Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

Son zamanlarda, iPSCs rejeneratif tedaviler için hücrelerin yeni kaynağı olarak dikkat çekmiştir. Üreten iPSCs için ilk yöntem invaziv biyopsi ve transgenlerin retroviral genomik yerleştirilmesi ile elde edilen dermal fibroblastlar dayanıyordu olsa da, bu dezavantajları önlemek için birçok çaba olmuştur. İnsan periferal T-hücreleri iPSCs üretilmesi için benzersiz bir hücre kaynağıdır. T hücrelerinden türetilen iPSCs T hücre reseptörü (TCR) genlerinin yeniden düzenlemeleri içerir ve antijen-spesifik T hücrelerinin bir kaynağıdır. Buna ek olarak, genom içinde T hücresi reseptörü yeniden düzenleme Bireysel hücre serilerinin etiket ve nakledilen ve donör hücreleri ayırt etmek için bir potansiyele sahiptir. IPSCs güvenli klinik uygulama için, zararlı ajanlara yeni oluşturulan iPSCs ortaya çıkma riskini en aza indirmek için önemlidir. Fetal büyükbaş hayvan serumu ve besleme hücreleri pluripotent kök hücre kültürü için gerekli olmasına rağmen, bu riskini azaltmak için kültür sistemi kaldırmak için tercih ediliröngörülemeyen patojenli. Bu gidermek için, tanımsız patojenlere iPSCs ortaya çıkma riskini azaltmak için Sendai virüsü kullanılarak insan periferik T hücrelerinden iPSCs üretilmesi için bir protokol kurduk. Sendai virüsü taşıma, uygun biyogüvenlik düzeyi ile ekipman gerektirir rağmen, Sendai virüsü bozar genom ekleme olmadan T hücrelerinin aktive henüz yüksek verimlilik ile. Bu protokol, aktive edilmiş T hücre kültürü ve Sendai virüsü bir kombinasyonu kullanılarak besleyici içermeyen koşullar, insan periferik T hücrelerinden iPSCs üretilmesini göstermektedir.

iPSCs rejeneratif tıp ^1-3 için hücre çığır kaynağı olarak büyük ilgi çekmiştir. Bugüne kadar, iPSCs üretilmesi için çeşitli yöntemler ^4,5 bildirilmiştir. Bunlar arasında, insan T hücrelerinden üretilen iPSCs çünkü cep örnekleme ^6-8, daha az invazif yöntemin özel ilgi olmuştur. Buna ek olarak, T hücrelerinden türetilen iPSCs T hücre reseptörü (TCR) geninin yeniden düzenlenmesi içerir ve dolayısıyla antijen-spesifik T hücrelerinin ^9,10 kaynağıdır. Bu nedenle, T-hücresi türevli iPSCs üreten güvenli rejeneratif tıp devam edebilmek için yararlıdır.

Bu yöntem, öngörülemeyen patojenite riskini azaltma kavramına dayanmaktadır. IPSCs güvenli klinik uygulama için bu patojenlere ¹¹ maruz kalma riskini azaltmak için çok önemlidir. Daha önce pluripotent kök hücrelerin bir çok kültür sistemlerinde, fetal sığır serumu ve besleme hücreleri esas reaktif olarak kullanılmaktadır¹² s. IPSC üretimi öngörülemeyen patojenik riskini azaltmak için Ancak, kültür sistemi, bu reaktiflerin iki çıkarılması tercih edilir.

Buna ek olarak, bu yöntem, hasta ve besleyici hücreler zahmetli preparatından invaziv hücre örnekleme önüne geçme avantajına sahiptir. T hücresi türevli iPSCs önce hastalığı araştırma ^13,14 başarıyla kullanılmıştır, bu yöntem, aynı zamanda hastaların hastalığa özgü iPSCs üretilmesi için kullanılabilir ve yararlıdır.

Bir gen taşıyıcı olarak Sendai virüsü (SeV) vektörü kullanılarak T hücre yeniden programlama yöntemleri arasında, yüksek verimlilik, ^7,16 ile iPSCs üreten bir yöntemdir. SeV tek iplikli bir RNA virüsüdür ve replikasyon için bir DNA faz gerek yoktur, çünkü ek olarak, iPSC üretimindeki kullanımı konakçı genomu ^17-19 kırılma önler. Bu nedenle, serum-fr insan periferik T hücrelerinden iPSCs üretilmesi için protokoller kurdukee ve matrigel, mTeSR ortamı bir kombinasyonu kullanılarak besleyici içermeyen koşulları ve SeV vektörler.

