Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması

Escherichia'dan denatüre edici olmayan koşullar altında, kodon-optimize edilmiş insan cis- preniltransferazın aşırı ekspresyonu ve saflaştırılması için basit bir protokol Coli , bir enzimatik aktivite tahlili ile birlikte anlatılmıştır. Bu protokol, mekanik çalışmalara uygun miktarda ve kalitede diğer cis- prenyltransferase proteinlerinin üretimi için genelleştirilebilir.

Preniltransferazlar (PT), çoklu yoğunlaşma reaksiyonları yoluyla izopentenil difosfat (IPP) kullanarak allikik difosfatın zincir uzamasını katalize eden bir grup enzimdir. DHPDS (dehidrodiliden difosfat sintaz), farnesil difosfatın (FPP, bir alilikik difosfat) zincir uzamasını izopentenil difosfat (IPP) ile çoklu yoğunlaştırmalar yoluyla katalizleyen bir ökaryotik uzun zincirli cis -PT (yoğunlaşma reaksiyonundan cis çift ​​bağları oluşturur) 'dir. DHDDS, biyomedikal önem taşır çünkü enzimdeki muhafazakar olmayan bir mutasyon (K42E) sonuç olarak retinitis pigmentosa ile sonuçlanır ve sonuç olarak körlüğe yol açar. Dolayısıyla, mevcut protokol mekanik çalışmalar için uygun olan büyük miktarlarda saflaştırılmış DHDDS elde etmek için geliştirildi. Burada, protein füzyonu, optimize edilmiş kültür koşulları ve kodon optimizasyonu, fonksiyonel olarak aktif insan DHDDS'sinin aşırı ekspresyonunu ve saflaştırılmasını sağlamak için kullanıldı. cis- PT'nin homolojisi, bu protokolün, doğal kauçuk sentezinde yer alanlar gibi diğer ökaryotik cis- PT için de uygulanabileceğini önermektedir.

Preniltransferazlar, izopentenil difosfat (IPP) kullanarak alikolit difosfatın zincir uzamasını, çoklu yoğunlaşma reaksiyonları ^{1 , 2} yoluyla katalize eden bir grup enzimdir. Z tipi enzimler, yoğunlaşma reaksiyonundan cis çift ​​bağlarının oluşumunu katalizlerken, E-tipi enzimler, trans çift ​​bağ oluşumunu katalize eder ³ . cis--Prenyltransferases (sis -PT, Z-tipi enzimler) klasik kısa zincirli _(Cı-15), orta-zincirli _(Cı-50-55) içine ürün zinciri uzunluğuna göre sınıflandırılır ve uzun zincirli _(Cı-70-120 ) ⁴ . DHPDS (dehidrodirililik fosfat sentaz), farnesil difosfatın (FPP, bir alilikik difosfat) zincir uzamasını, izopentenil difosfat (IPP) ¹ ile çoklu kondansasyonlar yoluyla katalizleyen bir ökaryotik uzun zincirli cis -PT'dir, ^{5 , 6} . Bu, N-bağlantılı protein glikosilasyonuna ¹ dahil olan glikosil taşıyıcı molekül olan dolichylpyrophosphate için bir öncül olarak görev yapan bir C _55-100 poliprenil difosfat olan dehidrodoliril difosfatın oluşumuyla sonuçlanır. Ashkenazi Yahudileri arasında, DHDDS'deki bir missense muhafazakar olmayan mutasyon (K42E) otozomal resesif retinitis pigmentosa ^{7 , 8 ile} sonuçlanır. Dolayısıyla, mevcut protokol, mekanik çalışmalar için uygun saflaştırılmış DHDDS'yi elde etmek için geliştirildi.

Escherichia coli , rekombinant protein ekspresyonu için en uygun ve uygun maliyetli konak olarak düşünülür ve bu nedenle de en sık kullanılan konakçıdır. Bununla birlikte, bir heterolog olarak E. coli'deki proteinleri aşırı ifade etmeye çalışırsa, proteine ​​spesifik hususlar yapılmalıdır. Düzgün şekilde katlanan aktiviteyi elde etmekE. rekombinant proteinlerin E. coli'den ayrılması, farklı proteinlerin farklı özelliklerinden dolayı basit bir konu değildir. Bu engellerin üstesinden gelmek için sayısız yaklaşım geliştirildi. Burada, protein füzyonunun kullanımı, optimize edilmiş kültür koşulları ve kodon optimizasyonu, E. coli'de işlevsel olarak aktif insan DHDDS'sinin aşırı ekspresyonunu ve saflaştırılmasını sağlamak için kullanıldı. Unutmayın, protein füzyonu olmaksızın maya cis- PT'yi aşırı ifade etme girişiminde bulunmak, deterjan ¹² varlığında bile tam çözünmezlik nedeniyle başarısız olmuştur. Açıklanan protokol, basit, uygun maliyetli, zaman kazandıran ve mekanik çalışmalara uygun DHDDS preparatlarını elde etmeyi sağlar. Farklı türler arasındaki cis- PT homolojisi göz önüne alındığında, bu protokolün diğer ökaryotik cis- PT için de uygulanabileceğini önermekteyiz.

