인간의 과발현과 정제

에스 케리 치아 (Escherichia )로부터의 비 변성 조건 하에서 코돈 최적화 된 인간 시스 - 프레 닐 전이 효소의 과발현 및 정제를위한 간단한 프로토콜 콜라이 (coli )는 효소 활성 분석과 함께 기술된다. 이 프로토콜은 기계적 연구에 적합한 양 및 품질의 다른 시스 플 닐 트랜스퍼 라제 단백질의 생산을 위해 일반화 될 수 있습니다.

Prenyltransferases (PT)는 다중 응축 반응을 통한 isopentenyl diphosphate (IPP) 를 사용하여 알릴이 인산의 사슬 연신을 촉매하는 효소 군입니다. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase)는 ispenetenyl diphosphate (IPP)와의 다중 축합을 통한 farnesyl diphosphate (FPP, allylic diphosphate)의 사슬 연신을 촉매하는 진핵 장쇄 cis -PT (축합 반응으로부터 cis 이중 결합을 형성 함)이다. DHDDS는 효소의 비 보존 적 돌연변이 (K42E)가 망막염 색소 침착 으로 이어 지므로 궁극적으로 실명으로 이끄는 생물 의학적으로 중요합니다. 따라서, 본 프로토콜은 역학적 연구에 적합한 대량의 정제 된 DHDDS를 얻기 위해 개발되었다. 여기에서, 단백질 융합, 최적화 된 배양 조건 및 코돈 최적화의 사용은 기능적으로 활성 인 DHDDS의 과발현 및 정제를 허용하기 위해 사용되었다. cis -PT의 상 동성은이 프로토콜이 천연 고무 합성에 관여하는 것과 같은 다른 진핵 cis- PT에도 적용될 수 있음을 시사한다.

Prenyltransferases 다중 축합 반응 ^1을 통해 아이소 펜 테닐 다이 포스페이트 (IPP)를 사용하여 알릴 ^{포스페이트, 2} 쇄 신장을 촉매하는 효소 군이다. E 형 효소 트랜스 이중 결합의 ^형성을 촉진하는 반면 ³ Z 형 효소, 축합 반응, 시스 이중 결합의 형성을 촉매. -Prenyltransferases 시스 (시스 -PT, Z 형 효소) 고전 단 체인 (C _15), 중쇄 (C _50-55)에 자신의 제품의 사슬 길이에 따라 분류되며, 장쇄 (C _70-120 ) ⁴ . DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase)는 이소 펜 테닐 디 포스페이트 (IPP) ^1을 이용한 다중 응축을 통해 farnesyl diphosphate (FPP, allylic diphosphate)의 사슬 신장을 촉매하는 진핵 장쇄 cis -PT입니다, ^{5 , 6} . 이것은 dehydrodolichyl 포스페이트의 형성을 초래하는 dolichylpyrophosphate 전구체 N - 결합 글리코 실화 단백질 ^1에 관련된 글리코 캐리어 분자로서의 C _55-100 polyprenyl 인산. Ashkenazi 유태인 중, DHDDS에있는 missense 비 보존 적 돌연변이 (K42E)는 염색체 열성 색소 성 망막염을 초래합니다 ^{7 , 8} . 따라서, 본 프로토콜은 역학적 연구에 적합한 정제 된 DHDDS를 얻기 위해 개발되었다.

Escherichia coli 는 재조합 단백질 발현을위한 가장 편리하고 비용 효율적인 숙주로 여겨지며, 따라서 가장 빈번하게 사용되는 숙주이기도합니다. 그러나 대장균 에서 이종성으로 단백질을 과발현 시키려 할 때, 단백질 특유의 고려가 이루어져야한다. 적절하게 접힌 상태에서 얻음대장균 으로부터의 재조합 단백질은 상이한 단백질의 독특한 특성으로 인해 단순한 문제가 아니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 수많은 접근법이 개발되었습니다. 여기에서, 단백질 융합, 최적화 된 배양 조건 및 코돈 - 최적화의 사용은 대장균 에서 기능적으로 활성 인 DHDDS의 과발현 및 정제를 허용하기 위해 사용되었다. 참고로, 단백질 융합하지 않고 효모 시스의 -PT를 과발현하는 이전 시도조차 세제 ^(12)의 존재에 불용성을 완료 할 예정 실패했습니다. 설명 된 프로토콜은 간단하고 비용 효과적이며 시간을 절약 할 수 있으며 기계 론적 연구에 적합한 DHDDS 준비를 얻을 수 있습니다. 서로 다른 종에서 cis -PT의 상 동성을 고려할 때,이 프로토콜은 다른 진핵 cis- PT에도 적용될 수 있다고 제안한다.

