Nörodejeneratif Hastalıkların bir Drosophila Modelinde Tırmanma Kusur Kantitatif Analiz

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

Nörodejeneratif hastalıkların kaynaklanan kusurlar Lokomotif subklinik dejenerasyon yıl sonra, hastalığın geç başlangıçlı belirtisi olabilir ve böylece güncel tedavi tedavi stratejileri küratif değildir. Bütün exome sekanslama kullanımı sayesinde, genlerin artan sayıda insan hareket bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Bu genlerin tanımlanması rağmen, bu genler, normal lokomotif işleyişi için çok önemlidir kadar bilinmemektedir. Bu nedenle, tedavi edici ilgi yeni hedefler belirlemek için bu genlerin rolünü aydınlatmak için model organizmalar kullanan güvenilir bir tahlil, her zamankinden daha fazla ihtiyaç vardır. Biz daha önce hafif kusurların tespiti için izin verir ve zamanla bu hataları değerlendirmek için yeteneğine sahiptir negatif geotaxis testin bir hassaslaşmış versiyonunu tasarladık. Bir bardak gerçekleştirilir tahlil bir mum bariyer film ile kapatılır silindir, mezun oldu. Eşik mesafesi arttırarak 17.5 c tırmandı içinm biz hafif hareketlilik bozuklukları tespit daha büyük bir duyarlılık gözlemledik 2 dk deneme süresinin artırılması ve. Tahlil maliyetli ve yüksek tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek kapsamlı bir eğitim gerektirmez. Bu hareket kusurları ile Drosophila mutantlar aday ilaçların taranması için mükemmel bir tekniktir yapar.

Parkinson hastalığı, amiyotrofik lateral skleroz, kalıtımsal spastik parapleji yıkıcı nörodejeneratif bozukluklar giderek daha kabul edilmektedir. Ne yazık ki, bu nörodejeneratif bozuklukların en işlemler olmaksızın halen devam etmektedir. Bu tür genlerin artan sayıda yol açmıştır bütün exome sıralama olarak genom, tarafsız genetik testlerin yaygın klinik kullanımı, insan lokomotif bozukluklar karışması. Bu ilerlemeye rağmen, erken ve geç aşamalarında patolojik ilerleme, bu hastalıklarda zor kalır. Drosophila kontrollü mekansal ve zamansal bir şekilde gen gereksinimi eğitimi için genetik araçları ile tek sağlar. Buna ek olarak, Drosophila gibi Parkinson ^1, Alzheimer ^2, zihinsel engelli ^3,4 ve diğerleri arasında epilepsi ^5,6 gibi nörolojik durumlar için ilaç tarama yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Amacımız etkili bir maliyet geliştirmektive güvenilir tahlil hala motorun performansında küçük değişiklikleri tespit etmek yeterli duyarlı olacağını yüksek verimli analizi izin verecek.

Drosophila tırmanma davranışı üzerinde genetik mutasyon ve / veya çevresel durumun etkisini ölçmek için kullanılan çeşitli tahliller vardır. Tahlillerin çoğu olumsuz geotaxis veya tırmanma deneyi olarak bilinen tırmanmaya sinekler, doğal eğilim yararlanmak. Benzer ⁷ phototaxis çalışma için kullanılan karşı akım cihazı ayrıca gravitaxis incelemek için kullanılabilir ki 1967 önerdi. O günden bu yana, Ganetsky ⁸ ve diğerleri ^{9 -12} ilk tahlil üzerine inşa etmişlerdir. prensip şişe içinde sinekler bilinen bir dizi yerleştirin ve sinekler şişenin dibine düşmeye neden sert bir yüzeye şiddetle karşı flakon dokunun etmektir. Bu doğuştan gelen bir davranış olduğundan, sinekler yerçekimine karşı flakon üst tırmanmaya çalışacaktır. Bu deney, nicel ve measu olankaç sinekler res bir ayrılan süre içinde flakon üzerinde bir işaretleyici geçmiş tırmandı. Hız yerine sinekler tırmanma toplam sayısının ölçülmesi güvenilir bir parametre haline ve sinekler kriterlerin sayısı ¹³ anlamlı değildi durumlarda kusurları göstermiştir.

Tırmanma deney Parkinson hastalığı ¹⁴ de dahil olmak üzere pek çok nöro-dejeneratif hastalıkların incelenmesinde yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, nörodejenerasyon önceden patolojik çalışmalar ¹⁴ görülür burada lokomotif bozukluklar zamanda ölçemeyebilirler kaydetti. Böylece, geleneksel testin kullanılması hastalığın patogenezinde erken aşamalarında incelemek için yeteneğini sınırlayabilir. patoloji sonraki aşamalarında lokomotif kusurların görünümünü olan ilerleme tam kurtarılması için çok gelişmiş bir hastalık yansıtabilir.

