İpek Nanopartiküller imalatı ve İlaç Dağıtım Uygulamaları

Nanopartiküller endikasyonlar geniş bir aralığı için ümit vaadeden bir ilaç sağlama sistemlerini ortaya çıkmaktadır. Burada, ters mühendislik ipek böceği ipek kullanılarak ipek nanopartiküller üretmek için basit ama güçlü bir yöntem açıklanmaktadır. Bu ipek nanopartiküller terapötik bir yük ile yüklenen ve daha sonra ilaç dağıtım uygulamaları için keşfedilebilir.

İpek nedeniyle üstün mekanik özellikleri, biyouyumluluk ve biyobozunurluk yanı sıra bir tetikleyici cevaben korumak ve daha sonra onun yükü bırakmak için yeteneği biyomedikal ve ilaç uygulamaları için umut verici bir biyopolimerdir. İpek çeşitli malzeme biçimleri halinde formüle edilebilir olsa da, ipek nanopartiküller olarak ümit vaadeden bir ilaç sağlama sistemlerini ortaya çıkmaktadır. Bu nedenle, bu makale, stabil ipek nano-tanecikleri oluşturmak için kullanılabilen bir yeniden ipek bir solüsyon elde ters mühendislik Koza işlemleri kapsar. Bu nanopartiküller, daha sonra karakterize edilir, ilaç yüklü ve potansiyel bir anti-kanser ilaç verme sistemi olarak incelenmiştir. Kısaca, ipek kozası ters, koza gam giderme ilk tasarlanmış ipek çözülme takip ve sulu ipek solüsyon elde, temizlemek edilir. Sonraki, rejenere ipek çözüm ipek nanopartiküller elde etmek nanoprecipitation tabi tutulur - basit ama güçlü bir yöntemBu üniforma nanopartiküller üretir. İpek nanopartiküller, boyut, zeta potansiyeli, sulu ortam içinde morfolojisi ve dayanıklılığı gibi bir kemoterapötik yükü tuttuğu ve insan göğüs kanser hücrelerini öldürmek için kabiliyetlerine göre karakterize edilir. Genel olarak, açıklanan metodoloji potansiyel nanotıpta olarak kullanımları da dahil olmak üzere kolayca uygulamalar sayısız için keşfedilmeyi olabilir üniforma ipek nanopartiküller, verir.

örneğin proteinler, peptidler ve küçük molekül ağırlıklı ilaçların - - hücreleri ve dokuları hedef nano-boyutlu ilaç verme sistemleri genellikle ilaç salımını kontrol etmek ve tedavi yükleri çeşitli bir dizi elde etmek için kullanılabilir. Bu terapötik yükleri genellikle lipozomlar, (dendrimerler de dahil olmak üzere) suda çözülebilen polimerler, mikro ve nanopartiküller ¹ gibi çeşitli makromoleküler ilaç taşıyıcıları içine dahil edilmiştir. (Tipik olarak 1 nm ile 1000 arasında bir boyut aralığında) Nanopartiküller yaygın olarak, özellikle anti-kanser ilaç verme ^2, potansiyel ilaç taşıyıcıları olarak araştırılmaktadır. Ilaç dağıtım için çok daha fazla nanopartiküller artık klinik denemeler ⁴ giriyoruz böylece rutin klinik uygulamaya ³ içine Abraxane başarılı tanıtım (120 nm büyüklüğünde albümin tabanlı nanopartiküller paklitaksel ile yüklü), alan katalize etmiştir. Solid tümörler genellikle o n anlamına gelir kötü lenfatik drenajı göstermek ve sızan kan damarları var200 nm ye kadar anoparticles pasif intravenöz uygulamayı takiben bu tümörler hedeflenecektir. Bu pasif hedef olay gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkisi olarak adlandırılır ve ilk olarak 1986 ⁵ bildirilmiştir. EPR etkisi, belirli bir ilaç dozu için ne zaman tümör mikro olan ilaç konsantrasyonlarında bir 50- ila 100-kat artışa yol açabilir ilaç yük taşıyıcı olmadan bir makromoleküler ilaç taşıyıcı yaklaşımı yerine ücretsiz ilaç kullanılarak teslim edilir. Anti-kanser ilaç verilmesi için tasarlanan ilaç yüklü nano parçacıklar tümör mikro ulaşmak ve ilacın arzu edilen terapötik etkiyi elde etmek için ³ Çoğu zaman, genellikle, endositik alımı ile, belirli bir hücre içi bölüm girmelidir. hücre içi ilaç verilmesi için tasarlanmış nanopartiküller hücre içine ağ geçidi yanı sıra ilaç direnç mekanizmalarını aşmak için bir yol olarak endositoz istifade eder. nanopartiküller gelen ilaç salım sık sık özellikle o şekilde tasarlanmıştırnanoparçacık taşıyıcı pH yanıt (lizozomal pH yaklaşık 4.5) taşıyıcı ^7'den yükü kurtarmak ilaç salım veya lizozomal enzimler için tetikleyici olarak hizmet verebilir lizozomlarında CCur (yani, lysosomotropic ilaç dağıtım) ^6.