1. E. coli 'de aşırı salgılamasının için sis -PT klonlanması

1. 109aa tioredoksin (TRX) proteini ¹⁷ ile kaynaştırılmış protein dizilerinin klonlanması ve yüksek seviyede ekspresyonu için tasarlanmış pET-32b ifade vektörünü ve tam boy cis -PT'nin E. coli kodon-optimize edilmiş ¹⁸ kodlama dizisini elde edin.
2. TEV-proteaz, bir kısa esnek bir bağlayıcı ile ve ardından (tütün etch virüsü proteaz) parçalama bölgesine ( "/" bölünme noktasını gösterir ENLYFQ / G) ⁹ için özen cis akış yukarı (SGSGSG, yarılma sitesi erişilebilirlik arttırmak için) -PT dizisi (Şekil 1 A). Ayrıca, klonlama için uygun 5 've 3' kısıtlama bölgeleri ekleyin.
3. Standart ligasyon teknikleri kullanılarak sentezlenmiş DNA yapısını pET-32b vektörü içine kopyalayın ¹⁰ .

2. Overexpreİnsan DHDDS'sinin E. coli'de bulunması

1. E. coli T7'i, yetkili hücreleri, üreticinin talimatlarına göre TRX-füzyon DHDDS yapısı ile ifade edin.
2. Dönüştürülen hücreleri, ampisilin seçici koşullar altında (200 mg / L) LB-agar üzerindeki imalatçının talimatlarına göre plakaya yerleştirin.
3. Seçilen kolonileri, 100 mg / L ampisilin ile 250 ml'lik şişeler başlangıç ​​kültürlerinde 100 mL'lik LB ortamına aşılayın ve gece boyunca 200 rpm'de sabit çalkalama ile 37 ° C'de inkübe edin.
4. Kültürün 80 mL'si, her biri, 100 mg / L NaCl ile 1.5 L 2x YT ortamı (16 g / L tripton, 10 g / L maya özütü, 5 g / L NaCl) içeren iki 5 L'lik şişeye (40 mL / şişe) L ampisilin.
5. Kültürü OD _{600 nm} = 0.5'e ulaşana kadar 180 rpm'de sabit çalkalama ile 37 ° C'de inkübe edin.
6. Sıcaklığı 16 ° C'ye indirin ve hücreleri, 0.5 mM izopropil β-D-l-tiogalaktopiranozit (IPTG) ilave ederek indükleyin. aleyhteProtein dozu için 16-20 saat boyunca aynı koşullar altında inkübe edildi.
7. Hücreleri santrifüjle (10 dakika için 10,000 x g ) hasat edin.
   Not: Protokol burada duraklatılabilir; Hücreler pelet arındırılıncaya kadar -80 ° C'de tutulmalıdır.

3. İnsan DHDDS'sinin Arıtımı

1. Hücreleri tampon A'ya (25 mM Tris-HC1, pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.1 Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanol), 1 μg / mL DNase I ve bir proteaz inhibitörü karışımı içine tekrar süspansiyon haline getirin.
2. Bir cam-Teflon homojenleştirici kullanarak hücreleri homojen hale getirin.
3. Hücreleri 12.000 - 15.000 psi'de bir mikrofluidizer veya eşdeğeri kullanarak parçalayın ¹¹ .
4. 4 dakika 40 dakika, 40,000 xg'de hücre lizatı santrifüj ° C. Çözülebilir fraksiyonu içeren süpernatanı alın.
5. Süpernatanı, 5 - 10 mL kobalt hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisine (Co2 ⁺ -IMAC) ¹² sütun üzerine 10Bunu takiben, spesifik olmayan protein bağlanmayı azaltmak için tampon A ve 10 mM imidazol ile iyice yıkanır.
6. Aşırı preslenmiş proteinleri 250 mM imidazol ile takviye edilmiş tampon A ile elute edin.
7. İmidazolü, tampon A ile dengelenmiş 53 mL'lik bir hazırlayıcı tuz giderme sütunu kullanarak çıkarın.
8. 6xHis etiketli TRX füzyon proteinini gece boyunca 4 ° C'de çıkarmak için elüe edilen proteinlere 6xHis etiketli TEV proteaz (50 mg protein başına 1 mg TEV proteaz) ekleyin.
9. Bölünmüş 6x His-etiketli TRX füzyon protein ve TEV proteaz kaldırmak için, 5 mM imidazol ile takviye tampon A ile dengelenmiş bir Co ^{2 +} -IMAC sütun üzerine parçalanmış protein yükleyin.
10. Akışı toplayın ve 30 kDa'lık bir moleküler ağırlıklı kesme santrifüj filtresi kullanarak 3-4 mL'ye konsantre edin.
11. Konsantre proteini, son saflaştırma için tampon A ile dengelenmiş bir süperdeks-200 ebat dışlama kromatografi kolonuna yükleyin. Protein, dimer (~ 76 kDa) olarak akar.
12. Elution profilini bir sütun kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırarak ilgili fraksiyonları seçin.
13. SDS-PAGE kullanarak hazırlığın saflığını değerlendirin.
14. İndirgenmiş deneyler için gereken protein konsantrasyonunu belirleyin ve sıvı nitrojende saflaştırılmış, konsantre proteinlerin küçük miktarlarını dondurun ve kullanana kadar -80 ° C'de saklayın.

