Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

Recientemente, iPSCs han atraído la atención como una nueva fuente de células para terapias regenerativas. Aunque el método inicial para la generación de células iPS se basó en fibroblastos dérmicos obtenidas por biopsia invasiva y la inserción genómica retroviral de transgenes, ha habido muchos esfuerzos para evitar estas desventajas. Células T periféricas humanas son una fuente de células única para la generación de células iPS. CMPI derivadas de las células T contienen reordenamientos del receptor de células T (TCR) genes y son una fuente de células T específicas de antígeno. Además, T reordenamiento receptor de la célula en el genoma tiene el potencial para etiquetar líneas celulares individuales y distinguir entre células trasplantadas y de los donantes. Para la aplicación clínica segura de CMPI, es importante reducir al mínimo el riesgo de exponer iPSCs recién generados a los agentes nocivos. Aunque las células de suero bovino fetal y el alimentador han sido esenciales para el cultivo de células madre pluripotentes, es preferible eliminarlos del sistema de cultivo para reducir el riesgode la patogenicidad impredecible. Para solucionar esto, hemos establecido un protocolo para la generación de células iPS a partir de células T periféricas humanas utilizando virus Sendai para reducir el riesgo de exponer a los patógenos iPSCs no definidos. Aunque el manejo de virus Sendai requiere un equipo con el nivel de bioseguridad adecuado, infecta el virus Sendai activan las células T sin la inserción del genoma, pero con una alta eficiencia. En este protocolo, se demuestra la generación de células iPS a partir de células T periféricas humanas en condiciones libres de alimentador utilizando una combinación de cultivo de células T activadas y el virus Sendai.

iPSCs han atraído considerable atención como fuente innovadora de las células para la medicina regenerativa ^1.3. Hasta la fecha, diversos métodos para generar células iPS se han reportado ^4,5. Entre estos, iPSCs generada a partir de células T humanas han sido de particular interés debido al método menos invasivo de toma de muestras de células ^6-8. Además, iPSCs derivado de las células T contiene reordenamientos del gen del receptor de células T (TCR) y son por lo tanto una fuente de células T específicas de antígeno ^9,10. Por lo tanto, la generación de células derivadas de células iPS T con seguridad es útil para avanzar la medicina regenerativa.

Este método se basa en el concepto de reducir el riesgo de patogenicidad impredecible. Para la aplicación clínica segura de CMPI es importante para reducir el riesgo de exposición a patógenos ^11. Anteriormente en muchos sistemas de cultivo de células madre pluripotentes, las células alimentadoras de suero bovino fetal y se han utilizado como reactivo esencials ^12. Sin embargo, la eliminación de estos dos reactivos de el sistema de cultivo es preferible para la generación de IPSC para reducir el riesgo de patogenicidad impredecible.

Además, este método tiene la ventaja de evitar el muestreo invasivo de células de los pacientes y laboriosa preparación de células alimentadoras. Debido a que las células T derivadas CMPI ya han sido utilizados con éxito en la investigación de enfermedades ^13,14, este método también es aplicable y útil para generar iPSCs específicos de la enfermedad de los pacientes.

Entre los métodos de reprogramación de células T, utilizando el vector de virus Sendai (SEV) como un vehículo de genes es un método que puede generar CMPI con alta eficiencia ^7,16. Además, debido a VSe es un virus de ARN monocatenario y no necesita una fase de ADN para la replicación, su uso en la generación de IPSC evita romper el genoma del huésped ^{17-19 de.} Por lo tanto, hemos establecido protocolos para la generación de células iPS a partir de células T periféricas humanas en el suero-frvectores ee y Condiciones-alimentadoras libre utilizando una combinación de matrigel, mediano mTeSR y SeV.

