Metodi per analizzare gli impatti di uranio naturale il Osteoclastogenesis In Vitro

L'uranio è conosciuto per interessare il metabolismo dell'osso. Qui, presentiamo un protocollo volto a indagare l'effetto dell'esposizione all'uranio naturale sulla vitalità, la differenziazione e la funzione degli osteoclasti, le cellule responsabili di riassorbimento dell'osso.

L'uranio è stato indicato per interferire con la fisiologia dell'osso ed è ormai assodato che questo metallo si accumula in osso. Tuttavia, piccolo è conosciuto circa l'effetto di uranio naturale sul comportamento delle cellule di osso. In particolare, l'impatto dell'uranio su osteoclasti, le cellule responsabili del riassorbimento della matrice dell'osso, non è documentata. Per studiare questo problema, abbiamo stabilito un nuovo protocollo con acetato di uranile come fonte di uranio naturale e la linea cellulare murina di 264,7 come modello dei precursori degli osteoclasti. Nel presente documento, abbiamo dettagliate tutte le analisi necessarie per test di citotossicità di uranio sui precursori degli osteoclasti e per valutarne l'impatto sul osteoclastogenesis e la resorbing funzione degli osteoclasti maturi. Le condizioni abbiamo sviluppato, in particolare per la preparazione di uranile contenenti terreni di coltura e per la semina di RAW 264.7 celle consentono di ottenere risultati affidabili e altamente riproduttive. Inoltre, abbiamo ottimizzato l'uso di strumenti software per facilitare l'analisi di vari parametri quali la dimensione degli osteoclasti o la percentuale di matrice resorbed.

L'uranio è un elemento radioattivo naturale presente nel suolo, aria e acqua; come tale, gli animali e gli esseri umani sono esposti a uranio naturale nelle loro diete. Oltre alle fonti naturali, l'uranio proviene da attività antropiche, che aumenta la sua abbondanza nell'ambiente. Uranio pone rischi sia chimici e radiologici. Tuttavia, poiché l'uranio naturale (che è una miscela isotopica contenente 99,27% ²³⁸U e 0,72% ²³⁵U 0.006% ²³⁴U) ha una debole attività specifica (25.10³ Bq.g^-1), suoi impatti sulla salute sono attribuiti a sua tossicità chimica.

Qualunque suo percorso di voce (inalazione, ingestione o esposizione cutanea), la maggior parte dell'uranio entra nel corpo è eliminato con le feci e solo una piccola parte raggiunge la circolazione sistemica. Circa il 67% di uranio nel sangue a sua volta viene filtrato dai reni e lascia il corpo nelle urine entro 24 ore¹. Il resto è per lo più depositato in reni e le ossa, i due principali organi bersaglio di uranio tossicità^2,3,4. Poiché lo scheletro è stato identificato come il luogo primario di uranio a lungo termine conservazione^2,3,4,5,6, diversi studi sono stati condotti per esplorare il effetto dell'uranio su osso fisiologia⁷.

L'osso è un tessuto mineralizzato che è continuamente rinnovato tutta la sua durata. Rimodellamento osseo è un processo complesso che dipende dai tipi di cellula specializzata e consiste principalmente di due fasi: il riassorbimento della matrice vecchia pre-esistente dagli osteoclasti seguita da costruzione de novo dell'osso dall'osteoblasto. Gli osteoclasti sono grandi cellule multinucleare risultanti dalla fusione di cellule progenitrici di origine ematopoietica che migrare verso siti di riassorbimento dove essi attribuiscono alle ossa di⁸. Loro attaccamento si verifica simultaneamente con una vasta riorganizzazione di loro citoscheletro⁹. Questa riorganizzazione è necessaria per l'istituzione di un compartimento isolato tra la cella e la superficie dell'osso in cui l'osteoclasto secerne protoni, che porta alla dissoluzione dell'idrossiapatite e proteasi coinvolte nella degradazione della matrice organica. I prodotti di degradazione risultanti sono stimolazione, trasportati attraverso la cella per l'area della membrana di fronte la superficie ossea e secreta, un processo chiamato transcitosi^10,11.