1 . E. coli 에서의 과발현을위한 cis -PT의 클로닝

1. 109aa thioredoxin (TRX) 단백질 ¹⁷ 과 융합 된 단백질 서열의 클로닝 및 고수준 발현을 위해 설계된 pET-32b 발현 벡터 및 대장균 코돈 최적화 된 전장 cis -PT ¹⁸ 코딩 서열을 수득한다.
2. TEV 프로테아제 짧은가요 성 링커 하였다 (담배 식각 바이러스 단백질 분해 효소) 절단 부위 ( "/"는 절단 점을 나타내는 ENLYFQ / G) ⁹ 갖도록주의 시스의 상류 (SGSGSG을 절단 부위의 접근성을 향상시키기) -PT 서열 ( 도 1A ). 또한, 복제에 적합한 5 '및 3'제한 사이트를 추가하십시오.
3. 표준 ligation 기술을 사용하여 합성 DNA 구조를 pET-32b 벡터에 클로닝하십시오 ¹⁰ .

2. 지나치게 높은E. coli 에서의 인간 DHDDS의 절단

1. 제조사의 지시에 따라 TRX- 융합 DHDDS 구조체로 대장균 T7을 형질 전환시킨다.
2. 암피실린 선택 조건 (200 MG / L)하에 LB - 한천에 대한 제조 업체의 지침에 따라 형질 전환 세포를 플레이트.
3. 100 밀리그램 / L의 암피실린과 250 ML 플라스크 스타터 문화의 LB 매체 100 ML에 선택한 식민지를 접종하고 200 rpm으로 일정한 흔들림과 37 ° C에서 하룻밤 incubate.
4. 이 배양액 80 mL를 2 x YT 배지 (16 g / L 트립 톤, 10 g / L 효모 추출물, 5 g / L NaCl) 1.5 L가 각각 함유 된 2 개의 5 L 플라스크 (플라스크 당 40 mL) L 암피실린.
5. OD _{600 nm} = 0.5에 도달 할 때까지 180 rpm으로 일정하게 흔들어 주면서 37 ° C에서 배양합니다.
6. 온도를 16 ° C로 낮추고 0.5 mM 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 세포를 유도하십시오. 범죄자단백질 발현을 위해 동일한 조건 하에서 16-20 시간 항온 처리한다.
7. 원심 분리 (10,000 x g 10 분)에 의해 세포를 수확.
   참고 : 여기서 프로토콜을 일시 중지 할 수 있습니다. 세포 펠릿은 정화 때까지 -80 ° C에서 보관해야합니다.

삼 . 인간 DHDDS의 정제

1. 버퍼 A (25 MM 트리스 - HCL, 산도 7.5, 150 MM NaCl, 0.1 % 트리톤 X - 100, 10 MM β - mercaptoethanol), 1 μg / ML DNase I, 그리고 프로 테아 제 억제제 혼합물에있는 세포를 Resuspend.
2. 유리 - 테플론 균질기를 사용하여 세포를 균질화하십시오.
3. 15,000 PSI ¹¹ - 12,000 마이크로 플루 또는 상응하여 세포를 방해.
4. 4 ° C에서 45 분 동안 40,000 xg에서 세포 용 해물을 원심 분리하십시오. 가용성 분획을 포함하는 상청액을 회수한다.
5. 상층 액을 5 - 10 mL 코발트 고정화 금속 친 화성 크로마토 그래피 (Co ²⁺ -IMAC) ¹² 컬럼에 넣고 10이후에 완충액 A 및 10 mM 이미 다졸로 철저히 세척하여 비특이적 단백질 결합을 감소시켰다.
6. 과잉 발현 된 단백질을 완충액 A로 250 mM 이미 다졸로 보충하십시오.
7. 완충액 A로 평형화 된 53 mL 예비 탈염 칼럼을 사용하여 이미 다졸을 제거한다.
8. 하룻밤 4 ° C에서 6xHis - 태그 TRX 융합 단백질을 제거하기 위해 용출 단백질에 6xHis 태그 TEV 프로 테아 제 (50mg 단백질 당 1mg TEV 프로 테아 제)를 첨가하십시오.
9. cleaved 6x His - 태그 TRX 융합 단백질과 TEV 프로 테아 제를 제거하기 위해 5 MM 이미 다졸로 보충 버퍼 A와 함께 평형 Co ^{2 +} -IMAC 컬럼에 절단 단백질을로드합니다.
10. 30 kDa 분자량 차단 원심 분리 필터를 사용하여 3 ~ 4 mL로 유출액과 농축 물을 수집합니다.
11. 최종 정제를 위해 버퍼 A로 평형화 된 superdex-200 크기 - 배제 크로마토 그래피 컬럼 상에 농축 된 단백질을 로딩한다. 단백질은 이량 체 (~ 76 kDa)로 용리됩니다.
12. 컬럼 분석 곡선과 용출 프로파일을 비교하여 관련 분율을 선택하십시오.
13. SDS-PAGE를 사용하여 준비의 순도를 평가하십시오.
14. 다운 스트림 실험에 필요한 단백질 농도를 결정하고 사용하기 전까지 액체 질소에서 정화되고 농축 된 단백질의 플래시 동결 분취 량을 측정하고 -80 ° C에서 보관하십시오.