Malzemelerinin çoğu farklı sınıflar nano-tanecikleri (örneğin, metal ve bir çok organik ve inorganik maddelerin) oluşturmak için kullanılabilir. Ancak, biopolimerler nedeniyle bilinen biyouyumluluk, biyobozunurluk ve düşük toksisite ⁸ çekici malzemeler ortaya çıkmaktadır. Birçok biyopolimerler albümin, aljinat, kitosan ve ipek gibi araştırılmaktadır. Bunlardan, ipek ilaç verme sistemleri ^9'a gelişmesi için ümit veren bir rakip olarak ortaya çıkmıştır. Çeşitli ipek (örneğin, Bombyx mori) (ör Nephila clavipes) örümcekler ve ipek böcekleri içeren eklembacaklılara, bir dizi ile üretilir. Ipek böceği ipek çok daha ilavelere kullanılanğı örümcek ipekten daha ipekböceği tamamen evcilleştirilmiş çünkü ve ipek böylece tekrarlanabilir başlangıç ​​malzemesinin temsil eder. İpekböceği ipek bir Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) özellikle dikiş malzemesi olarak beşeri, için malzeme onaylanmıştır; İnsanlarda, bir güvenlik kaydı olduğunu ve in vivo ¹⁰ degrade olduğu bilinmektedir. ipek bozulması profili 12 ay ya da daha fazla (yüksek kristal ipek) saat (düşük kristalli ipek) aralığında ince ayarlanmış olabilir. İpek parçalanma ürünleri toksik olmayan ve vücutta ¹⁰ metabolize edilir. Ipek yapısı kontrollü ilaç serbest bırakılması için iyi bir malzeme yapma, düşük moleküler ağırlıklı bileşikler ve makromoleküler protein ilaçları ¹¹ bağlanma yeteneğini kazandırır. Protein ilaçlar (örneğin, antikorlar) bağışıklık sistemi tarafından denatürasyon, toplama, proteolitik bölünme ve temizlik duyarlıdırlar. Ancak, ipek dolayı nanokristal yeniden tamponlama kapasitesine terapötik proteinler stabilizegions ve nano ölçekte ¹¹ su içeriğine terzi yeteneği. Bu benzersiz özellikleri, fiziksel koruma sağlar ve yük hareketliliği ¹¹ azaltmak ve genellikle diğer (biyo) polimerler ile görülmez. Örnek ipek tabanlı hidrojellerin ^12, filmler ^13-15 ve nanopartiküller ^16,17 Birçok antikanser ilaç taşıyıcı sistemler, şimdi ^(18,19 referanslar gözden) bu özellikleri yararlanmak için geliştirilmiştir

Burada, ipek nanopartiküller, uzun bir zaman dilimi içinde boyut ve yükleri belirlenmesi ile karakterize edilmiştir. Doksorubisin, klinik olarak anlamlı bir anti-kanser ilaç, ilaç yüklü ipek nanopartiküller ile tedavi edilen üç negatif insan meme kanseri hücrelerindeki ilacın yükleme ve sitotoksisite çalışmaları için model bir ilaç olarak kullanılmıştır.

Ipek böceği Koza Bir Ters-mühendislik İpek Çözüm 1. Hazırlık

NOT: Bu yöntem başka bir yerde ^12,27 açıklanan protokollere dayanmaktadır.