I risultati degli studi in vivo e in vitro indicano che l'uranio inibisce la formazione dell'osso e altera il numero e l'attività degli osteoblasti^7,12. Al contrario, gli effetti dell'uranio sul riassorbimento dell'osso e gli osteoclasti sono stati scarsamente esplorati. Diversi studi in vivo hanno segnalato un aumento di riassorbimento dell'osso dopo amministrazione del nitrato di uranile in topi o ratti^13,14. Inoltre, un'indagine epidemiologica ha suggerito che l'aumento nell'assunzione di uranio nell'acqua da bere ha teso ad essere associato con un aumento nel livello del siero di un marker di riassorbimento osseo in uomini¹⁵. Presi insieme, questi risultati hanno condotto alla conclusione che l'uranio, che si accumula nell'osso potrebbe promuovere il riassorbimento dell'osso. Tuttavia, i meccanismi cellulari coinvolti in questo effetto potenziale di uranio rimangano una questione aperta. Per questo motivo, abbiamo deciso di esaminare l'impatto dell'uranio sul comportamento di resorbing cellule ossee.

Qui, descriviamo il protocollo che abbiamo stabilito per caratterizzare e quantificare gli effetti di uranio naturale sulla vitalità di pre- osteoclasti e sulla differenziazione di osteoclasti e attività resorptive. Gli esperimenti descritti nel presente documento sono state fatte con il RAW 264.7 murino trasformato linea cellulare del macrofago, che possono facilmente differenziare in osteoclasti quando coltivate in presenza della citochina RANKL per 4 o 5 giorni, e che è classicamente usato per studiare osteoclasto differenziazione e la funzione¹⁶. Le procedure elaborate sono affidabili, dare risultati altamente riproducibili e sono pienamente applicabile al primari osteoclasti. Per tutte queste ragioni, riteniamo che questa metodologia è utile per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti nella tossicità di uranio nell'osso. Inoltre, riteniamo che questo approccio potrebbe essere adattato come uno strumento di screening per l'identificazione di nuovo uranio agenti chelanti.

1. preparazione della soluzione di acetato di uranile

1. Per preparare 2 mL di una soluzione di acetato di uranile 100mm, aggiungere 85 mg di acetato di uranile (UO₂(OCOCH₃)₂, 2 H₂O; M = 424 g.mol^-1) a stato solido per un tubo di plastica da 5 mL.
2. Aggiungere 2 mL di acqua distillata per il tubo di plastica e montarla con un tappo di plastica.
3. Agitare bene il tubo fino alla totale dissoluzione del solido. Mettere la soluzione in frigorifero per 24 h.
   Attenzione: La manipolazione di uranile [U(VI)] presenta alcuni rischi chimici e radiologici. Tutti i campioni devono essere preparati e caratterizzati con apparecchiature ad hoc in appositi laboratori. Tutti i liquidi contenenti U VI devono essere raccolti in contenitori rifiuti specificamente assegnati e smaltiti come rifiuti tossici. Rifiuti secchi (pipette, provette, ecc.) possono essere lavato con soluzione di 0,1 N HNO₃ , che solubilizzano e rimuovere U(VI).
4. Verificare il pH della soluzione utilizzando un microelettrodo e un pH-metro.
   Nota: Il microelettrodo deve essere precedentemente tarato usando soluzioni commerciali tampone (pH = 4 e pH = 7).

2. RAW 264.7 celle cultura

1. Manutenzione delle cellule.
   1. Coltivare 264.7 celle grezze (ATCC, TIB-71) in 75 cm² boccette nel mezzo di sviluppo seguenti: Dulbecco modificato supplementato dell'Aquila (DMEM) con 5% di siero bovino fetale e antibiotici: 100 UI/mL penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina. Mantenere le cellule in incubatore a 37 ° C, 5% CO₂.
   2. Sostituire il terreno ogni 2 o 3 giorni. Quando le cellule sono 85-90% confluenti, meccanicamente rimuoverli nel matraccio di cultura con un raschietto di cella (come consigliato dall'ATCC) e dividerle a un rapporto di 1:6.
      Nota: solo le celle tra passaggi da 3 a 10 vengono utilizzate per esperimenti di differenziazione.
2. Preparazione delle cellule per esperimenti
   1. Sloggiare le cellule dal substrato pallone come descritto sopra e trasferirli in una provetta sterile 50 mL. Mescolare cellule pipettando su e giù per rompere i grumi. Contarli con un emocitometro. Si aspettano 35 milioni di cellule per pallone da 75 cm² .
   2. Calcolare il volume della sospensione di cellule necessarie per ogni esperimento come segue:
      Numero di sperimentale circostanze x 3 (triplici copie) x 1 mL/pozzetto + 3-4 mL (pipettaggio perdite).
      Nota: Densità per tutti i saggi descritti nel presente protocollo il Seeding è 5.000 cellule/cm². Pertanto, per una piastra a 24 pozzetti, vuol dire 10.000 cellule per pozzetto in 1 mL di terreno, e densità di sospensione cellulare è quindi 10.000 cellule/mL.
   3. Preparare la quantità necessaria di 10.000 cellule/mL di sospensione cellulare e le cellule di seme in piastre da 24 pozzetti. Per le analisi di citotossicità, utilizzare normale crescita medio. Per differenziazione e dosaggi di riassorbimento, uso alfa per volta minimo essenziale medio (αMEM) completati con 2 mM L-Glutammina, 5% FBS e 50 ng/mL di GST-RANKL¹⁷.
      Nota: Il GST-RANKL proteina prodotta internamente può essere sostituita da qualsiasi citochina RANKL commercialmente disponibile. Quando si lavora con un nuovo lotto RANKL, può essere utile testare la sua efficacia nell'induzione di osteoclastogenesi eseguendo un esperimento di risposta dose con concentrazione di RANKL che vanno da 20 a 150 ng/mL.