1. aktiflediği insan T hücrelerindeki hazırlayın

1. Damarından bir donörden tam kan heparinize 10 ml toplayın.
   1. Venipunktür önceden donörlerin aydınlatılmış onam. Venipunktür kalifiye ve eğitimli personel tarafından yapılmalıdır.
   2. Steril ekipman ve aşağıdaki uygun biyogüvenlik kurallarına elde edilen kan örnekleri taşıyınız.
2. 10 ml D-PBS ile bütün kan heparinize 10 ml seyreltik (-).
3. Yeni 50-ml konik tüp içine 15 ml Ficoll solüsyonu (Ficoll Paque PREMIUM) koyun.
4. Adım 1.3 Ficoll çözeltisi üzerine Adım 1.2 hazırlanan 20 ml kan çözümü Katman. Elektrikli bir pipet kullanılarak, kan solüsyonu tüpün iç duvarı boyunca yavaş yavaş Aşama 1,2 çalıştırmak hazırlandı sağlar. Kan çözümü ve Ficoll çözüm karıştırmak için dikkatli olun.
5. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. "Yavaş" santrifüj yavaşlama hızını ayarlayın.
   Not: Santrifüj işleminden sonra, beyaz bir incetabaka bir üst sütlü plazma tabakası ve alt net bir Ficoll katmanı arasında ortaya çıkar. Bu beyaz ince tabaka mononükleer hücreleri içerir.
6. Bir 1 ml pipet ile yeni bir 50-ml'lik konik tüpe tek çekirdekli hücre katmanı aktarın. Ficoll çözüm dahil vermemek için dikkatli olun.
7. D-PBS (-) ekleyin, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de, toplam 10 ml'lik bir hacme ve santrifüj mononükleer hücrelerine temin etmektedir.
8. Süpernatantı atın. Tek-çekirdekli hücreleri, ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj (-) D-PBS, 10 ml ekleyin.
9. Süpernatantı atın toplanan mononükleer hücrelere KBM502 orta 1 ml ekleyin ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. X 10 ⁶ 5 üzerinde tek çekirdekli hücreler, uygun bir ayırma Ficoll kullanılarak, tam kanın heparinize 10 ml elde edilebilir.
10. D-PBS içinde 10 ug / ml'lik bir konsantrasyonda, bir anti-insan CD3 antikoru solüsyonu hazırlayın (-). Sörf emmek 6-çukurlu plaka anti-insan CD3 antikoru solüsyonu ilaveHer bir ası de ve en az 30 dakika _boyunca% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe çanak.
11. Her bir anti-insan CD3 antikor çözüm çıkarın ve D-PBS ile bir kez yıkanır (-) tohum hücreleri hemen önce.
12. KBM502 ortam içinde anti-insan CD3 antikoru ile kaplanmış 6-yuvalı plakalar üzerinde 2.5 x 10 ⁵ hücre / ^cm2 yoğunluğunda Aşama 1,9 hazırlandı Tohum mononükleer hücreleri. T hücreleri konfluansa ulaşana kadar bir ortam değişikliği olmadan 3-7 gün boyunca% 5 -CO ₂ inkübatörde 37 ° C'de inkübe edilir. Bu dönemde, T-hücreleri, hem süspansiyon haline getirilmiş ve yapışan hücreler bulunmaktadır.

SeV Vektörler 2. Infect İnsan T hücrelerinin

1. 3-7 gün kültürden sonra, pipetleme orta mevcut aktive edilmiş T hücreleri toplamak. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g 'de 15 ml konik tüp ve santrifüj aktarın.
2. Süpernatantı ve 1 ml taze KBM502 orta ekleyin. Hücreleri saymak ve 1 plaka.5 x 10 ^{6 hücre,} bir anti-CD3 antikoru ile kaplanmış 6-çukurlu plakanın her oyuğuna (2 ml taze KBM502 ortamı içerisinde).
3. Buz üzerinde Zeiss OCT3 / 4-SeV / TSΔF, Sox2-SeV / TSΔF, Klf4-SeV / TSΔF ve c-myc (HNL) -SeV / TS15ΔF arasında SeV çözüm çözülme.
4. Zeiss OCT3 / 4-SeV / TSΔF, Sox2-SeV / TSΔF, Klf4-SeV / TSΔF ve c-myc (HNL) ihtiva eden SeV çözümler ekleyin -SeV / TS15ΔF ayrı ayrı gözlere, enfeksiyon çokluğunda her (MOI) Bir başka 24 saat süreyle% 5 -CO ₂ inkübatörde 37 ° C'de inkübe 10. bölgesinin.