4. Analitik Boyut Dışlama Kromatografisi (SEC)

1. Proteinin donma-çözme döngülerine dayanma kabiliyetini sağlamak için donmuş proteinlerin bir kısmını çözdürün ve çözünmeyen agregaları çıkarmak için 10 dakika boyunca 21.000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın.
2. Proteinleri, ultra-performanslı bir sıvı kromatografi sistemi ¹³ kullanarak 25 mM Tris-HC1, pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.02 Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanol ile önceden dengelenmiş bir süper-dex-200 analitik kolona yükleyin ^{, 14} .
3. Triptofan tohumu izleyinProteinlerin elüsyonlu elüsyon profili tespit etmek için scence (λ _ex = 280 nm, λ _em = 350 nm). Moleküler ağırlık değerlendirmesi için geçerli bir kalibrasyon eğrisine sahip olduğunuzdan emin olun - bu eğriler SEC sütun üreticileri aracılığıyla edinilebilir.

5. Enzim Kinetikleri - Zamana Bağlı Faaliyet ^{15 , 16 , 17}

1. 30 ° C - saflaştırılmış proteinin aktivitesini sağlamak için, 22 ° C'de 0.5 mM _MgCl2 ile tampon A içinde reaksiyonu başlatmak için 10 uM FPP ve 50 uM ^14C-IPP ile saflaştırılmış DHDDS 5 uM karıştırın.
   Not: Tam reaksiyon koşulları, DHDDS'den farklı cis- PT'lerin preparatlarına göre değişiklik gösterebilir. Üstelik DHDDS'nin aktivitesi ayrıca sıcaklığa ve [Mg ²⁺ ] bağlıdır.
   Dikkat: ¹⁴ C-IPP radyoaktiftir ve yerel radyasyon güvenlik yönetmeliklerine uygun olarak kullanılmalıdır.
2. 15 μL tampon A ilave edilmiş 20 mM EDTA (10 mM EDTA nihai konsantrasyona) eklenmesiyle reaksiyonun derhal söndürülmesinin ardından 0, 2, 4 ve 6 saat reaksiyondan 15 μL numuneler çıkarın.
3. Ekle 1 ml _H2 iyice reaksiyon ürünleri elde etmek için 1-butanol ve vorteks O-doymuş.
   Not: Protokol burada durdurulabilir ve numuneler daha sonra okunacak şekilde tutulabilir.
4. Numunelere sintilasyon kokteyli ilave edin ve bir sintilasyon sayacı kullanarak, toplam radyoaktiviteyi temsil eden reaksiyon karışımından 15 uL'lik radyoaktivite ile birlikte ¹⁴ C'yi kapsayan bütanol fazındaki reaksiyon ürünlerini nicel hale getirin.
5. Her zaman noktasından 0 saatlik örnekleri kullanarak ölçülen arka plan okumalarını çıkarın ve kullanılan ¹⁴ C-IPP yüzdesini hesaplayın.
6. Toplam ¹⁴ C-IPP katılma oranını her bir zaman noktasında hesaplayın, toplam ¹⁴ C-IPP konsantrasyonları ve sonuçları zamanın bir fonksiyonu olarak çizin. Net ¹⁴ C-IPP katılımının zamanla artması beklenmektedir.

Burada kullanılan yapıya genel bir bakış ve saflaştırma süreci Şekil 1'de gösterilmektedir. Her saflaştırma adımında elde edilen numuneler Şekil 2'de gösterilmektedir. Bu SDS-PAGE analizi, DHDDS'nin kademeli olarak arıtılmasını gösterir ve sonuç olarak yüksek saflıkta bir ürün elde edilir. Şekil 3 , saflaştırılmış enzimin analitik SEC sonuçlarını göstermektedir, bu protein sadece bir homodimer olarak gözlemlenmektedir. Şekil 4 , temsili bir zamana bağlı aktivite tayini göstermektedir. ¹⁴ C-IPP birleşmesi, saflaştırılmış enzimin işlevsel olduğunu doğrulayarak 6 saat boyunca açık şekilde yükselir.