3. Diluire la soluzione di acetato di uranile 100mm in terreno di coltura

Nota: Gli ioni uranile [U(VI)] nel terreno di coltura formano più complessi con altri componenti medie che potrebbero modificare la sua tossicità cellulare^18,19,20,21. Per questo motivo, contenenti uranile media dovrebbe essere preparata estemporaneamente senza omissione o accorciamento passaggi di equilibrazione.

1. Ha scelto di uranile concentrazioni di esposizione e calcolare i volumi di cultura media necessaria per l'esperimento (tenendo conto che ogni condizione viene eseguita in triplice copia).
2. A partire da coltura delle cellule sterili testato 7,5% soluzione acquosa di bicarbonato di sodio ([HCO₃^–] = 893 mM), preparare una soluzione di₃^– -HCO 100mm in acqua e raffreddarlo sul ghiaccio.
3. Aggiungere goccia a goccia 1 volume di soluzione stock 100 mM acetato di uranile 9 volumi di 100mm ghiacciata HCO₃^– soluzione, agitare delicatamente il tubo di miscelazione. Questa operazione verrà diluire la soluzione madre di acetato di uranile ([UO₂^{2 +}] = 100 mM, pH 4) fino a 10 mM e portare il pH a circa 7.
4. Aggiungere 1 volume di acqua sterile 9 volumi di 100mm ghiacciata HCO₃^– soluzione per raggiungere 90mm HCO₃^– (pari a HCO₃^– concentrazione della soluzione di uranile 10 mM), che servirà a preparare il controllo medio.
5. Consentire soluzioni preparate riposare per 3 ore a temperatura ambiente (TA) di equilibramento.
6. Nel frattempo, preparare il supporto di esposizione di base: αMEM con 2 mM L-Glutammina e 5% FBS.
   Nota: Per differenziazione e dosaggi di riassorbimento, aggiungere 50 ng/mL di GST-RANKL al mezzo di esposizione di base.
7. Dopo 3 h, diluire la quantità appropriata della soluzione di uranile goccia a goccia nel mezzo di esposizione in modo da ottenere la desiderata uranile lavorando le concentrazioni di 10 mM. Contemporaneamente preparare il supporto di controllo aggiungendo la quantità di bicarbonato usato in condizioni di uranile-trattati più concentrato, al mezzo di esposizione.
8. Lasciare che supporti preparati a stare per 3 h a RT di equilibramento.
9. Rimuovere la crescita media dei pozzi e sostituirlo con il controllo e il supporto di uranile-contenente.

4. analisi di cruda 264,7 precursori attuabilità in presenza di U(VI) (analisi di MTT citotossiche)

Attenzione: Sia MTT e DMSO potrebbe causare pelle e irritazione oculare. Indossare guanti e occhiali di protezione quando loro manipolazione. Raccogliere i rifiuti prodotti in contenitori rifiuti specificamente assegnati.