1. 5 mm x 5 mm parçalar halinde makasla kurutulmuş koza 5 g kesin. herhangi bir kirli katmanları kaldırın.
2. sodyum karbonat 4.24 g tartılır ve damıtılmış su kaynar 2 L dikkatlice ilave edin.
   Not: Bu, 0.02 M sodyum karbonat çözeltisi elde edilir.
3. kaynar sodyum karbonat çözeltisi ile kesme koza parçaları ekleyin ve 60 dakika ipek lifleri DEGUM için kaynatın. homojen numune işlenmesini sağlamak için bazen ipek karıştırın.
4. gamı giderilmiş ipek çıkarın ve 20 dakika için damıtılmış su, 1 L ile yıkayın; yıkama aşaması, en azından 3 kez tekrarlayın.
5. yıkanmış ipek çıkarın ve aşırı sıvı kaldırmak ve sonra çöz / elle ipek çekmek için iyice sıkıp. Kuru gecede havalandırmak için bir davlumbaz çözdü ipek yerleştirin. Bu, tipik olarak viskozitesi giderilmiş s 3.6 g elde edilirilk elyaf.
6. Sonraki gün, 5 g hava ile kurutulmuş gamı ​​giderilmiş iplikleri tartılarak 50 ml'lik bir cam kaba alt kısmına sıkıca ipek paketi.
7. taze bir 9.3 M LiBr çözeltisi hazırlayın. 4 ml LiBr oranı 1 gr ipek kullanılarak LiBr ipek lifleri eritin. buharlaşmasını önlemek ve ipek tam 60 ° C çözünmesi için alüminyum folyo ile ipek LiBr örnek kapak. Bu adım 4 saat kadar sürer ve ara sıra karıştırarak destekli olduğunu.
8. 5 dakika boyunca su içinde bir diyaliz kaseti (3500 Da molekül ağırlıklı bir kesim) ıslatın. 15 enjekte ml, 15 ml diyaliz kaset içine ipek LiBr çözümü ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için bir iğne ve şırınga kullanın.
9. Damıtılmış su, 1 L karşı diyaliz ve (örneğin, ilk gününde 3 değişiklikleri) ve daha sonraki sabah ve akşam (yani, 2, ikinci gün değişiklik) ve tekrar 1, 3 ve 6 saat sonra su değiştirmek Ertesi sabah (üçüncü gün, yani 1 değişim).
10. ipek soluti toplayındiyaliz kaseti ve santrifüj 9,500 x g'de, 5 ° C'de 20 dakika süre ile çözelti itibaren. süpernatant kurtarmak ve iki kez daha bu santrifüj işlemi tekrarlayın.
11. Boş tartı tekne (W1) ağırlığını belirlemek ve ipek solüsyonu 1 ml ekleyin. Tekrar (W2) ağırlığı kaydetmek ve daha sonra gece boyunca 60 ºC'de tartı tekne bırakarak örnek kurutun. Sonraki, toplam kuru ağırlığı (W3) (kurutulmuş ipek ve tartı tekne) belirler. İpek çözeltisinin konsantrasyonu (ağırlık / hacim) 'dir:% = (W3-W1 / W2-W1) x 100.

Ters-mühendislik İpek Çözüm İpek Nanopartiküller 2. Hazırlık

1. a>% 75 (h / h) aseton çözeltisi korurken ipek çözeltisi damla damla (w / v) aseton% 5 ekleyin. Örneğin, bir% 5 9 ml ekleyin (a / h), ipek çözeltisi damla damla 34 mL aseton (50 damla / dakika hızda 10 ul / damla).
2. 4 ° C'de 2 saat süre ile 48.000 x g'de çökelti santrifüjleyin.
3. Süpernatantı aspire ve Pelle tekrar süspansiyonilk olarak bir spatula ile pelet yerinden ayrılmasını ve daha sonra 20 ml distile suya eklenerek damıtık su içinde t. spatula gelen pelet kaldırmak için pipet ipuçlarını kullanın. , 30 saniye için% 30 genliğinde bir ultrasonik sonda kullanılarak iki sonikasyon döngü izledi 20 sn için damıtılmış su ile kapasitesine santrifüj tüpü üstünü vorteks sonra.
4. en az iki kez santrifüj ve tabanda adımı yineleyin.
5. kullanılana kadar 4 ° C 'de 2.3 ile deposu ayrıntılı olarak, damıtılmış su 6 ml pelletini. Hücre kültürü çalışmaları için, ipek nanoparçacık stokları gama ¹⁷ ışınlanmış olabilir.

İpek Nanopartikül Konsantrasyon 3. Belirlenmesi

1. 4 ° C'de 2 saat süre ile 48.000 x g santrifüj ipek nanopartiküller.
2. 30 saniye için% 30 genlik iki sonikasyon döngü izledi damıtılmış su, 3 ml, tüm nano-tanecikleri toplamak.
3. 2 ml ve 1 ml sürü içine ipek nanopartiküller 3 ml stok bölün ve pr aktarmak2 ml tüpler e tartılmış. 2 mi numunenin toplam ağırlığı kaydedilir. kullanılana kadar 4 ° C 'de, 1 ml çok saklayın; Bu 1 ml örnek bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanılır.
4. Daha sonra Yapış dondurma ve bir gecede bir dondurarak kurutma 2 ml ipek nanopartikül çok liyofilize. dondurularak kurutulduktan sonra, 2 mi tüp tekrar tartılır ve 2 ml numune içinde orijinal olarak mevcut olan ipek nanopartiküller (mg) miktarını hesaplayın.
5. 5-noktalı bir kalibrasyon eğrisi (0,04-7 mg / ml) üretmek için damıtılmış su ile 1 mi ipek nanopartikül stokunu. Numuneler absorbans maksimum aşmamasına dikkat edin.
6. 600 nm'de her bir standart dilüsyon absorbansı belirler. Bu en iyi, 96 oyuklu bir plaka ortamında kullanılarak yapılır. Standart eğri için konsantrasyonu (mg / ml) karşı Parsel emme. Daha sonra süspansiyon ipek nanopartiküllerin konsantrasyonunu belirlemek için rutin olarak, bu standart eğri kullanımı.

