퇴행성 신경 질환의 초파리 모델에서 등반 결함의 정량 분석

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

신경 퇴행성 질환으로 인한 기관차 결함은 무증상 변성 년 다음, 질병의 늦은 발병 증상이 될 수 있으며, 따라서 현재의 치료 치료 전략은 치료되지 않습니다. 전체 엑솜 서열의 사용을 통해 유전자의 증가는 인간의 보행에 역할을하는 것으로 확인되었다. 이 유전자를 식별에도 불구하고,이 유전자가 정상 기관차의 기능에 매우 중요 얼마나 알려져 있지 않다. 따라서, 새로운 치료 적 관심의 대상을 식별하기 위해 이들 유전자의 역할을 규명하기위한 모형 유기체를 이용하는 신뢰성있는 분석은, 어느 때보 다 필요하다. 우리는 이전 온화한 결함의 검출이 가능하며 시간이 지남에 따라 이들 결함을 평가하는 능력을 가지고 음극 geotaxis 에세이 민감화 버전을 설계했다. 유리에서 수행되는 분석은 왁스 배리어 막에 의해 밀봉되는 실린더를 졸업. 임계 거리를 증가시킴으로써, 17.5 ℃로 상승 될m은 우리가 가벼운 이동성 장애를 감지하는 민감도를 관찰 한 2 분에 실험 기간을 증가시키고. 분석은 효과적인 비용과 높은 재현성 결과를 얻기 위해 광범위한 훈련을 필요로하지 않습니다. 이것은 운동의 결함 초파리 돌연변이 체에서 후보 약물 스크리닝을위한 우수한 기술한다.

파킨슨 병, 근 위축성 측삭 경화증, 및 유전성 강직성하지 마비와 같은 신경 퇴행성 장애 통렬한 점점 인식된다. 불행하게도, 이러한 신경 퇴행성 질환의 대부분은 치료없이 여전히. 이러한 유전자의 수가 증가하게되었다 전체 엑솜 시퀀싱으로 게놈 전체의, 편견 유전자 검사의 광범위한 임상 적 사용은 인간 기관차 장애에 연루된다. 이 진행에도 불구하고, 초기 말기에의 병리학 적 진행은, 이러한 장애의 어려운 남아있다. 초파리는 제어 된 공간 및 시간 방식으로 유전자 요구 사항을 공부에 대한 유전 적 도구를 하나 제공합니다. 또한, 초파리는 파킨슨 ^1, 알츠하이머 ^2, 지적 장애 ^3,4 및 다른 사람의 사이에서 간질 ^5,6 등의 신경 학적 상태에 대한 약물 스크리닝에 유용 입증되었습니다. 우리의 목표는 효과적인 비용을 개발하는 것이 었습니다및 신뢰성 분석 여전히 모터 성능의 작은 변화를 검출 할 정도로 민감 할 것이다 높은 처리량 분석을 허용 할 것이다.

초파리 등반 행동에 유전 적 변이 및 / 또는 환경 조건의 영향을 정량화하는 데 사용되는 여러 가지 분석이있다. 분석의 대부분은 부정적인 geotaxis, 또는 등반 분석으로 알려진 등반 파리의 자연적인 경향에 투자. Benzer ⁷ phototaxis의 연구에 사용되는 역류 장치도 gravitaxis을 연구하는데 사용될 수 있다고 1967 년 제안했다. 그 이후로, Ganetsky ⁸ 및 많은 다른 사람 ^{(9) -12은} 초기 분석에 구축했다. 원리는 유리 병에 파리의 알려진 숫자를 배치하고 파리는 유리 병의 바닥에 떨어질 원인, 하드 표면에 강하게 유리 병을 활용할 수있다. 그것은 타고난 행동이기 때문에, 파리는 중력에 반대 유리 병의 정상에 오르려고 시도합니다. 이 분석은 정량적이다 measu얼마나 많은 파리 입술은 할당 된 시간 동안 유리 병에 마커 과거 올랐다. 속도 대신 파리 등반의 총 수의 측정은 신뢰할 수있는 매개 변수가되고 파리 기준의 수는 ^13으로 유의하지 않았다 경우에 결함을 보여 주었다.

등반 분석은 파킨슨 병 ^(14)를 포함하여 많은 신경 퇴행성 질환의 연구에 도움이 입증되었습니다. 그러나, 우리는 신경 퇴행이 이미 병리학 적 연구 ^(14)에서 볼 경우 기관차 결함이 시간에 감지하지 못할 수 있다고 지적했다. 따라서, 전통적인 분석의 사용은 질환의 발병 초기 ​​단계를 연구 할 수있는 능력을 제한 할 수있다. 병리의 나중 단계 동안 기관차 결함의 모양은 그 진행 완전한 구조가 너무 고급입니다 질병을 반영 할 수있다.

이것은 기존의 등반 분석의 감도와 잠재적 인 문제를 제기한다. tradi의 잠재적 인 무능력가벼운 기관차의 결함을 검출하는 분석을 등반적인는 파리가 상승해야되는 높이에 기인 할 수있다. 전통적인 분석 ^15,16 대책 파리의 수가 성공적으로 20 초에 10 2-5cm의 높이를 넘어야한다.

초파리 연구는 알버타의 연구 가이드 라인의 대학을 준수했다.