1. Sciogliere una quantità appropriata di polvere 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromuro (MTT) in PBS per ottenere una soluzione madre 10x a 5 mg/mL. Sterilizzare mediante filtrazione con un filtro di 0,22 µm e conservare le aliquote a-20 ° C.
2. Cellule di piastra su piastre da 24 pozzetti (3 pozzi a condizione sperimentale per piastra). Non dimenticate di prenotare 3 pozzi vuoti per piastra per gli spazii in bianco di spettrofotometro.
3. Incubare le cellule a 37 ° C per 22-24 h prima dell'esposizione all'uranio per consentire di allegare le cellule.
4. Preparare i supporti contenenti uranile come descritto nella sezione 3.
5. Sostituire il mezzo di crescita nelle piastre della cella-seminato con contenenti uranile media. Incubare per 24 h.
6. Calcolare il volume necessario di 1 x MTT soluzione come segue:
   (Numero di condizioni sperimentali + blank) x 3 (triplici copie) x 0,4 mL/pozzetto + 10% del volume per pipettaggio perdite.
7. Preparare il volume richiesto di soluzione x MTT 1 diluendo i 10 x soluzione MTT stock dell'Aquila minimo essenziale medio (EMEM) senza rosso fenolo.
   Nota: per un'analisi colorimetrica successo, MTT deve essere protetto dalla luce. Si consiglia di diluire MTT in EMEM anziché DMEM al fine di limitare il segnale di fondo.
8. Rimuovere supporti contenenti uranile dai pozzi, lavarli con PBS e aggiungere 400 µ l di soluzione MTT in ogni pozzetto (tra cui 3 pozzi vuoti per gli spazii in bianco). Incubare 2,5 h a 37 ° C al buio. Verificare sotto il microscopio che essersi formati dei cristalli di formazano viola scuro all'interno di cellule vitali.
9. Scartare la soluzione MTT e 220 µ l di solfossido dimetilico (DMSO) per pozzetto. Avvolgere piastre in alluminio per proteggerli dalla luce e agitare delicatamente per 10 min sciogliere i cristalli di formazano.
10. Utilizzare un lettore di micropiastre spettrometro per determinare la densità ottica (OD) a 570 nm (formazano specifico) e 690 nm (sfondo). Per ciascun pozzetto, sottrarre 690 nm OD dal 570 nm OD al regolare per possibile fluttuazione di valore OD non specifiche a causa di graffi o torbiditಲ.
11. Calcolare la corretta OD per ciascun pozzetto sottraendo OD media dello spazio in bianco dal OD ottenuti nel passaggio precedente. Determinare la media valore OD per ogni condizione sperimentale.
12. Set medio verde di condizione di controllo ([UO₂^{2 +}] = 0 mM) 100% redditività e calcolare la percentuale corrispondente di attuabilità delle cellule per altre concentrazioni di uranile testati. Tracciare una curva dose-risposta. Valutare la citotossicità Indice 50 (CI₅₀), definita come la concentrazione di uranile che conduce alla morte delle cellule di 50% dopo 24 ore di esposizione.

5. analisi della differenziazione degli osteoclasti in presenza di U(VI)