1. Prepare activadas las células T humanas

1. Recoger 10 ml de sangre entera heparinizada de un donante por punción venosa.
   1. Obtener el consentimiento informado de los donantes antes de la punción venosa. Venopunción debe ser realizado por personal calificado y entrenado.
   2. Maneje las muestras de sangre obtenidas con material estéril y siguientes pautas de bioseguridad adecuadas.
2. Diluir 10 ml de sangre entera heparinizada con 10 ml D-PBS (-).
3. Poner 15 ml de solución de Ficoll (PREMIUM Ficoll-Paque) en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
4. Capa de la solución de sangre 20-ml preparado en el Paso 1.2 en la solución Ficoll en el paso 1.3. Utilizando una pipeta eléctrica, dejó solución de sangre preparada en el Paso 1.2 run lentamente a lo largo de la pared interior del tubo. Tenga cuidado de no mezclar la solución de sangre y una solución de Ficoll.
5. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a TA. Ajuste la velocidad de deceleración centrífuga para "lento".
   Nota: Después de la centrifugación, una fina blancacapa emerge entre una capa de plasma lechosa superior y una capa inferior de Ficoll clara. Esta fina capa blanca contiene las células mononucleares.
6. Transferir la capa de células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 ml con una pipeta de 1 ml. Tenga cuidado de no incluir la solución de Ficoll.
7. Añadir D-PBS (-) a las células mononucleares a un volumen total de 10 ml, y se centrifuga a 200 xg durante 5 min a TA.
8. Eliminar el sobrenadante. Añadir 10 ml de D-PBS (-) a las células mononucleares, y se centrifuga a 200 xg durante 5 min a TA.
9. Descartar el sobrenadante, añadir 1 ml de medio KBM502 a las células mononucleares recogidas, y contar las células utilizando un hemocitómetro. Más de 5 × 10 ⁶ células mononucleares se pueden obtener a partir de 10 ml de sangre entera heparinizada con la separación apropiada utilizando Ficoll.
10. Preparar una solución de anticuerpo anti-CD3 humano a una concentración de 10 mg / ml en D-PBS (-). Añadir la solución de anticuerpo anti-CD3 humano a una placa de 6 pocillos, remoje las olasas de cada pocillo y se incuba la placa a 37 ° C en _una incubadora de CO2 al 5% durante al menos 30 minutos.
11. Retirar la solución de anticuerpo anti-CD3 humano de cada pocillo y lavar una vez con D-PBS (-) justo antes de la siembra de las células.
12. Células mononucleares de la semilla que se prepararon en el Paso 1.9 a una densidad de 2,5 x 10 ⁵ células / cm ² en las anti-CD3 humano placas de 6 pocillos recubiertas de anticuerpo en medio KBM502. Se incuba a 37 ° C en un 5% CO ₂ incubadora durante 3-7 días sin cambio medio hasta que las células T alcanzan la confluencia. Células T en este período son ambas células suspendidas y adheridos.

2. Infect T humanas Las células con SeV Vectores

1. Después de 3-7 días de cultivo, recoger las células T activadas con medio existente con la pipeta. Ellos Transferir a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min a TA.
2. Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de medio KBM502 fresco. Contar las células y la placa 1.5 × 10 ⁶ células (en 2 ml de medio KBM502 fresca) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos recubiertos con anticuerpos anti-CD3.
3. Descongele las soluciones SeV de OCT3 / 4-SEV / TSΔF, Sox2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, y c-myc (HNL) -SeV / TS15ΔF en hielo.
4. Añadir las soluciones que contienen SeV OCT3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, y c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF individualmente a los pocillos, cada uno a una multiplicidad de infección (MOI) 10. Incubar a 37 ° C en un 5% CO ₂ incubadora durante 24 horas más.

3. Retire Vectores SeV de células T humanas

1. 24 horas después de la infección, recoger las células infectadas con una pipeta. Si hay células adheridas, que fácilmente se pueden separar pipetear repetidamente hacia arriba y abajo. Ellos Transferir a un tubo cónico de 15 ml, y se centrifuga a 200 xg durante 5 min a TA.
2. Eliminar el sobrenadante que contiene los vectores SeV, y añadir 2 ml de medio KBM502 fresco. Células Replate en each de los pocillos. Se incuba a 37 ° C en un 5% CO ₂ incubadora para un 24 h adicionales.