Doksorubisin yüklü İpek Nanopartiküller 4. hazırlanması

1. Doksorubisin Çözüm hazırlanması
   1. damıtılmış su, 8 ml doksorubisin HCl 1.2 mg çözülür.
   2. 116 ug / ml (0.2 umol / ml) oluşan bir çalışma stokları elde etmek için distile su ile 10 ml'ye tamamlanır.
2. Doksorubisin yüklü İpek nano partiküllerin hazırlanması
   1. 10, 30 ya da 50 mg / 2 ml tüp ipek nanopartiküllerinin ml 200 ul 0.2 umol / ml doksorubisin çözeltisi 2 ml karıştırın.
   2. döner bir karıştırıcıda (25 ° C), gece boyunca, oda sıcaklığında, ipek-doksorubisin süspansiyon inkübe edin.
   3. Daha sonra, 30 dakika süre ile 194.000 x g'de, ipek-doksorubisin süspansiyon santrifüj. damıtılmış suyla doksorubisin yüklü ipek nanopartiküller yıkayın ve iki kez daha bu işlemi tekrarlayın.
   4. (Bu örnek kapsülleme etkinliğini belirlemek için kullanıldı) süpernatant Havuz ve toplam hacmin not edin.
   5. , Distile su ile doksorubisin yüklü ipek nanopartiküller yeniden süspanse 4 ºC un ışık ve mağaza korumakKullanım til.
3. Kapsülleme Verimliliği ve İlaç Yükleniyor Belirlenmesi
   1. Pipet siyah mikrotiter plakası içine adım 4.2.4 Çökelti 200 ul.
   2. Sabit photomultiplier ayarında doksorubisin ile ilişkili floresan ölçmek için bir floresan mikroplaka okuyucu kullanın.
   3. 590 nm 485 nm ve emisyon dalga boyu dalgaboyu ayarlayın ve floresan değerleri kaydedin.
   4. Bir doksorubisin kalibrasyon eğrisi oluşturun. Emin olun ölçümler (sabit photomultiplier ayarıyla yani) aynı enstrüman ayarları ile elde edilir. Kalibrasyon eğrisi kullanılarak birleştirildi süpernatan içinde doksorubisin konsantrasyonunun hesaplanması. Üç bağımsız deney bu ölçümü tekrarlanır.
   5. kapsülleme etkinliğini belirlemek için denklem (1) kullanın:
      

İpek Nano 5. Karakterizasyonuparçacıklar

1. Taze hazırlanmış ve saklı İpek Nanopartiküller boyutu ve Zeta Potansiyelinin Belirlenmesi.
   1. 4 ° C ve 25 ° C sıcaklıkta bulunan damıtılmış suyun saklayın ipek nanopartiküller.
   2. dinamik ışık saçılımı (DLS) ile 0, 14 ve 28. ipek nanopartiküllerin büyüklüğü ve zeta potansiyeli ölçülür. Protein ¹⁷ distile su ve 1.33 1.60 kırılma indisine ayarlayın. Kullanıcı arayüzü yazılımı ile partikül boyutlarını hesaplamak.
2. Taramalı Elektron Mikroskobu İpek Nanopartiküller Morfolojik Değerlendirmesi (SEM).
   1. bir SEM kütüğü üzerine bir karbon yapışkan disk yerleştirilir ve sonra bir silikon gofret ekleyin.
   2. 1 mg / ml'lik bir konsantrasyona ipek nano-tanecikleri ile seyreltilir. Pipet silikon göbeğin üzerine örnek 10 ul, -80 ° C'de örnek dondurma ve gece boyunca üretici talimatlarına göre bir dondurarak kurutma sistemi kullanılarak liyofilize edin.
   3. Coat bir altın numune 20 nm kalınlığında kadar katmandüşük vakum püskürtmeli kaplayıcı kullanılarak.
      NOT: Cihaz ayarları modelleri arasında değişir. Burada kullanılan model, tam otomatik ve sadece kalınlığı ile çalışır.
   4. 5 kV taramalı elektron mikroskobu ve 40.000 kat büyütme ile görüntü örnekleri.

Kontrol vitro ve Doksorubisin yüklü İpek Nanopartiküller 6.