Bu geleneksel tırmanma testinin duyarlılığı ile potansiyel bir sorun ortaya çıkarmaktadır. gelenek potansiyel yetersizlikHafif lokomotif kusurları tespit etmek için tahlil tırmanma arası sinekler tırmanmaya gerekli olan yüksekliği isnat edilebilir. Geleneksel deneyi ^15,16 ölçer sineklerin sayısı başarılı bir şekilde 20 saniye için 10 içinde 2-5 cm'lik bir yüksekliğe tırmanmaya.

Drosophila melanogaster Araştırma Alberta araştırma kurallarına Üniversitesi ile uyumlu idi.

1. Fly Koleksiyonu

1. Gıda ihtiva eden bir 25 mm x 95 mm toplama şişe içinde _{CO2 (g)} anesthetization ve yer kullanarak 20 sinekler toplayın.
2. Yatay sinekler içeren Mağaza şişeler şişe dibinde birikebilir herhangi sıvılarda sinekleri yakalama önlemek için.
3. Yaklaşık 15 saat için bir kuluçka makinesi içinde% 45 nemde 22 ° C sıcaklıkta en az 21 saat süre ile sinekler inkübe edin. 12 saat ışık ile kuluçka ayarlayın: koyu döngüsü.

2. Tırmanma Deneyi

1. Sonraki sabah, 250 ml'lik bir cam içine tek bir tüpten silindire 20 sinekler aktarın. O sürekli günlük tutmak için silindirin pozisyonunu işaretleyin. Genotipleri arasındaki çapraz bulaşmayı önlemek için genotip başına bir cam silindir kullanın. Her deney ve RO sonunda yıkayıngenotipleri arasında onları tate.
   1. Sıcaklık ve 22 ° C ve% 40 nem oranında sırasıyla (vizyon potansiyel kusur varsa veya kırmızı ışık) ortam ışığında deneyler. Sirkadiyen ritim şaşırtmak önlemek için, her zaman günün aynı anda deneyleri.
2. Bir bariyer film (balmumu filmi) bir sinekler kaçmasını önlemek için (Şekil 2) ile, silindirin üst mühür.
3. Bir tripod üzerinde video kamera ayarlayın. 250 ml 190 ml hattında odaklı kamera silindir (17.5 cm) mezun oldu.
4. Silindirin dibinde ve gıda şişeleri ölü sinekler sayısını. Mortalite olarak bu numarayı kaydedin.
5. Çok hafif, iç taban yüzeyine sinekler yerinden yeteri kadar kuvvet ile art arda kapalı hücreli köpük ped karşı silindir dokunun. Kamerada kayıt basın diğer elinizi kullanarak 10 kez - 5 dokunun.
6. Kamerada "Kaydet" düğmesine basın.
7. Vid başlateo kamera kayıt ve ayrı olmayan ritmik desen silindire altı kez dokunun.
8. Sinekler en son aday andan itibaren 2 dakika süreyle her deneme Davranış ve seçilen her zaman noktasında 17.5 cm (190 ml) (her 10 sn ölçmek) yüksekliğini geçen sinekler sayısını kaydedin. Not: silindir üzerinde işaretleme ml çapına bağlı olarak bir silindir modeli diğerine değişecektir. Hatayı önlemek için, kullanılan her silindir üzerinde yüksekliğini ölçmek.
9. Deneme sona erdikten sonra,% 95 etanol sinekler atmayın.
10. Tüm çoğaltır taze sinekler her zaman test edilmiştir yineleyerek 2,1-2,9 adımları.
    Not: 5 suret mutasyon hareket yeteneği üzerindeki güçlü bir etkiye sahip olan yeterli olabilir, ancak, 20 sinek (200 sinekler) 10 biyolojik çoğaltır küçük farklılıkları tespit etmek için önerilmektedir.
11. Deneyin tamamlanmasından sonra, laboratuvar bulaşık makinesi ve kuru O'da silindir yıkama / N yeniden kullanılır.