Şekil 1: İnsan DHDDS Klonlama ve Saflaştırma . ( A) Bu çalışmada kullanılan yapı. ( B ) Burada tarif edilen insan DHDDS saflaştırma protokolünün taslağı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: İnsan DHDDS'sinin Saflaştırılması . İnsan DHDDS afiniteli saflaştırma adımlarının SDS-PAGE analizi. Şerit 1, molekül ağırlığı markeri (kDa); Şerit 2, ham özüt; Şerit 3, Co ²⁺ -IMAC akış geçidi. Arrow, TRX-DHDDS füzyon proteinini belirtir; Şerit 4, Co2 ⁺ -IMAC eluatı; Şerit 5, gece boyunca inkübasyonun ardından protein-TEV proteaz karışımı; Şerit 6, Co2 ⁺ -IMAC, TEV parçalanmasını takiben akar; Şerit 7, TEV bölünmesinin ardından Co2 ⁺ -IMAC eluat; Şerit 8, saflaştırılmış insan DHDDS'siBoyutlu eksklüzyon kromatografisini takiben). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: Saflaştırılmış İnsan DHDDS'sinin Analitik SEC'si. Triptofan flüoresan, protokolde tarif edildiği gibi izlendi. Bu kolonun kalibrasyon eğrisine göre, DHDDS bir homodimer oluşturur (77.4 kDa). Ok, boşluk hacmini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4 : TiSaflaştırılmış İnsan DHDDS'sinin bana bağlı Aktivitesi. Saflaştırılmış insan DHDDS'sinin, 10 uM FPP ve substrat olarak 50 uM ¹⁴ C-IPP ile yapılan in vitro aktivitesi, protein başına IPP katılma oranı olarak ifade edilir (mol / mol). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

E. coli hücrelerindeki işlevsel insan DHDDS'sinin saflaştırılması için burada açıklanan protokol, basit ve etkili olup uygun bir yapı elde edildiğinde 3-4 gün içinde proteini fazla ifade ve saflaştırmaya izin verir. Protein saflaştırma için bu gibi protokoller, böylece protein seviyesinde ¹⁹ de patojenik mekanizmalar karakterize etmek için yüksek verimli yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç, bir çok hastalık ^18. genetik ilişkin bilgilerin bolluk mesafede genom sekanslama, içinde deliklerin verilen özel bir öneme sahiptir.

Heterolog protein aşırı ekspresyonunda ve arıtımında sık karşılaşılan tuzaklardan kurtulmak için, çözünür ve fonksiyonel proteinleri başarıyla elde etmek için kritik olan birkaç önlem alınmıştır. Birincisi, DHDDS, bir TRX-füzyonu olarak aşırı eksprese edildi. TRX, füzyon proteini katlanmasını kolaylaştırır ve füzyon proteini çözünürlüğünü arttırır, eklenmeyi engeller. BOdy formation ²⁰ . Ardından, protein verimini artırmak için, DNA yapısı, E. coli ^21'de ekspresyon için kodon optimize edildi. Son olarak, inklüzyon vücudunun oluşma ihtimalini daha da azaltmak için protein sentez oranını düşürmek için proteinin ekspresyonu 16 ° C'de başlatıldı, muhtemelen ²² protein katlanmasına yardımcı oldu.

Farklı türler arasındaki cis- PT homolojisini göz önüne alarak, bu protokolün diğer ökaryotik cis -PT için de uygulanabileceğini önermekteyiz ¹ . Geçerli protokolü bir başlangıç ​​noktası olarak kullanarak ve DHDDS ifadesi için kritik genel talimatlar verilen bu yöntem, farklı cis -PT'lerin optimal ekspresyonu için modifiye edilebilir. Örneğin, farklı füzyon partnerleri (maltoz bağlayıcı protein gibi) denemek veya incelenecek spesifik protein için kültür koşullarını daha da optimize etmek mümkündür.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışma, Yapısal Hücre Biyolojisi (1775/12) 'da İsrail Bilim Vakfı Araştırma Mükemmellik Merkezi (I-CORE) ve İsrail Bilim Vakfı tarafından 1721/16 ve 2338/16 (YH) ve 825/14 (DK) hibeleri ile finanse edildi. ). Fields Estate Vakfı'nın DK'ya desteği çok takdir edilmektedir. Bu çalışma, Ilan Edri ve Michal Goldenberg tarafından Tel Aviv Üniversitesi Sackler Tıp Fakültesi'nin MD tez şartlarının kısmen yerine getirilmesiyle gerçekleştirildi.