4. 분석적인 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)

1. 동결 융해 사이클을 견딜 수있는 단백질의 능력을 보장하기 위해 동결 단백질의 분량을 해동하고 21,000 x g 에서 10 분간 원심 분리하여 불용성 응집체를 제거합니다. 뜨는을 수집합니다.
2. 상 단백질 넣 캅토-200 분석 컬럼 25 mM 트리스 - 염산, pH가 7.5, 150 mM의 NaCl로 미리 평형, 0.02 % 트리톤 X-100, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 초 고성능 액체 크로마토 그래피 시스템 ^{(13)을 사용하여, 14} .
3. 트립토판 플루 오레 모니터scence (λ _ex = 280 nm, λ _em = 350 nm)를 사용하여 단백질의 용출 프로필을 검출합니다. 분자량 평가를위한 올바른 보정 곡선을 가져야합니다. 이러한 곡선은 SEC 컬럼 제조업체 를 통해 구할 수 있습니다.

5. 효소 반응 속도론 - 시간 의존적 활동 ^{15 , 16 , 17}

1. 정제 단백질의 활동을 보장하기 위해 10 μM FPP와 50 μM ¹⁴ C - IPP와 정제 DHDDS 5 μM을 섞어 22 - 30 ° C에서 0.5 MM MgCl ₂ 와 버퍼 A의 반응을 시작합니다.
   참고 : 정확한 반응 조건은 DHDDS와는 다른 cis -PT의 준비에 따라 다를 수 있습니다. 또한, DHDDS의 활성도는 온도와 [Mg ²⁺ ]에 따라 달라집니다.
   주의 : ¹⁴ C-IPP는 방사성 물질이므로 해당 지역의 방사선 안전 규정에 따라 사용해야합니다.
2. 0, 2, 4 및 6 시간에 반응에서 15 μL 샘플을 철회 후, 15 밀리 버퍼 A 보충 20 MM EDTA (10 MM EDTA의 최종 농도)의 추가로 반응의 즉각적인 급냉 다음.
3. H ₂ O가 포화 된 1- 부탄올 1 mL를 넣고 충분히 소용돌이 칠하여 반응 생성물을 추출한다.
   참고 : 여기서 프로토콜을 중지하고 샘플을 나중에 읽을 수 있도록 보관할 수 있습니다.
4. 샘플에 신틸레이션 칵테일을 넣고 신틸레이션 카운터를 사용하여 총 방사능을 나타내는 15 μL의 방사능과 함께 ¹⁴ C를 포함하는 부탄올 단계의 반응 생성물을 정량하십시오.
5. 각 시점에서 0 시간 샘플을 사용하여 측정 된 배경 판독 값을 뺀 후 ¹⁴ C-IPP의 백분율을 계산합니다.
6. ¹⁴ 개의 이용 비율을 계산하여 각 시점에서의 네트 ⁽¹⁴⁾ C-IPP 혼입 계산 14 C-IPP 통합의 증가가 예상된다.

여기에 사용 된 구조 및 정제 과정에 대한 일반적인 개요가 그림 1에 나와 있습니다. 각 정제 단계에서 얻은 샘플을 그림 2 에 나타냈다 . 이 SDS-PAGE 분석은 DHDDS의 단계적 정제를 보여줌으로써 매우 정제 된 제품을 생성합니다. 도 3 은 정제 된 효소의 SEC 분석 결과로서, 단백질이 동종이 량체로만 ​​관찰된다는 것을 나타낸다. 그림 4 는 대표적인 시간 의존 활성 분석을 보여줍니다. ¹⁴ C-IPP 혼입은 6 시간 이상 명확하게 상승하여 정제 된 효소가 기능적임을 입증한다.