1. Differenziazione di RAW 264.7 cellule in presenza di uranile e trappola (tartrato-resistente all'acido della fosfatasi) colorazione.
   1. Piastra 264.7 celle grezze su una piastra a 24 pozzetti, 3 pozzi a condizione sperimentale. Incubare a 37 ° C per circa 6 ore, il tempo di preparare ed equilibrare l'esposizione media di uranile-contenente.
   2. Preparare i supporti di differenziazione con le concentrazioni di uranile desiderata come descritto nella sezione 3 (non dimenticate di aggiungere GST-RANKL ai media).
   3. Sostituire delicatamente terreno base in pozzi con contenenti uranile medio. Questo giorno è considerato come giorno 0 di differenziazione osteoclastic.
   4. Cambiare il mezzo giorno 2 o 3 di differenziazione osteoclastic ripetendo i punti 5.1.2 e 5.1.3. Osteoclasti multinucleated dovrebbero apparire tra i giorni 3 e 4.
   5. Eseguire la colorazione di trappola con il kit di fosfatasi acida del leucocita disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore.
      Nota: tartrato-fosfatasi acida resistente (TRAP), anche chiamata fosfatasi acida 5, tartrato resistente (ACP5) è altamente espresso in osteoclasti maturi e ampiamente utilizzata come indicatore per la differenziazione degli osteoclasti. Pertanto, trappola colorazione viene eseguita per visualizzare gli osteoclasti. A seconda delle condizioni sperimentali e il tasso di osteoclastogenesi, potrebbe essere fatto giorno 4 o 5 del processo di differenziazione.
   6. Tenere pozzetti trappola-macchiato in PBS a 4 ° C per un'ulteriore analisi (essi possono essere mantenuti in queste condizioni fino a 3 o 4 settimane).
2. Analisi di dimensione/morfologia degli osteoclasti.
   1. Acquisire un'immagine di tutta la superficie di ciascun pozzetto. La risoluzione dell'immagine deve essere sufficiente per distinguere i nuclei delle cellule. Considerare le cellule TRAP-positivi con 3 o più nuclei, come gli osteoclasti.
   2. Aprire un'immagine di un pozzo nel software ImageJ: "File" → "Apri".
   3. Verificare l'unità di scala nell'angolo superiore sinistro dell'immagine. Per la relativa quantificazione, può essere utilizzato qualsiasi unità. Se il valore assoluto della dimensione degli osteoclasti è necessario, è possibile convertire unità di scala in µm: "→"proprietà"dell'immagine". Selezionare la casella "globale" nella finestra pop-up al fine di avere nuove unità di scala applicata a tutte le immagini aperte successivamente.
      Nota: Se un microscopio è stato utilizzato per acquisizione immagini, la dimensione in pixel in µm è indicata per ogni obiettivo nel software di imaging.
   4. Specificare i parametri di misura da analizzare: "Analizzare" → "impostare Measurements". Nella finestra impostare misure, "Zona" e "Display etichetta" caselle di controllo e deselezionare tutte le altre caselle.
   5. Aprire il gestore di ROI (regione d'interesse): "Analizzare" → "strumenti" → "ROI Manager".
   6. Nella finestra principale, scegliere lo strumento di selezione rettangolare. Utilizzare ovunque nell'immagine per delineare un settore di circa 1.000 x 1.000 µm. Questa selezione ora definisce la prima regione in cui osteoclasto dimensioni saranno analizzati.
   7. Nella finestra di ROI Manager, fare clic sul pulsante "Aggiungi" per aggiungere questa regione di interesse per il manager di ROI e salvarlo cliccando su "Altro" → "Salva". Il ROI salvato ora possono essere ricaricato con il manager di ROI in qualsiasi momento facendo clic su "Più" → "Apri".
   8. Ripetere i passaggi 5.2.5 - 5.2.6 per definire ulteriori 4 regioni per analisi della dimensione degli osteoclasti (Figura 2A e 2D).
      Nota: Le regioni definite verranno essere utilizzate per analizzare le dimensioni degli osteoclasti in tutte le immagini.
   9. Creare una copia di una delle 5 regioni da analizzare: ha scelto questo ROI nel principale il manager di ROI (la selezione corrispondente apparirà sull'immagine principale) → tasto destro del mouse all'interno della selezione → "Duplicato". Utilizzare il duplicato per ulteriori analisi.
   10. Nella finestra Gestione ROI, caselle di controllo "Visualizza Al" l e "Etichette".
   11. Nella finestra principale, scegliere lo strumento di selezione poligono per delineare manualmente uno degli osteoclasti nella selezione. Aggiungere questo contorno al manager di ROI facendo clic su "Aggiungi" nella finestra di gestione di ROI. Procedere allo stesso modo per tutti gli osteoclasti che si trovano completamente all'interno dell'area selezionata (Figura 2B e 2E).
   12. Nella finestra di gestione di ROI, selezionare tutti i contorni e misurare la loro superficie facendo clic su "Misura". Trasferire le misure che sono apparsi in una nuova finestra (finestra risultati, Figura 2 e 2F) in un foglio di calcolo.
       Nota: A questo punto, la regione di analisi con tutti i contorni di osteoclasti potrebbe essere salvata come immagine indipendente: "File" → "Salva con nome" formato di scelta.
   13. Ripetere i passaggi 5.2.8 - 5.2.12 per le restanti regioni di analisi dell'immagine corrente. Quindi, ripetere l'intera procedura per tutte le altre immagini.
3. Analisi numero degli osteoclasti con software ImageJ.
   Nota: Come distribuzione degli osteoclasti nel pozzo è raramente omogenei, eseguire il conteggio nel complesso bene, piuttosto che su alcune zone selezionate. Dato che gli osteoclasti sono eterogenei nella forma e dimensione, non automatizzata delle cellule metodo di conteggio è praticabile.
   1. Aprire un'immagine di intero-pozzo nel software ImageJ (per questa analisi, usare immagini dalla sottosezione precedente).
   2. Aprire la finestra di contatore di cella: "Plugin" → "analizzare" → "Contatore di cellule". Fare clic su "Initialize" e la casella di controllo "Tipo 1" (o qualsiasi altra cosa digitare il numero che si preferisce). Verificare che è selezionata la casella "Visualizza numero" e "Modalità Delete" casella è deselezionata.
   3. L'immagine, fare clic su uno degli osteoclasti: punto colorato e un numero apparirà dove fatto clic. Procedere allo stesso modo per tutti gli osteoclasti. Salvare regolarmente i marcatori cliccando su "Salva marcatori" nella finestra di contatore di cella
      Nota: Se l'ultimo punto deve essere rimosso dal conteggio, clicca su "Elimina" nella finestra di contatore di cella. Se non c'è più di un punto da rimuovere, selezionare la casella "Elimina modalità" e indicare tutti i punti non validi facendo clic su di essi. Quindi deselezionare la casella "Elimina Mode" per continuare il conteggio.
   4. Visualizzare il risultato del conteggio facendo clic su risultati nella finestra di contatore di cella. Trasferire i risultati di conteggio finali a un foglio di calcolo.