4. Las células reseed en una capa de Matrigel

1. Prepare la solución de matriz de membrana basal por gel de matriz de descongelación (consulte la Lista de materiales para la marca específica utilizada en este estudio) a 4 ° C y la disolución de 0,2 ml en 10 ml de medio DMEM / F12.
   Nota: Gel Matrix (por favor ver la Lista de materiales para la marca específica utilizada en este estudio) tiene que descongelar O / N a 4 ° C para ser completamente descongelado. Guárdelo en hielo hasta justo antes de su uso.
2. Placa de disolución de la matriz de la membrana basal 5 ml por plato en platos de 100 mm y dejar a temperatura ambiente durante al menos 30 min antes de la siembra de células. Se necesitan al menos dos platos de 100 mm para un experimento.
3. Recoger las células infectadas por SeV mediante pipeteo, transferirlos a un tubo cónico de 15 ml, y se centrifuga a 200 xg durante 5 min a TA.
4. Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de medio KBM502 fresco. Cuente el número de ceLLS utilizando un hemocitómetro, eliminar la solución de matriz de membrana basal de 100 mm de platos preparados en la etapa 4.2 y la placa de 1 × 10 ⁵ y 1 × 10 ⁶ células (en 10 ml de medio mTeSR fresco) en un 100-mm de la membrana basal de la matriz revestida platos. Por último, utilice la placa en la que las colonias se recogen fácilmente.
5. Incubar la placa a 37 ° C en un 5% CO ₂ incubadora O / N.
6. Cambie el medio de 10 ml carne medio mTeSR cada dos días.
   Nota: Aproximadamente 20 a 30 días después de la infección, colonias que se parecen mucho a las células madre embrionarias (CES) aparecerá.

5. Ampliar T iPSCs derivada de células-

1. Prepare la solución de matriz de membrana basal por gel de matriz de descongelación (consulte la Lista de materiales para la marca específica utilizada en este estudio) a 4 ° C y la disolución de 0,2 ml en 10 ml de medio DMEM / F12.
2. Placa 1 ml de la solución de matriz de membrana basal por pocillo en una placa de 6 pocillos y dejar a temperatura ambiente durante por lomenos 30 minutos antes de recoger colonias.
3. Llenar una placa de 96 pocillos con 20 l de medio mTeSR por pocillo.
4. Seleccione colonias que se asemejan a los CES bajo el microscopio estereoscópico con una pipeta 20 l.
   Nota: Las colonias de los CES y CMPI son redondos y plana como se muestra en la Figura 1B.
5. Transferencia colonias seleccionadas en la placa de 96 pocillos con medio lleno mTeSR en el Paso 5.3.
6. Añadir 200 l de medio mTeSR a cada pocillo y cuidadosamente pipeta arriba y hacia abajo para romper la colonia en pequeños grupos bajo el microscopio estereoscópico con una pipeta 200 l. Eliminar la solución de matriz de membrana basal de la bien preparada en 5,2 y poner cada colonia en un pocillo de la placa de 6 pocillos matriz recubiertos membrana basal con 2 ml de medio mTeSR por pocillo.
7. Cambie el medio de 2 ml carne medio mTeSR cada dos días.

6. Mantener T iPSCs derivada de células-

Las células iPS derivadas de células T pueden ser mantenidosy almacenados usando las mismas técnicas que para iPSCs humanos y los CES humanos. Una vez colonias IPSC crecen, ampliarlos en platos grandes repitiendo el mismo procedimiento.

1. Cambie el medio mTeSR cada 1-2 días.
2. Cuando las colonias se hacen confluentes cada 5-7 días, el paso de las células utilizando solución de disociación para iPSCs humanos y los CES humanos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Usando este protocolo, los usuarios son capaces de generar células iPS a partir de células T periféricas humanas de manera estable. generación de IPSC a partir de células T con VSe y matrigel mostró aproximadamente 0,002% -. 0,005% de eficiencia de reprogramación celular entre varios casos de donantes y de SeV no se detectaron después de varios pasajes ¹⁶ Figura 1A muestra un esquema del protocolo para la generación de células T deriva- iPSCs en condiciones libres de alimentador usando matrigel y medianas mTeSR. Alrededor de 20 a 30 días después de la infección con la SEV, colonias IPSC se reconocen por su ESC-colonia como la morfología (Figura 1B). La tinción de inmunofluorescencia reveló expresión de marcadores de células pluripotentes típicos (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1 a 60, y TRA-desde 1 hasta 81) en iPSCs derivadas de células T generadas en condiciones libres de alimentador (Figura 1C).