3. Analiz

1. Analyher ze videoları deneme sinek. Her 10 sn, hedef hattı geçmesi sineklerin toplam sayısını kaydedin.
   1. Bir sinek geri aşağı tırmanıyor ya düşerse, -1 olarak sinek ve kayıt geri aşağı tırmandı ya düştü anında aynı sayı olarak hedef çizgisini sonraki sinek sayısı. ^15. sinek hedef çizgisinin altına düşerse, örneğin, bir sonraki sinek 15 ^inci sinek ve 16 ^inci olarak kabul edilir hattı (16 ^inci sinek) geçmeye.
2. Deneme kalır sinekler sayısını elde etmek için sinekler (20) toplam sayısından mortalite çıkarma. Her zaman noktasında, hedef hattının üzerinde uçar fraksiyonu elde edilir.
3. Her bir zaman noktasında her bir yüzde çizilir (bkz Şekil 3).
4. 120 sn veri noktasında performansını analiz ve 2 grup mevcut olduğunda veya ANOVA ve Bonferroni değişiklik ile çoklu karşılaştırmalar için bir post-testi (planlı ve plansız co Tukey için student t-testi gerçekleştirinmparisons). Kolmogorov-Smirnov ¹⁷ de normallik ve eşit varyans tespit etmek için yapılır ama aynı zamanda kontrol mutant grubun dağılımlarını karşılaştırmak sınar.
5. Yaşlanma üzerinde veri sunmak ilerici bir açığı (Şekil 4) olup olmadığını görmek için farklı yaşlardaki sinekler 120 sn (2 gün, 1 hafta, 2 hafta) tırmanma sinekler yüzdesini arsa için.

Tırmanma güçlü ve tekrarlanabilir bir davranıştır. (- 30 sn 25) Gerçekten de, bir gün eski vahşi tip sinekler hızla hedef mesafesi tırmanma performansı ulaşır. Mutant sinekler hedefe tırmanmaya yetersizlik tamamlamak için hafif (ya da gecikmiş) için performans bir dizi sunuyoruz. Biz iki farklı mutant allel burada bunu göstermektedir. Birincisi Spastin geni (kaplıcalar ^{5.75) 18} tam bir silinmesi ile neden olduğu gen Spastin ciddi bir allel. Bu hat (kaplıca TM6b ile ^5.75) 'de bir gün eski sinek bile 2 dakika sonra WT tırmanma performansı ulaşmaz. Bu mutant hat flakon yöntemi (Şekil 1A, B) kullanırken bile ciddi kusurları ile sunuyor. Aynı gen için aynı grupta (kaplıca TM3 ile ^{17-7) 18} tarafından yayınlanan bir eksik silinmesi ile bir mutant okuyan zaman burada sunulan yöntemin avantajı daha belirgin hale gelir. 8 gün o durum performans kadar normal (Şekil 1C-F ). 8 gün sonra, bu sinekler tırmanma bir kusur tekrar aynı sayıda şişe yönteminde hafif ama silindir yönteminde önemli değil olmaya dikkat sunuyoruz. Bu daha büyük bir hedef mesafe kullanarak daha az şiddetli mutantlar kusurların tespiti için izin verdiğini önerebilir. Genetik olarak uygun kontroller seçimi etkisi transgenik ekspresyonu (Şekil 3) ya da genetik etkileşimin bir sonucu olduğunu garanti eder. Daha fazla kanıt için, çalışılan genin bir vahşi tip proteinin ekspresyonu davranışsal fenotip kurtarma içerir. Etkileşim çalışmaları için, sadece ilgi bir mutasyon sinekler ilgi her iki mutasyon için heterozigot olan sinekler karşılaştırın. Tahlil ayrıca bir zamanla tırmanma defekti ilerlemesini, ilerici lokomotor bozuklukları (Şekil 4) modelleme önemli bir yönü izlemenize olanak sağlar. Buna ek olarak, 2 dakika daha ağır mutantlar tırmanma ilerlemesini görmek için izin verir.