6. analisi della funzione degli osteoclasti in presenza di U(VI)

1. Dosaggio di riassorbimento del pozzo.
   1. Piastra 264.7 celle grezze su una piastra di dosaggio osteo 24 pozzetti, che fornisce una superficie sintetica osteomimetic inorganici che potrebbe essere riassorbita dagli osteoclasti.
      Nota: al fine di lasciare che le celle attaccare alla superficie biomimetici, spesso è preferibile impiattatelo il giorno prima di aggiungere il mezzo di differenziazione.
   2. Differenziare le cellule RAW 246,7 in osteoclasti come descritto nella sezione 5 (punti 5.1.2 - 5.1.4)
   3. Il giorno 5 di osteoclastogenesi, rimuovere gli osteoclasti dalla superficie dell'osso mimetico sostituendo contenenti uranile medio con soluzione di candeggina al 10%. Incubare per 5 min a temperatura ambiente. Lavare i pozzetti due volte con acqua deionizzata e lasciarli asciugare all'aria.
   4. Aggiungere una soluzione 1% di sale del sodio di Alizarin Red S pozzetti a macchiare i sali di calcio nelle aree non riassorbito. Rimuovere alizarina soluzione dopo 10-15 s di incubazione e lavare delicatamente i pozzetti 3 - 4 volte con acqua. Lasciare che asciugare all'aria i pozzi.
      Nota: La procedura di colorazione sopra descritta è stata progettata per migliorare il contrasto tra la resorbed e le aree non riassorbito al fine di facilitare l'analisi consecutivi. Questa procedura deve essere fatto con attenzione perché se pozzi non sono completamente asciutte prima della colorazione, parti della superficie dell'osso-mimetici rimanente potrebbero essere rimosso accidentalmente. Inoltre, se alizarina soluzione è lasciata troppo a lungo nei pozzetti, una colorazione aspecifica persistente apparirà. Si deve osservare che la prova descritta in questa sezione si riferisce all'effetto di uranio sulla differenziazione osteoclastic e la funzione. Per studiare l'effetto dell'uranio sul riassorbimento indipendentemente dalla formazione di osteoclasti, 264.7 celle grezze possono essere trattate con contenenti uranile medie per 24 ore, solo una volta maturi osteoclasti si formano (a giorno 4 o 5 del processo di differenziazione) ²³.
2. Analisi di riassorbimento del pozzo.
   1. Acquisire un'immagine di tutta la superficie di ciascun pozzetto della piastra osteo dosaggio.
      Nota: I metodi di acquisizione immagini possono variare ma devono essere coerenti in tutto replicati esperimenti. Possono includere una foto scattata con un obiettivo a macroistruzione di una telecamera fissa, una scansione ad alta risoluzione o un'immagine mosaico fatto con un microscopio automatizzato elevato throughput.
   2. Iniziare analisi ripetendo i punti 5.2.2 a 5.2.4 dalla sezione precedente.
   3. Convertire un'immagine RGB in un formato di 8-bit scala di grigi: "Immagine" → "Tipo" → "8 bit".
   4. Nella finestra principale, selezionare lo strumento di selezione ovale. Usarlo per disegnare un cerchio che delinea tutta la superficie del pozzo essere analizzati per riassorbimento.
   5. Salvare questo nuovo ROI come descritto al punto 5.2.6.
   6. Per facilitare la selezione di soglia, deselezionare tutte le funzionalità fuori il ROI definito: "Modifica" → "Cancella fuori".
      Nota: A questo punto, spesso è meglio fare poche copie dell'immagine: deseleziona ROI facendo clic all'esterno della zona selezionata → fare clic destro su immagine → "Duplicato". Questa azione vi aiuterà a evitare una ripetizione del trattamento immagine sopra descritto se la soglia scelta nel passaggio successivo è insoddisfacente.
   7. Selezionare "Immagine" → "Regolare" → "soglia". Nella finestra di soglia, è possibile utilizzare la barra di scorrimento per scegliere una soglia adeguata. Tutte le zone di resorbed dovrebbero essere sotto la soglia (bianco) e non-resorbed, sopra (rosso). Per finalizzare la selezione di soglia, fare clic su "Applica" nella finestra di soglia.
   8. Salvare l'immagine finale binario: "File" → "Salva con nome" → formato di vostra scelta.
   9. Definire le misure da adottare nella regione di interesse: "Analizzare" → "impostare Measurements". Nella finestra impostare misure, selezionare "Area", "Frazione di zona" e "Limite di soglia" scatole e deselezionare tutti gli altri.
   10. Al fine di ottenere la frazione dell'area "resorbed" direttamente nella finestra dei risultati, invertire l'immagine binaria ("modifica" → "Inverti"). Assicurarsi che il ROI principale sia selezionato nell'immagine binario finale (in caso contrario frazione zona resorbed sarà calcolato basato sulla superficie della finestra immagine intera). Frazione di zona resorbed misura da uno cliccando su "Misura" nella finestra di gestione ROI o su "Analizzare" → "Misurare". Salvare il risultato.