1. İpek Nanopartiküller Maruz ardından Hücre Canlılık.
   1. % 10 h / h FBS ile RPMI 1640 kültür MDA-MB-231 hücreleri. Doku kültürü plakası hücreleri polistiren işlemden geçirildi ve 37 ° C'de nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 atmosferinde inkübe edin. Rutin 2-3 günde% 80 izdiham altkültürü.
   2. 96 oyuklu plakalar içinde 2 x 10 ⁴ hücre / ^cm2 yoğunluğunda, MDA-MB-231 hücreleri Plate. Hücreler bir gecede kurtarmak için izin verin.
   3. ug serbest yayılabilir doksorubisin 0.001-1: (i) ekleyin, (ii) 0,001-0,5 mg ipek nanopartiküller ve 0,1 mg ipek nanopartiküller96 oyuklu plakalar (Nihai hacmi, oyuk başına 100 ul) içerisine ug doksorubisin 0.001-1 ile yüklendi.
   4. Hücre canlılığı ve (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromid, PBS içinde (MTT 5 mg / ml) 72 saat ilave yarım maksimal inhibisyon konsantrasyonunu _(IC50) hesaplanır. Inkübe 5 saat için, dikkatli bir şekilde bir pipet ile kuyu boşaltın ve dimetilsülfoksit 100 uL formazanın eritilmesi. 560 nm'de absorbansı ölçülür., üç bağımsız deneyin bu ölçümü tekrarlanır.
      NOT: muamele edilmemiş kontrollerin absorbans değerleri% 100 hücre canlılığı için bir referans değeri olarak kullanılır.
2. İpek Nanopartiküller Maruz Hücreler SEM.
   1. 2 x 10 ⁴ hücre / ^cm2 yoğunluğunda, steril cam lameller üzerine Tohum MDA-MB-231 hücreleri. Hücreler bir gecede kurtarmak için izin verin. 72 saat süre ile, istenen tedavi koşullarına hücreleri Açığa.
   2. di ile yıkayın, 30 dakika boyunca PBS içinde% 2 h / h glutaraldehid ile hücreleri saptamakstilled su iki kez, bir etanol serisi ile kurutmak, ve başka bir yerde ²⁸ açıklandığı gibi kritik nokta, örnekleri kurulayın.
   3. Bir altın numuneler kalınlığında düşük vakum püskürtmeli kaplayıcı kullanılarak 20 nm'ye kadar katman ceket sputter.
      NOT: Cihaz ayarları modelleri arasında değişir. Burada kullanılan model, tam otomatik ve sadece kalınlığı ile çalışır.
   4. Resim 5 kV ve 700 kat büyütme bir elektron ivme kullanarak SEM ile örnekler.

Daha önce ¹⁷ ayrıntılı olarak Veriler istatistiksel olarak analiz edildi. Student t-testi, çok sayıda numune için Bonferroni çoklu karşılaştırma post-hoc testi ile takip örnek çiftleri ve varyans analizi (ANOVA) Tek yönlü analizi için kullanıldı. aşağıdaki gibi bir yıldız istatistiksel anlamlılık gösterir: * p <0.05 ve ** p <0.001. Tüm veriler, bağımsız deney sayısını belirtir, standart sapma (SD) ve parantez içinde sayılar ± ortalama değerler olarak sunulmaktadır.

Rejenere ipek çözeltisi hazırlanır ve daha sonra nanoprecipitation ile ipek nano-tanecikleri (Şekil 1) üretilmesi için, aseton, damla damla ilave edildi. Bu yöntem (polidispersite endeksi: 0.1) üniforma vermiştir negatif yüzey yükü ile, küresel, ipek nanopartiküller (1.1 ± 106.5 nm) (-49,57 mV ± 0.6) (Şekil 2 ve 3). İpek nanoparçacık stSuda yeteneği parçacıklar boyut, zeta potansiyelini ve şekil (Şekil 2 ve Şekil 3) izleyerek için 28 gün süre ile değerlendirildi. 28 günlük bir depolama süresi boyunca, 4 ° C veya 25 ° C, ya da partikül boyutu, şarj (Şekil 2) ya da morfolojisi önemli bir değişiklik (Şekil 3) görülmüştür.

Doksorubisin ilaç yüklemesi için klinik olarak kemoterapötik bir model bir ilaç olarak ve in vitro sitotoksisite çalışmalarında kullanılmıştır. Üç farklı ipek nanopartikül konsantrasyonları (10, 30 ve 50 mg / ml), ipek nanopartiküllerin ilaç yükleme kapasitelerinin değerlendirilmesi için kullanılmıştır. 10, 30 ve 50 mg / ml, ipek nanopartiküller için doksorubisin Kapsülleme verimliliği (yani, 2, 6 veya ipek 10 mg ve doksorubisinin 232 ug), sırasıyla 73 ± 2.2, 87 ± 1.8 ve 97 ±% 0.2, (Şekil 4A idi ). parçacık büyüklüğü ve doksorubisin-lo zeta potansiyeliAded ipek nanopartiküller (10 mg), ölçüldü ve 10 mg ipek nanopartikül kontrol ile karşılaştırılmıştır. Doksorubisin yüklü ipek nanopartiküllerinin zeta potansiyeli önemli ölçüde 43.52 ± 0.37 mV (Şekil 4C) için 49.57 ± 0.6 mV ile azalmış ve bu da partikül boyutu, ilaç yüklemesi (Şekil 4B) sonra değişmedi.