3. İnsan T Hücreleri SeV Vektörler kaldır

1. 24 saat enfeksiyondan sonra, bir pipetle enfekte hücreleri toplamak. Yapışan hücreler varsa, onlar kolayca defalarca yukarı ve aşağı onları pipetleme ayrılabilir. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g 'de 15 ml konik tüp, ve santrifüj aktarın.
2. SeV vektörleri içeren süpernatant kaldırmak ve 2 ml taze KBM502 orta ekleyin. EAC içinde Replate hücrelerkuyuların h. Ek bir 24 saat boyunca bir% 5 -CO ₂ inkübatörde 37 ° C'de inkübe edilir.

Bir Matrigel Katman 4. reseed Hücreler

1. 4 ° C 'de (Bu çalışmada kullanılan özel markasıyla Malzeme Listesi bakınız) ve DMEM / F12 ortamı içinde 10 ml 0.2 ml eritilmesi çözülme matris jel bazal membran matrisi çözeltisi hazırlayın.
   Not: The Matrix jeli (bu çalışmada kullanılan belirli bir marka için malzemeler listesi bakınız) 4 ° C'de tamamen çözülmüş olması O / N çözülme gerekiyor. Kullanmadan önce kadar buz üzerinde tutun.
2. 100 mm'lik tabaklara tabak başına Levha 5 mi bazal membran matrisi çözeltisi ve tohum hücreleri önce en az 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. En az iki adet 100 mm çanağı bir deney için ihtiyaç vardır.
3. , Pipetleme SeV enfekte olmuş hücreleri toplamak, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de 15 ml konik tüp, ve santrifüj aktarın.
4. Süpernatantı ve 1 ml taze KBM502 orta ekleyin. Ce sayısınıHemasitometre kullanarak lls Adım 4.2 ve plaka hazırlanan 100 mm yemeklerinden bazal membran matris çözümü kaldırmak 1 × 10 ^{5 ve} 1 × 10 ^{6 hücre} 100 mm bazal membran matris kaplı üzerinde (10 ml taze mTeSR orta olarak) yemekler. Son olarak, koloniler kolayca çekilen hangi plakayı kullanın.
5. % 5 CO ₂ inkübatör O / N 37 ° C 'de çanak inkübe edin.
6. 10 orta değiştirmek mi her gün mTeSR orta eti.
   Not: enfeksiyondan sonra yaklaşık 20-30 gün, yakından embriyonik kök hücreler (EKH) benzer koloniler görünecektir.

5. T-hücresinden alınan iPSCs aç

1. 4 ° C 'de (Bu çalışmada kullanılan özel markasıyla Malzeme Listesi bakınız) ve DMEM / F12 ortamı içinde 10 ml 0.2 ml eritilmesi çözülme matris jel bazal membran matrisi çözeltisi hazırlayın.
2. Levha 1, 6-çukurlu plaka içinde çukur başına bazal membran matrisi çözeltisi ve en oda sıcaklığında bırakınkoloniler almadan önce en az 30 dakika.
3. MTeSR ortamının 20 ul, 96 oyuklu bir plaka Dolgu ile sabitleştirilir.
4. 20 ul pipet kullanarak stereomicroscope altında EKH benzer koloniler seçin.
   Not: Şekil 1B gösterildiği gibi EKH ve iPSCs kolonileri yuvarlak ve düzdür.
5. Aşama 5.3 mTeSR ortamı ile doldurulmuş 96 oyuklu bir plakaya transfer seçilmiş kolonileri.
6. 200 ul pipet kullanarak stereomicroscope altında küçük öbekler halinde koloni kırmak için aşağı yukarı pipet ve dikkatle her kuyuya mTeSR orta 200 ul ekleyin ve. 5.2 de hazırlanan gelen bazal membran matrisi çözeltisi çıkarın ve mTeSR orta 2 ml bazal membran matris ile kaplanmış 6-çukurlu plakanın bir oyuğuna, her bir koloni koyun ile sabitleştirilir.
7. 2 orta değiştirmek mi her gün mTeSR orta eti.

6. T hücre-türevi iPSCs korumak

T hücresi kaynaklı iPSCs korunabilirve insan ve insan iPSCs EKH aynı teknikler kullanılarak muhafaza edilmiştir. IPSC kolonileri büyümek kez aynı prosedürü tekrar ederek büyük yemeklerin içine genişletin.

1. Her 1-2 gün mTeSR orta değiştirin.
2. Koloniler Konfluent hale geldiğinde her 5-7 gün, insan iPSCs ve üreticinin talimatlarına göre insan EKH için ayrılma çözümü kullanarak geçiş hücreleri.