Macchiatura di fosfatasi acida tartrato-resistente è stata utilizzata per visualizzare gli osteoclasti come grandi cellule viola che hanno 3 o più nuclei. Immagini rappresentative degli osteoclasti ottenuti da 264.7 celle grezze coltivate in presenza di RANKL e ioni uranile sono mostrati nella Figura 1. Cambiamenti nel numero e le dimensioni degli osteoclasti in risposta all'uranio sono facilmente visibili in immagini composite di tutta pozzi e in immagini ingrandite.

Dimensione degli osteoclasti è stato analizzato usando il software ImageJ (Figura 2). Per questo scopo, sono state utilizzate immagini di intero-pozzo di trappola macchiato gli osteoclasti e le stesse regioni sono state trattate in ciascun pozzetto di ciascuna condizione di cultura (Figura 2A e 2D). Tutti gli osteoclasti presenti in ogni regione sono stati delineati (Figura 2B e 2E) che ha permesso la determinazione della loro superficie (espressa in µm²) (Figura 2 e 2F). Gli esempi riportati in Figura 2 illustrano l'effetto forte di uranio sulla dimensione degli osteoclasti.

Per studiare l'impatto dell'uranio su attività di riassorbimento degli osteoclasti, 264.7 celle grezze erano placcate e differenziate il piatto di superficie osteomimetic. Alla fine del test, sono stati rimossi gli osteoclasti. Quindi, mimetico superficie ossea in ognuna era trattati bene dal sale sodico Alizarin Red S al fine di macchia zona non riassorbito e immagini di ogni intero bene sono state acquisite (Figura 3A e 3D). Le immagini risultanti sono state elaborate con il software Image J. Sono stati convertiti in immagini in scala di grigi a 8 bit (Figura 3B e 3E), sottoposti a soglia (Figura 3 e 3F) e la zona resorbed (regioni bianche) è stata calcolata automaticamente.