Kanser hücrelerini doksorubisin sunmak ve daha sonra öldürmek için ilaç yüklü ipek nanopartiküllerin yeteneği in vitro olarak değerlendirildi. İnsan meme kanseri MDA-MB-231 hücreleri, ipek nanopartiküller, serbest yayılabilir doksorubisin veya doksorubisin yüklü ipek nanopartiküller maruz bırakıldı. Hücre canlılığı, 72 saat maruz bırakma süresi sonra değerlendirildi. Serbest yayılabilir doksorubisin ve doksorubisin yüklü ipek nanopartiküllerinin _IC50 değerleri ipek nanopartiküller bir _IC50> 5 mg / ml (Şekil 5A) sahip, sırasıyla ise, 0.48 ug / ml ve 0.24 ug / ml idi.0.1 ug eşdeğer madde dozlarda serbest yayılabilir doksorubisin ve doksorubisin yüklü ipek nanopartiküller, sırasıyla 83 ± 11 ve 65 ±% 11, (Şekil 5B) hücre ömrü önemli azalmalar neden oldu. Bununla birlikte, serbest yayılabilir doksorubisin, doksorubisin-yüklü ipek nanopartiküller daha büyük daha büyük bir sitotoksisite göstermiştir. Bu nicel ölçümler nitel SEM görüntüleme (Şekil 5c) tarafından doğrulanmıştır. Burada, kontrol kültürleri yüksek hücresel bir yoğunluğa ve hakim mezenkimal, MDA-MB-231 fenotip gösterdi; Benzer gözlemler, ipek nanopartiküller maruz kültürler için yapıldı. Bununla birlikte, doksorubisin maruz kültürler belirgin bir şekilde farklı hücre fenotipi göstermiştir. eş doksorubisin dozda MDA-MB-231 hücreleri serbest yayılabilir doksorubisin ve doksorubisin yüklü ipek nanopartiküller ile tedavi edilen hücre sayıları önemli bir azalma göstermiştir. Ayrıca, birçok hücre çok geniş vardı ve morfolojisi yayıldı. kültürler expdoksorubisin yüklü ipek nanopartiküller osed plazma zarı (Şekil 5C) ile ilişkili nanopartiküller (ve agregalar) kanıt göstermiştir.

Şekil 1: Önemli adımlar ters mühendislik ipek çözümü ve ipek nanopartiküller oluşturmak için Birincisi, ipek kozası ters degummed ipek lifleri elde etmek (yani, kaynar) 60 dakika için gam giderme sonra onları kesip tarafından tasarlanmıştır.. elyaflar 9.3 M LiBr içerisinde çözündürüldü ve daha sonra 72 saat suya karşı diyaliz edilmiştir. h ipek çözeltisi w / sulu% 5 ipek nano-tanecikleri oluşturmak için kullanılır. aseton içine ipek damla damla ilavesi ipek nanoprecipitation yol açar. İpek nanopartiküller yıkanır ve daha sonraki kullanım için toplamak vardır. Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızrakam.

Şekil 2:. Boyutu ve ipek nanopartiküllerin şarj karakterizasyonu parçacık boyutu ve 4 ° C 'de ipek nanopartiküller zeta potansiyeli ve 28 gün boyunca 25 ° C. SD ±; hata çubukları arsa sembolü içinde gizlidir zaman görünmez, n = 3 , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:., 4 ° C ve 25 ° C'de saklandı ipek nanopartiküllerin kalite değerlendirmesi 28 gün boyunca İpek nanopartiküller taramalı elektron mikroskobu kullanılarak görüntülendi (Ölçek çubuğu = 1 um). Please bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayın.