Bu protokol kullanılarak, kullanıcı kararlı bir şekilde insan periferik T hücrelerinden iPSCs elde edebiliyoruz. . Birkaç geçiş sonrası tespit olmayan birden çok verici olgu ve sev arasında bir hücrenin yeniden programlanması verimliliği% 0.005 ¹⁶ Şekil 1A T üretilmesi için prosedürün şematik hücre türevli gösterir - SeV ve Matrigel ile T hücrelerinden iPSC üretimi yaklaşık% 0.002 gösterdi Matrigel ve mTeSR ortamı kullanılarak besleyici içermeyen koşullarda iPSCs. Çevresi 20-30 gün sev ile enfeksiyondan sonra, iPSC koloniler ESC koloni gibi morfolojisi (Şekil 1B) tarafından kabul edilmektedir. Immünofloresan boyama tipik pluripotent hücre belirteçleri ekspresyonunu gösterdi (Nanog, Zeiss OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60 ve TRA-1-81), T hücresi kaynaklı iPSCs besleyici içermeyen koşullar (Şekil 1C) altında elde edilen.

"Width =" 700 "/>
Şekil 1. (A): Bu çalışmada, besleyici içermeyen koşullar altında yeniden programlama T hücreleri için protokol şematik. (B): besleyici içermeyen koşullar altında kan örneği gün sonra 27 bulunan tipik bir ESC benzeri iPSC koloni. (C)., T hücresi kaynaklı iPSCs ALP boyanması ve pluripotense ve yüzey markörleri için immünofloresan boyama (Nanog, Zeiss OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60 ve TRA-1-81) besleyici içermeyen koşullar altında elde edin Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

We describe a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells in serum-free and feeder-free conditions using a combination of matrigel, mTeSR medium, and SeV vectors. For clinical applications of iPSCs, it is important to have a protocol for stably generating iPSCs and a less-invasive method for cell sampling. Although generating iPSCs with the combination of matrigel and mTeSR medium showed lower reprogramming efficiency than that with knockout serum replacement (KSR) medium and feeder-cells, this combination achieves stable generation of iPSCs from donors¹⁶. Stable iPSC generation and less-invasive cell sampling has the advantage of being able to increase the number of donors for iPSC generation.

SeV vectors, a minus-strand RNA virus, is not integrated into the host genome. Therefore the risks of tumorigenesis can be avoided at the step of reprogramming factor induction^20-24. Additionally, the feeder-free conditions, which use a combination of defined culture medium and matrigel instead of a feeder layer, make it possible to minimize the potential risks of exposure to unknown exogenous factors. The fusion of these techniques provides a less invasive and safer iPSC technology for regenerative medicine¹⁶.

Important steps in this protocol are the step of activating human T cells (Step 1) and infecting them with SeV vectors (Step 2). When no ESC-like colony is obtained in the culture dish at an optimal time after SeV infection, the following should be considered. First, the confluency of the mononuclear cells before T cell activation may not be appropriate because optimal activation of T cells is critical for SeV infection^25,26. Too high a density of mononuclear cells leads to cell death, interfering with the proper activation of T cells. Too low a density of mononuclear cells also disturbs the proper activation and proliferation of T cells. Therefore, the confluency of mononuclear cells should be checked and adjusted accordingly. Second, the dosage of SeV vectors may not be sufficient. The induction efficiency of iPSC colonies depends on the dosage of the virus⁶. If no ESC-like colony is observed after SeV infection, the option of increasing the virus dosage up to an MOI of 15-20 should be considered. If signs of iPSC colony differentiation are observed, the frequency at which medium is changed may be increased up to every other day, or to every day when colonies are larger.

The limitation in this protocol consists of this method not being virus free. Although SeV for cell reprogramming is commercially available with ease, users need to prepare equipment according to the appropriate biosafety level. As another method for generating integration-free iPSCs, episomal vectors have been used until now^27-29. Although episomal vectors can be used with equipment with a lower level of biosafety, episomal vectors might insert into the host genome at extremely low rates. Therefore, additional checks are required to confirm the disappearance of transgenes, as when using SeV.

There is another limitation in that this technique is not absolutely free from animal-derived products. Some substrates, such as matrigel, anti-CD3 mAb, dissociation solution and SeV solution are derived from animal products and are therefore associated with a risk of transferring xenogeneic pathogens. However, the reduction of animal-derived substrates in the culture system is meaningful for the clinical application of iPSC technology due to the lower risk.

Yazarlar hiçbir rakip ya da ifşa etmek çıkarları çatışan var.

Biz teknik yardım için Tıp Keio Üniversitesi School Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi ve Rei Ohno teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen sağlığı araştırma sonuçlarının pratik kullanımını hızlandırmak için bir Ar-Ge Sistemleri destek programı ve Rejeneratif Tıp Gerçekleşmesi için Karayolları Programı tarafından finanse edildi.