Figura 1: visualizzazione dell'effetto del U(VI) sulla formazione di osteoclasti. Le 264,7 cellule sono state differenziate in presenza la concentrazione indicata di uranile. Al giorno 4, macchiatura di fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP) è stata effettuata. Rappresentante intero-pozzo micrografie (pannelli superiori) Visualizza TRAP-macchiato osteoclasti ottenuti in queste condizioni. Esempi dei osteoclasts multinucleated nelle aree "in box" sono mostrati a un maggiore ingrandimento (frecce nel pannello inferiore). Queste immagini illustrano l'effetto dose-dipendente di U(VI) sulla formazione degli osteoclasti. Frecce nere testa indicano esempi dei nuclei degli osteoclasti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: analisi dell'effetto di U(VI) sulla dimensione degli osteoclasti. (A e D): tutto-bene immagini di osteoclasti con area circoscritta corrispondente alle regioni in cui degli osteoclasti è stato analizzato dimensioni sono indicate. Il rosso scatoline zona (A e D) corrispondono a quelli mostrati in (B) ed (E), rispettivamente. (B ed E): il disegno manuale dei bordi degli osteoclasti nelle due condizioni di uranile-concentrazione è indicato in blu. (C e F): risultato windows da software ImageJ mostrando le misurazioni dalle analisi (B e E) rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: analisi dell'effetto di U(VI) sulla funzione degli osteoclasti. Immagini di alizarina macchiato osteomimetic superficie dopo riassorbimento osteoclastic che ha avuto luogo in assenza (A) o in presenza di 25 µM di uranile (D). Immagini in (A e D) in primo luogo sono state convertite in immagini in scala di grigi a 8 bit come mostrato in (B ed E) e, successivamente, in immagini binarie (C e F) applicando un'impostazione soglia adeguata. Queste immagini binarie sono state utilizzate per calcolare la percentuale di area riassorbito in ogni condizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per quanto sappiamo, questa è la prima volta che una procedura dettagliata con l'obiettivo di studiare l'effetto di uranio naturale sull'osso resorbing cellule è descritto. Questo approccio sarà utile per ottenere una migliore comprensione dell'impatto di uranio sulla fisiologia dell'osso e può fornire un interessante nuovo strumento per lo screening dei chelatori di uranio. Inoltre, riteniamo che potrebbe essere applicato il protocollo descritto qui per studiare l'impatto di altri metalli pesanti su osteoclatogenesis.

È noto che uranile è complessato con componenti inorganici ed organici in terreni di coltura^18,19,20,21. Questi complexations influenzare la speciazione dell'uranio e, in questo modo, la sua citotossicità. Per questo motivo, un passo fondamentale nel protocollo è la preparazione di terreni di coltura contenenti uranio. Precedentemente abbiamo indicato²³ , che la presenza di 5% di siero bovino fetale nel terreno di coltura delle 264.7 celle grezze ha avuto alcun effetto significativo sulla citotossicità di uranile quando usato in concentrazioni che vanno da 0 a 400 µM. Questo è un punto importante, come per analizzare l'effetto di esposizione all'uranio durante l'intero processo di differenziazione osteoclastic è necessaria la presenza di siero nel mezzo. Tuttavia, vogliamo sottolineare che la procedura descritta lungo in due fasi per la preparazione di esposizione media (6 ore) dovrà essere seguita attentamente. Infatti, la fase di incubazione di 3 ore dopo ogni diluizione dei sali di uranile permette la stabilizzazione dei complessi di uranile potenzialmente formata in soluzione prima di ulteriore diluizione o l'esposizione delle cellule. Ciò è assolutamente necessario per ottenere risultati affidabili e riproducibili.

Un altro parametro importante per la riproducibilità delle analisi di differenziazione e riassorbimento degli osteoclasti è la densità di semina del RAW 264,7 cellule. Infatti, esso ha dimostrato che mononucleari precursore densità è un determinante critico per la formazione degli osteoclasti, molto probabilmente perché cellula--cellula vicinanza influenze fusione cellulare eventi²⁴. Quindi, una particolare attenzione deve essere pagato alla cella contando, preparazione di sospensione cellulare e omogeneità della semina in ciascun pozzetto, al fine di evitare errori di interpretazione.

Lo strumento soglia è utile per automatizzare la quantificazione di riassorbimento. Vale la pena sottolineare che questa analisi richiede immagini correttamente illuminati. Tuttavia, un problema comune indipendentemente dal tipo di macchina fotografica e immagine metodo di acquisizione è illuminazione irregolare ai bordi dell'immagine. In tal caso, un metodo di Sogliatura multi-step può essere necessario.

In sintesi, abbiamo stabilito un protocollo robusto che permette lo studio dell'impatto di uranio sulla formazione degli osteoclasti, attuabilità e la funzione. Questa procedura è stata sviluppata utilizzando la linea cellulare RAW 264.7 ma è pienamente applicabile ai precursori degli osteoclasti primario del midollo osseo come abbiamo mostrato²³.

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Gli autori vorrei ringraziare Chantal Cros per assistenza tecnica disponibile.
Questa ricerca è stata finanziata da sovvenzioni dal "Commissariat à l'Energie Atomique et aux energie alternative" (URANOs - programma trasversale de Toxicologie du CEA e CPRR CEA-AREVA) e da ANR (tossicità di uranio: approccio multi-livello di biomineralizzazione elaborare in osso, ANR-16-CE34-0003). Questo lavoro è stato sostenuto anche dall'Università di Nizza Sophia-Antipolis e il CNRS.