Şekil 4: doksorubisin yüklü ipek nanopartiküllerinin Karakterizasyonu (Dox-SNP) ipek nanopartiküllerinin farklı miktarlarda (SNP) yanıt olarak 232 ug doksorubisin (A) Kapsülleme verimliliği;. İpek nanopartiküllerin 2, 6 ve 10 mg arasındadır. 2 mg ipek nanopartiküller ile karşılaştırıldığında, 10 mg ve 5 mg ipek nanopartiküller için kapsülleme etkinliği önemli ölçüde artmıştır. (B) parçacık boyutu ve ipek nano-tanecikleri kontrol grubuna kıyasla doksorubisin yüklü ipek nanopartiküller (C) zeta potansiyeli (ipek nanopartiküllerin 10 mg) eklenmiştir. İstatistiksel örnek çiftleri için anlamlı farklılıklar Student t-testi ile belirlendi. Çoklu örnekleri Bonferroni çoklu karşılaştırma post hoc testi ardından tek yönlü ANOVA ile değerlendirildi; * P & #60 0.05, ** P <0,001, SD ±; hata çubukları arsa-sembol içinde gizlidir zaman görünmez, n = 3 , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: ipek nanopartiküller ve insan göğüs kanseri hücrelerinde doksorubisin yüklü ipek nanopartiküllerinin in vitro sitotoksisite ipek nanopartiküller (SNP) ile 72 saat işleme döngüsünden sonra, MDA-MB-231 hücrelerinin (A) Hücre canlılığı (0.01-5 mg. / ml); oyuk başına miktarlar 100 ul idi. (B) 0.1 mg, ipek nanopartiküller ile 72 saat işleme döngüsünden sonra, MDA-MB-231 hücrelerinin hücre canlılığı, serbest yayılabilir doksorubisinin 0.1 ug (Dox) ya da doksorubisin 0.1 ug (Dox-S yüklü ipek nanopartiküllerinin 0.1 mgNPS). Kontrol ile karşılaştırıldığında, hücre canlılığı, istatistiksel olarak serbest yayılabilir doksorubisin 0.1 ug ve doksorubisinin 0.1 ug yüklü ipek nanopartiküllerin 0.1 mg maruz kaldıktan sonra düşmüştür. (I), orta (kontrol) maruz MDA-MB-231 hücreleri, (ii) 0.1 mg ipek nanopartiküller, serbest yayılabilir doksorubisin (iii) 0.1 ug, ve (iv) doksorubisin yüklü ipek nanopartiküller de (C) SEM görüntüleri eşdeğer doz (Ölçek çubuğu = 50 um). İstatistiksel analiz ± SD, ns = anlamlı değil, Bonferroni çoklu karşılaştırma post hoc testi ardından tek yönlü ANOVA, * p <0.05, ** P <0.001 ile gerçekleştirildi; hata çubukları arsa-sembol içinde gizlidir zaman görünmez, n = 3 , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Çeşitli yöntemler, süperkritik CO, ²¹ kurutma, kılcal microdot ²³ baskı ²² dışarı tuzlama sprey, ²⁰ karıştırma polivinil alkol de dahil olmak üzere ipek nanopartiküller üretmek için kullanılabilir ₂ yağış ²⁴ ve nanoprecipitation ^16,25 (referans ²⁶ gözden). Ancak, nanoprecipitation nedeniyle genel basitliği, ipek nanopartiküller üretmek için en popüler tekniktir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı nanoprecipitation lysosomotropic antikanser ilaç dağıtım da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda kullanılabilir ipek tabanlı nanopartiküller, üretmek için ipek-ters mühendislik uygulamak oldu.

Geçtiğimiz on yıl içinde, nanoprecipitation protein bazlı nanopartiküller ²⁹ üretimi için en sık yapılan işlemlerden biri haline gelmiştir. Araştırma grubumuz ^16,17 ve diğerleri ^25,26,30,31 başarıyla bu teknoloji uyguladıkipek noloji; Burada, biz ipek nanopartiküllerin üretimi için basit ama sağlam adım adım protokol mevcut. Aseton nanoprecipitation boyutu homojendir ve nanometre boyutlarında genellikle düşer küresel ipek partikülleri elde edilir. Aseton, metanol, etanol, izopropanol ve butanol ^16,25 gibi çözücü maddeler içinde tercih edilen sürekli bir faz olarak ortaya çıkmıştır. Aseton yerli yeniden ipek çözeltiler ³² içinde mevcut küresel misel yapılarının boyutlu nm yarı dengeli 100-200 göre hidrasyon azaltılmış düzeyde olması nano-tanecikleri elde edilir. Ancak, burada tarif edilenlere potansiyel olarak farklı özelliklere sahip, ipek (nano) parçacıklar oluşturmak için çözücü karışımları ve gam giderme zaman çeşitlemelerini bir alan mevcuttur. Burada açıklanan protokol negatif yüzey yük taşıyan tek tip küresel nano boyutlu ipek parçacıklar (106.5 ± 1.1 nm) imalatına imkan sürekli faz olarak aseton (-49,57 kullanır77; 0.6 mV) ve hidrofobik, kristal ipek zincirleri ^16,17 sıkı bir ambalaj vardir. Genel olarak, açıklanan prosedür küçük eller-zaman gerektirir ve ters-mühendislik sulu ipek solüsyonu (Şekil 1) ipek nanopartiküller verir. Bu prosedürün temel özelliklerden bazıları 60 dakika gamı ​​giderilmiş ipek, uygun bırakma boyutu (yaklaşık olarak 10 ul / damla) ve 50 damla / dakika maksimum damlama hızı kullanımı içerir. Bu önemli özelliklerin uyulması% 14, tipik bir verimle elde edilir. Bu nanopartiküller sağlam ve biz onlar kararlı ve 28 günlük depolama süresince fiziksel özelliklerini değiştirmek olmadığını kanıtlar sunmaktadır. Bununla birlikte, tarif edilen metodun potansiyel uyarı geniş bir boyut aralığında parçacıklar (dar polidispersite indeksi muhafaza ederken, yani nanometre partiküllerin üretilmesi ölçek mikrometre) oluşturmak üzere olmayışıdır.

