osteoklastlar her bölgede mevcut özetlenen (şekil 2B ve 2E) hangi izin (µm²içinde ifade) kendi alanı belirlenmesi (şekil 2C ve 2F). Şekil 2 ' de gösterilen örnekler Osteoklast boyutu güçlü etkisi uranyum göstermektedir.

Uranyum Osteoklast rezorpsiyonu aktivite üzerinde etkisini araştırmak için ham 264.7 hücreleri kaplama ve osteomimetic yüzey plaka üzerinde farklı. Testin sonunda, Osteoklastlar çıkarıldı. Sonra kemik mimetic yüzey her iyi tedavi Alizarin Red S sodyum tuzu tarafından sigara resorbed alan leke için ve görüntüleri her bütünün de elde (şekil 3A ve 3D). Elde edilen resimler görüntü J yazılımı ile işlendi. 8 bit gri tonlama Albümdeki çevrildi (şekil 3B ve 3E), eşik tabi (şekil 3 c ve 3F) ve resorbed alanı (beyaz bölgeler) otomatik olarak hesaplanmıştır.

Şekil 1: U(VI) etkisi Osteoklast oluşumu görselleştirme. HAM 264.7 hücreleri uranyl belirtilen konsantrasyon huzurunda ayırt. 4 gününde tartarat dayanıklı asit fosfataz (tuzak) Boyama gerçekleştirildi. Temsilcisi bütün iyi filmler (üst panelleri) tuzak lekeli Osteoklastlar bu şartlarda elde göster. Kutulu alanlarda multinucleated Osteoklastlar örnekleri daha yüksek büyütmede (oklar alt panelinde) gösterilir. Bu resimleri Osteoklast oluşumu üzerinde U(VI) doz bağımlı etkisini göstermektedir. Siyah kafa oklar Osteoklast çekirdek örnekleri gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: U(VI) etkisi Osteoklast boyut analizini. (A ve D): Osteoklastlar kutulu bulunduðu hangi Osteoklast boyutu analiz bölgelere karşılık gelen bütün-şey görüntüleri gösterilir. Alan kırmızı kasa içi (A ve D) karşılık gelen bu gösterilen içinde (B) ve (E), anılan sıraya göre. (B ve E): el ile çizim iki uranyl-konsantrasyon koşullarında Osteoklast kenarlarının mavi renkle gösterilir. (C ve F): Neden ImageJ yazılım ölçümleri (B ve E) çözümlemesi sırasıyla gösterilen--dan pencere eşiği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: U(VI) etkisi Osteoklast işlevi analizi. Görüntüleri Alizarin lekeli osteomimetic yüzey(a)yokluğunda veya uranyl (D) 25 µM huzurunda gerçekleşti mediatörlerin rezorpsiyonu sonra. (A ve D) resimleri-ilk dönüştürülmüş 8 bit gri tonlamalı görüntüleri (B ve E) gösterildiği ve uygun eşik ayarını uygulayarak daha sonra ikili görüntüler (C ve F). İkili bu görüntüler her durumda resorbed alanı yüzdesini hesaplamak için kullanılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bildiğimiz gibi doğal uranyum etkisi kemik hücreleri resorbing çalışmaya yönelik ayrıntılı yönerge açıklanan ilk kez bu. Bu yaklaşım uranyum etkisi kemik fizyolojisi üzerinde daha iyi bir anlayış elde etmek için yararlı olacağını ve uranyum şelatörlerin tarama için ilginç bir yeni bir araç sağlayabilir. Ayrıca, burada açıklanan protokol diğer ağır metaller osteoclatogenesis üzerinde etkisini incelemek için uygulanan olabilir inanıyoruz.

O uranyl complexed kültür medya^18,19,20,21inorganik ve organik bileşenler ile bilinir. Bu complexations uranyum ve bu şekilde, onun sitotoksisite Türleşme etkisi. Bu nedenle, uranyum içeren kültür medya hazırlanması protokolündeki kritik bir adımdır. Biz daha önce^%23 5 fetal sığır serum ham 264.7 hücre kültürü ortamında varlığı için 400 µM 0 arasında değişen konsantrasyonlarda kullanıldığında uranyl sitotoksisite üzerinde önemli bir etkisi vardı göstermiştir. Serum orta varlığı mediatörlerin farklılaşma tüm süreci sırasında uranyum pozlama etkisini analiz için gerektiği şekilde, bu önemli bir noktadır. Yine de, pozlama medya (6 saat) hazırlanması için açıklanan uzun iki adım prosedürü dikkatle izlenmesi gereken vurgulamak istiyoruz. Nitekim, kuluçka adım 3 saat sonra uranyl tuzları her seyreltme potansiyel olarak uranyl kompleksleri istikrar sağlar / çözüm daha fazla seyreltme veya hücre pozlama önce kurulmuş. Bu güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kesinlikle gereklidir.

Başka bir önemli parametre Osteoklast farklılaşma ve rezorpsiyonu deneyleri tekrarlanabilirlik için RAW 264 tohumlama yoğunluğudur.7 hücreleri. Gerçekten de, hücre hücre yakınlık hücresel füzyon olaylar²⁴etkilediği için mononükleer habercisi yoğunluğu Osteoklast oluşumu için önemli bir belirleyici en büyük olasılıkla olduğunu gösterilmiştir. Bu nedenle, özel bir önem sayma, hücresel süspansiyon hazırlama ve homojenliği her kuyuya yanlış yorumlanmasına önlemek için tohum, hücre için ödenmesi gerekmektedir.

Eşik, rezorpsiyonu miktar otomatikleştirmek için yararlı bir araçtır. Dışarı bu analizin işaret değer düzgün aydınlatılmış görüntüleri gerektirir. Ancak, ortak bir kamera ve görüntü alma yöntemi türü ne olursa olsun düzensiz aydınlatma kenarlarda görüntünün sorundur. Bu durumda, bir çok adım eşik yöntemi gerekli olabilir.

Özetle, biz uranyum etkisi Osteoklast oluşumu, canlılık ve fonksiyonu çalışma sağlayan sağlam bir protokol kurduk. Bu yordamı ham 264.7 hücre satırını kullanarak geliştirilmiştir ancak²³gördüğümüz gibi tam olarak birincil kemik iliği Osteoklast öncüleri için geçerlidir.

Yazarlar ifşa yoktur

Yazarlar Chantal Cros yararlı teknik destek için teşekkür etmek istiyorum.
Bu araştırma gelen hibe tarafından finanse edildi "Komiserliği à l'Energie Atomique et aux enerji alternatifleri" (URANOs - programı enine de Toxicologie du CEA ve CPRR CEA-AREVA) ve ANR üzerinden (uranyum toksisite: biomineralization çok düzeyli yaklaşım «««işlem) kemik, ANR-16-CE34-0003. Bu eser de CNRS ve güzel Sophia Antipolis Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.