Şekil farklı tırmanma testlerinin 1. karşılaştırılması. Tırmanma defekt farklı derecelerde çeşitli yöntemler ama hafif mutasyonlar kullanılarak görülebilir şiddetli mutasyonlar için bazı testleri ile tespit edilemez. Iki gen Spastin yayınlanan mutant soyları kullanılırken Bunu göstermek için:. Spastin geninin kısmi bir delesyon içerir Spastin gen ve spastinin ^17-7 tam bir delesyon içerir Spastin ^5-75 (A) ilk, tırmanma değerlendirilir alarak sinekler boş gıda flakon üstüne tırmanmaya. 18 saniye sonra üstündeki sinek sayısı kaydedilir. Önemli bir kusuru Spast ^5-75 görülür Bu protokol kullanılarak / TM6b, vahşi tipli kontroller ile karşılaştırıldığında (n = 10, p <0.001). (B) Sonraki performansı tırmanma Burada tarif edilen yöntem kullanılarak değerlendirilmiştir. Tırmanma da D, aynı genotip Spast ^5-75 / TM6b bölgesindeki efektif. performans farkı oldukça önemlidir (n = 5, p <0.001), ancak performans boşluğu daha büyüktür. Daha az etkisi düşünce olduğu gösterilmiştir mutasyonlar için burada sunulan silindir yöntemi daha duyarlı olabilir (örneğin, Spast ^17-7 Spastin genin kısmi silinmesini içeriyor). (C) anlamlı kusur ^17-7 spast 3 gün eski ile görülmektedir Şişe yöntemle / TM3 (N = 5). (D) önemli bir kusur, (n = 5), silindir metodu ile 3 günlük spast ^17-7 / TM3 ile gözlenmiştir. (E) bir istatistiksel olmayan bir eğilim olduğunu belirtti 8 günlük spast ^17-7 / TM3 sinekler (N = 5). (F), fakat bir anlam çoğaltır aynı sayıda sunulan silindir metodu (N ile test 8 günlük spast ^17-7 / TM3 gözlenmektedir = 5, p <0.001).rYer = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Deneysel Şekil 2. şematik kurdu. 20 sinekler bir cam silindir içine yerleştirilir ve daha sonra bir mum bariyer film ile örtülmüştür. Sinekler sonra alt ve 120 saniye için bir kamera kullanılarak kaydedilen orta hattı geçen sinekler sayısına dokunulduğunda. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tırmanma deney Şekil 3. Temsilcisi sonuçları. Sineklerin yüzde eşik çizgisi durati üzerinde her 10 saniyede temsil edilir geçtiktentahlilin üzerine. Bu deneyde, 3 genetik olarak uygun bir kontrol (vahşi tip, UAS kaplıcalar -RNAi / + Elav-GAL4 / +) UAS ve Gal4 bileşenleri (Elav-GAL4 / UAS kaplıcalar -RNAi) her ikisini de içeren transjenik sinekler ile karşılaştırılır. UAS kaplıcalar-RNAi VDRC # 108739 kadardır. Bu gösterim, her genotip için tırmanma oranının değerlendirilmesi için izin verir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Birçok lokomotif bozukluklar ilerici olduğu Şekil 4. yaşlanma profilin Temsilcisi grafik., Zamanla evrimi için önemlidir. Bu grafikte, WT sinekler 2 gün sonra (A) ve 8 gün sonra Heterozigoz mutantlar (spa / ağırlık) ve trans-Heterozigoz mutantlar (spast5-75 / spast17-7) (B) ile karşılaştırılmıştır(N = 10, p <0.001). Sonuçlar aynı zamanda 120 saniye boyunca zamanla tasvir edilmektedir. Zaman noktası (C). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Drosophila önce Parkinson hastalığı ¹⁴ ve diğer nörodejeneratif koşulların ^1,2 mükemmel bir modeli olduğu kanıtlanmıştır. Drosophila uygun genetik araçlar ek olarak, kendi genomu yüksek nörolojik bozuklukların ¹⁹ katılan genler için muhafaza edilir. (Bütün exome sıralama dahil) genom genetik tarama yöntemlerinin gelişi insan hareketi bozuklukları ile ilişkili aday genlerin büyük bir listesini sunmak için devam etmesi muhtemeldir. Bu durumlar için tedavilerin geliştirilmesi nörodejenerasyonun erken evrelerinde yer alan patoloji anlayışımızı arttırmak için hayvan modelleri gerektirir. Drosophila ve negatif geotaxis testinin kullanımı fenotip kurtarma aday ilaçlar lokomotif kusurlar ilgili genleri tanımlamak ve daha sonra ekrana ucuz ve güvenilir bir yöntem sağlar. Bu moleküler, elektrofizyolojik ekler ve görüntüleme deliller that aynı hayvan modelinde elde edilebilir. Tırmanma deneyi kullanılarak, diğerleri başarıyla insan lokomosyon bozan genler için sinekler mutant motor kusurları çoğaltılamaz. Bununla birlikte, bir önceki araştırmalar patolojik değişiklikler birkaç gün ¹⁴ ile lokomotif kusurların tespiti önce olabilir göstermiştir. Bu durum, aynı zamanda subklinik değişiklikler söz insan nörodejeneratif koşullarında gözlenir. Biz anlamak ve daha sonra bu subklinik değişiklikler tedavi ederek, hastalık modifikasyonu büyük ölçüde geliştirilmiş olacağına inanıyorum.