Denetleme partikül boyutu, şarj ve şekil ikatı tümörler ³³ hedefleme özellikle, ilaç verme için mportant. 100 nm büyüklük aralığı içindeki parçacıklar, tümör hedefleme için ideal aday ortaya çıkmaktadır. Bu nedenle, 100 nm boyutlu ipek nanopartiküller katı tümör tedavileri için anti-kanser ilaç verme sistemleri gibi potansiyel yarışmacının vardır. İpek nanopartiküller onları kolayca elektrostatik etkileşim ¹⁶ sömürü yoluyla pozitif yüklü ilaçlar ile yüklenen işler negatif yüzey yüküne sahiptir. Ancak, şarj yanı sıra, ilave madde özellikleri (ör logD), aynı zamanda, ilaç yükleme etkiler ve ³⁴ serbest bırakmak için bilinmektedir. Bu çalışmada, doksorubisin, zayıf bir bazik antikanser ilaç, model bir ilaç adayı olarak seçildi. Ilaç yüklemesi çalışması (Şekil 4) gösterdi artan doksorubisin kapsülleme verimliliği yol açtı ipek nanoparçacık konsantrasyonunu arttırarak; ipek nanopartiküllerin 10 mg doksorubisin 232 mikrogram kozalayabilirsiniz. ipek ilaç yüklemesi nanoparticles da, doksorubisin ipek şarj etkileşimi bu özel ilaç taşıyıcı kombinasyonu için önemli olduğunu doğrulayan doğrudan deneysel kanıt önemli ölçüde azaltılmış yüzey yükünün, ipek nanopartiküller sonuçlandı.

Biz daha önce ipek nanopartiküller bir lysosomotropic ilaç verme sistemi ^16,17 olarak hizmet verebilir kanıtlar sağlamıştır. Burada, insan meme kanseri MDA-MB-231 hücre hattı tedavisinde doksorubisin yüklü ipek nano-tanecikleri ile bir test göstermektedir. Bu hücreler yüksek invaziv üçlü negatif meme kanseri türetilmiştir (ER ^- / PR ^- / HER2 ^-) zor klinikte ³⁵ tedavi. Bu nedenle, bu hasta popülasyonunda uyarlanmış bir ilaç dağıtım sistemi tasarlarken büyük faydalar elde etmesi bekleniyor. Ilaç yüklemesi yokluğunda, ipek nanopartiküller hücre canlılığı _(IC50 değerleri> 5 mg / ml) (Şekil 5A, c) etkilememiştir. Ancak, equi dedeğerli dozlar, önemli ölçüde daha büyük bir sitotoksisite doksorubisin yüklü ipek nanopartiküller (Şekil 5b) daha serbest bir şekilde yayılabilir doksorubisin ile gözlenmiştir. Serbestçe yayılabilir ve parçacık bağlı ilacın in vitro hücre farmakokinetiği arasındaki farklar bu gözlemi açıklar. ilaç yüklü nanopartiküller alımı endositoz dayanmaktadır oysa serbestçe yayılabilir ilaç hızla difüzyon yoluyla plazma zarı geçebilir. Bununla birlikte, nanopartiküllerin endositik alımı ilaç saklama geliştirmek ve ilaç direnç mekanizmalarını ³ üstesinden gelebilir. Ancak, nanoparçacık aracılı antikanser ilaç verilmesinin gerçek yararı pasif tümör hedefleme kolaylaştırmak ve farmakokinetiği geliştirmek için EPR etkisi istismar olmasıdır. Bu nedenle, bir nanopartikül bazlı ilaç verme yaklaşımının kullanılması sadece tam olarak in vivo değerlendirilebilir. In vitro çalışmalar sınırlamaları vardır (örneğin, EPR etkisinin olmaması) tam charact engelilaç verme sistemleri ^7, bu tür erization.

Özet olarak, tarif edilen yöntem, tutarlı boyut ve yüzey yükünün küresel ipek nanopartiküllerinin kolay üretimine izin verir. Bu ipek nanopartiküller geniş bir uygulama aralığı için kullanılabilir (örneğin, kozmetik, nano desen, theranostics, yağlama maddeleri, nanotoxicity çalışmaları için kontrol parçacıkları şablonları) anti-kanser ilaç verme platformları olarak kullanımları da dahil olmak üzere.

The authors have nothing to disclose.

This research was supported by a Marie Curie FP7 Career Integration Grant 334134 within the seventh European Union Framework Program.