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Figura 1. (A): Un esquema del protocolo para la reprogramación de células T en condiciones de alimentación gratuita en este estudio. (B): Una colonia IPSC ESC-como típico día 27 después de la toma de muestras de sangre en condiciones libres de alimentador. (C): tinción ALP y tinción de inmunofluorescencia de marcadores de pluripotencia y de superficie (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1 a 60, y TRA-1 hasta 81) en iPSCs derivadas de células T generadas en condiciones libres de alimentador. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

We describe a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells in serum-free and feeder-free conditions using a combination of matrigel, mTeSR medium, and SeV vectors. For clinical applications of iPSCs, it is important to have a protocol for stably generating iPSCs and a less-invasive method for cell sampling. Although generating iPSCs with the combination of matrigel and mTeSR medium showed lower reprogramming efficiency than that with knockout serum replacement (KSR) medium and feeder-cells, this combination achieves stable generation of iPSCs from donors¹⁶. Stable iPSC generation and less-invasive cell sampling has the advantage of being able to increase the number of donors for iPSC generation.

SeV vectors, a minus-strand RNA virus, is not integrated into the host genome. Therefore the risks of tumorigenesis can be avoided at the step of reprogramming factor induction^20-24. Additionally, the feeder-free conditions, which use a combination of defined culture medium and matrigel instead of a feeder layer, make it possible to minimize the potential risks of exposure to unknown exogenous factors. The fusion of these techniques provides a less invasive and safer iPSC technology for regenerative medicine¹⁶.

Important steps in this protocol are the step of activating human T cells (Step 1) and infecting them with SeV vectors (Step 2). When no ESC-like colony is obtained in the culture dish at an optimal time after SeV infection, the following should be considered. First, the confluency of the mononuclear cells before T cell activation may not be appropriate because optimal activation of T cells is critical for SeV infection^25,26. Too high a density of mononuclear cells leads to cell death, interfering with the proper activation of T cells. Too low a density of mononuclear cells also disturbs the proper activation and proliferation of T cells. Therefore, the confluency of mononuclear cells should be checked and adjusted accordingly. Second, the dosage of SeV vectors may not be sufficient. The induction efficiency of iPSC colonies depends on the dosage of the virus⁶. If no ESC-like colony is observed after SeV infection, the option of increasing the virus dosage up to an MOI of 15-20 should be considered. If signs of iPSC colony differentiation are observed, the frequency at which medium is changed may be increased up to every other day, or to every day when colonies are larger.

The limitation in this protocol consists of this method not being virus free. Although SeV for cell reprogramming is commercially available with ease, users need to prepare equipment according to the appropriate biosafety level. As another method for generating integration-free iPSCs, episomal vectors have been used until now^27-29. Although episomal vectors can be used with equipment with a lower level of biosafety, episomal vectors might insert into the host genome at extremely low rates. Therefore, additional checks are required to confirm the disappearance of transgenes, as when using SeV.

There is another limitation in that this technique is not absolutely free from animal-derived products. Some substrates, such as matrigel, anti-CD3 mAb, dissociation solution and SeV solution are derived from animal products and are therefore associated with a risk of transferring xenogeneic pathogens. However, the reduction of animal-derived substrates in the culture system is meaningful for the clinical application of iPSC technology due to the lower risk.

Los autores no tienen ninguna competencia o conflictos de intereses a revelar.

Agradecemos Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi, y Rei Ohno de la Escuela de la Universidad de Keio de Medicina para la asistencia técnica. Este trabajo fue financiado en parte por un programa de apoyo a la I + D de sistemas para acelerar el uso práctico de los resultados de investigación en salud, y el Programa de Carreteras para la Realización de Medicina Regenerativa.