그림 1 : 인간 DHDDS 클로닝 및 정제 . ( A)이 연구에서 사용 된 구조. ( B ) 여기에 설명 된 인간 DHDDS 정화 프로토콜의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 인간 DHDDS의 정제 . 인간 DHDDS 친 화성 정제 단계의 SDS-PAGE 분석. 레인 1, 분자량 마커 (kDa); 레인 2, 조 추출물; 레인 3, Co2 ⁺ -IMAC 플로우 스루. 화살표는 TRX-DHDDS 융합 단백질을 나타내고; 레인 4, Co2 ⁺ -IMAC 용출액; 레인 5, 밤새 배양 후 단백질 -TEV 프로테아제 혼합물; 레인 6, TEV 절단 후 Co2 ⁺ -IMAC 플로우 스루; 레인 7, TEV 절단 후 Co2 ⁺ -IMAC 용출액; 레인 8, 정제 된 인간 DHDDS (indic화살표로 표시) 크기 배제 크로마토 그래피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : 정제 된 인간 DHDDS의 분석 SEC. 트립토판 형광을 프로토콜에 기술 된대로 모니터링 하였다. 이 칼럼의 보정 곡선에 따르면, DHDDS는 호모 다이머 (homodimer) (77.4 kDa)를 형성합니다. 화살표는 보이드 볼륨을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : Ti나에게 의존적 인 인간 DHDDS의 활동. 10 μM FPP 및 50 μM ¹⁴ C-IPP를 기질로하는 반응에서 정화 된 인간 DHDDS의 시험 관내 활성은 단백질 당 IPP 혼입 (mol / mol)으로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

E. coli 세포에서 기능성 인간 DHDDS를 정제하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 간단하고 효율적이어서 적절한 구조가 사용 가능 해지면 3-4 일 내에 단백질을 과발현하고 정제 할 수 있습니다. 단백질 정제를위한 그러한 프로토콜은 많은 질병 ¹⁸ 의 유전학에 관한 정보의 과다한 정보를 제공하는 게놈 시퀀싱의 돌파구를 고려할 때 특별한 의미가 있습니다. 따라서 단백질 수준 ¹⁹ 에서 병원성 메커니즘을 특성화하기위한 높은 처리량 방법의 개발이 필요합니다.

이종 단백질의 과발현과 정제에서 흔히 나타나는 함정을 극복하기 위해 여기에 몇 가지 조치가 취해졌으며, 이는 수용성 단백질과 기능성 단백질을 성공적으로 얻는 데 중요합니다. 첫째, DHDDS는 TRX 융합체로서 과발현되었다. TRX는 융합 단백질 폴딩을 촉진하고 융합 단백질 용해도를 증가 시켜서 포유 동물 b조형물 ²⁰ . 다음으로, 단백질 수율을 증가시키기 위해, DNA 작 제물은 대장균 ²¹ 에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 마지막으로, 상기 봉입체 형성의 가능성을 줄이기 위해, 단백질의 발현 가능성 ²² 단백질 ^폴딩을 돕는 단백질 합성 속도를 천천히 16 ℃로 유도 하였다.

고려 다른 종 사이 시스 -PT의 상 동성을 가지고 가서, 우리는이 프로토콜은 다른 진핵 시스에 적용 할 수 있음을 -PT뿐만 아니라 ¹ 건의한다. 현재의 프로토콜을 출발점으로 사용하고 DHDDS 발현에 중요한 일반 지침이 주어지면,이 방법은 다른 cis -PT의 최적 발현을 위해 변형 될 수 있습니다. 예를 들어, 다른 융합 파트너 (예 : 말 토스 결합 단백질)를 시도하거나 연구 할 특정 단백질에 대한 배양 조건을 최적화 할 수 있습니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 작품은 이스라엘 과학 재단 재단 연구 센터 (I-CORE)의 구조 세포 생물학 (1775/12)과 이스라엘 과학 재단 보조금 (1721/16과 2338/16) (YH)과 825/14 (DK ). DK에 대한 Fields Estate Foundation의 지원은 높이 평가됩니다. 이 연구는 Ilan Edri와 Michal Goldenberg가 Tel Aviv University의 Sackler 의학부의 MD 논문 요구 사항을 부분적으로 이행함으로써 수행되었습니다.