Biz burada bir Drosophila modeli kullanarak nörodejeneratif patoloji "semptomatik için Presemptomatik" geçişi anlama yardımcı olabilir hafif lokomosyon kusurların tespiti sağlayan modeli sunuyoruz. Birçok grup biz Palladino ve ark. ²⁰ gibi 17.5 cm mesafe arttı, kısa bir tırmanış mesafe (5-10 cm) kullanılan ancak var. Bu farkın ne kadartırmanma yükseklikleri küçük görünebilir arasında, yükseklik artışı dolayısıyla nispeten küçük tırmanma kusurları tanımlanmasında yardımcı, tahlil zorluk artırmak amaçlanmıştır. Ayrıca, bazı yöntemler yetişkin Drosophila phototaxic tepki yararlanmak için, bir fiber-optik lambalı silindirin üst aydınlatmak için seçtim. Ancak, ışık kaynağı silindir içinde ışık yansımasını neden olabilir; Böylece, bir yaygın havai floresan ışık kaynağı yerine kullanılır. Buna ek olarak, nörodejenerasyon dahil genlerde mutasyon göz fonksiyonunu etkileyebilir ve bu nedenle sonuçları önyargı olabilir. 10 ile 20 sinekler örneklem büyüklüğü artış her deneme istatistiksel gücünü artırır. Başlangıçta, 30 kadar yüksek sinekler bu sayısı arttı, ancak daha sonra sinekler arasında aşırı kalabalık ve etkileşim etkileri en aza indirmek için indirgendi. Numuneler, s ortadan kaldırmak için, daha ziyade, numune başına dört tekrar çalışmalarda aday yerine, tek bir kullanımdan sonra atılıröğrenme ya da yorgunluk ossibility. Son derece kötü tırmanma performansı ile sinekler nedeniyle, o bu kriterlerin yerine getirilmesi için zaman önemli miktarda alabilir hedef hattı geçmeye sinekler% 50 için gerekli zamanı kaydetmek için ters oldu. Aksine, sinekler hedef çizgisini geçmeye 2 dakikalık bir süre verildi. çizgiyi sinekler sayısı kaydedilir ve 10 saniye aralıklarla binned ve elde edilen değer, bir yüzde olarak ifade edildi.

Oluşturmak Bu koşullar bir yetişkin sinek tırmanma yetenekleri daha duyarlı bir değerlendirme vardır. Tahlilin diğer dizaynlar de yararlı olmakla birlikte, bu paradigma hafif erken kusurları incelenmiştir durumlarda düşünülebilir. Buna ek olarak, bu deney, yardımcı madde çalışmalar bağlamında küçük değişiklikleri tespit edebilir.

Önemli bir konu sinekler silindirin altına dinlendiğini olumsuz geotaxis davranış tabanlı olmasıdır. Bu theref olduğunuBöyle düz bir yüzeye veya uçuş olarak hareketin diğer formları, değerlendirilmesi önemlidir cevher. Böyle motivasyon ve sosyal etkileşim olarak diğer yönleri potansiyel bulandırabilir olarak kabul edilmesi gerekir. Başka bir uyarı sunulan tahlil tek yetişkin sinekler lokomosyon değerlendirmek olanak sağlamasıdır. Bu hastalığın patogenezi anlamak çok önemlidir gözlemlenen davranışları için nöropatolojik bağıntılarını almak için sınırlar. Gerçekten de, çoğu beyin çalışmaları bugüne kadar Drosophila larva nöromüsküler kavşakta yapılmıştır. Larva lokomosyon davranışını elde edilmesi davranış ve patolojik değişiklikler arasında doğrudan bir ilişki çizmek için önemli bir adım olabilir.

Bu sıcaklık ve sinekler kaldırdı ve test edilir hangi nemi kontrol etmek çok önemlidir. Uçucu geliştirme etkisine ek olarak, bu faktörler yükseltilmiş ve ideal olmayan koşullarda depolanan sinekler tırmanma yeteneği üzerinde önemli bir etkisi olmuştur. Partan statik elektrik veya nem resence, sinekler optimum performans vermedi. Bu etki, tüm genotiplerde için eşit değildi, mutant genellikle daha kontrollere göre gibi faktörlerden etkilenmektedir sinekler. Buna ek olarak, silindir yıkandı ve her bir deney ile uygun kurutuldu gerekmektedir.

The authors have nothing to disclose.

This work is supported by a Canadian Health Research Institute (CIHR) Team Grant to Dr. Bolduc (co-PI) and Dr. Guy Rouleau (PI). We would like to thank Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, the members of the University of Alberta fly club and Dr. Clayton Dickson for help in development of the method and statistical analysis.