1. 플라이 컬렉션

1. 음식을 포함하는 25mm X 95mm 수집 유리 병에 CO _{2 (g)을} 마취과 장소를 사용하여 20 파리를 수집합니다.
2. 수평으로 파리를 포함하는 저장 유리 병은 유리 병 바닥에 축적 될 수있는 액체에 파리를 포획 방지 할 수 있습니다.
3. 약 15 시간 동안 인큐베이터에서 45 %의 습도에서 22 ℃에서 최소 21 시간 동안 파리를 품어. 12 시간 빛으로 인큐베이터를 설정 : 어두운주기를.

2. 등반 분석

1. 다음 날 아침, 250 ml의 유리에 하나의 유리 병에서 졸업 된 실린더 (20) 파리를 전송합니다. 그것을 일정하게 일상을 유지하기 위해 실린더의 위치를​​ 표시합니다. 유전자형 사이의 교차 오염을 방지하기 위해 하나의 유전자형 당 유리 실린더를 사용한다. 각 실험 및 RO의 끝에서 세탁유전자형 사이를 하므로.
   1. 온도 22 ° C와 40 %의 습도에서 각각 (비전의 잠재적 결함이있는 경우 또는 붉은 빛) 주변 광에 실험을 실시한다. 일 주기성 리듬 혼동을 피하기 위해 항상 날의 동일한 시간에 실험을 수행한다.
2. 배리어 필름 (왁스 필름) 모든 파리의 탈출을 방지하기 위해 (그림 2)와 실린더의 상단을 밀봉합니다.
3. 삼각대에 비디오 카메라를 설정합니다. 250 ml를 190 ml의 라​​인에 초점 카메라는 실린더 (17.5 cm)를 졸업했다.
4. 실린더의 하단과 음식 바이알에서 죽은 파리의 수를 계산. 사망률로이 번호를 기록한다.
5. 아주 가볍게 내부 바닥면에 파리를 대체하기에 충분한 힘으로 반복적으로 폐쇄 셀 폼 패드에 대한 실린더를 누릅니다. 카메라에 기록을 눌러 다른 손을 사용하는 동안 10 배 - 5를 누릅니다.
6. 카메라의 "녹음"버튼을 누릅니다.
7. VID 시작EO 카메라 녹화와는 별개의 비 리듬 패턴으로 실린더를 여섯 번을 누릅니다.
8. 파리 마지막 도청되는 시간에서 2 분 동안 각각의 시험을 수행하고 선택된 각 시점에서 17.5 cm (190 ㎖) (매 10 초를 정량화)의 높이를 넘어 파리의 수를 기록한다. 참고 : 실린더에 표시 ml의 직경에 따라 하나의 실린더 모델마다 다를 것입니다. 오류를 방지하려면, 사용 된 각 실린더의 높이를 측정한다.
9. 시험이 종료되면, 95 % 에탄올 파리 폐기하십시오.
10. 모든 복제가 신선한 파리에 모든 시간을 테스트 할 때까지 반복 2.9에 2.1 단계를 반복합니다.
    참고 : 5 복제가 돌연변이가 운동에 강한 영향을 충분히 할 수 있지만, (20) 파리 (200 파리)의 10 생물 복제는 작은 차이를 감지하는 것이 좋습니다.
11. 실험 종료 후, 실험실 세척기 건조 O에서 실린더 세척 / N이 다시 사용할 수있다.

3. 분석

1. Analy각각의 ZE 비디오는 시험 비행. 각각 10 초, 대상 회선을 통과 파리의 총 수를 기록한다.
   1. 파리는 다시 아래로 올라가서 또는 떨어지면, -1로 비행 기록은 아래로 다시 상승 또는 하락 비행과 같은 숫자로 목표 라인을 건너 다음 비행을 계산합니다. 15 ^{일 플라이가} 목표 선 이하로 떨어질 경우, 예를 들어, 다음 비행은 15 ^번째 비행이 아닌 16 ^일 고려 라인 (16 ^{일 비행)} 교차합니다.
2. 재판에 남아있는 파리의 수를 얻기 위해 파리 (20)의 총 수에서 사망률을 뺍니다. 각 시점에서, 대상 회선 위의 파리의 분획을 얻었다.
3. 각 시점에서의 각각의 비율을 플롯 (도 3 참조).
4. 120 초의 데이터 점에서 성능을 분석하고 두 그룹이 존재하는 경우 또는 분산 분석과 페로 니 수정과 다중 비교를위한 사후 테스트 (계획되거나 계획되지 않은 협력을위한 Tukey에 대한 학생의 T-테스트를​​ 수행mparisons). 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 ^(17)는 정상과 동일한 분산을 확인하기 위해 수행뿐만 아니라 컨트롤에 돌연변이 집단의 분포를 비교 테스트합니다.
5. 노화를 통해 데이터를 표시 진보적 인 적자 (그림 4)이 있는지 확인하기 위해 서로 다른 연령대의 파리 120 초에서 (2 일, 1 주, 2 주) 등반 파리의 비율을 플롯합니다.

등반은 강력하고 재현 동작입니다. (- 30 초 25) 실제로, 햇 야생형 파리 빠르게 목표 거리 등반 성능에 도달한다. 돌연변이 파리는 대상에 오르는 무능력을 완료하는 가벼운 (또는 지연)에서 성능의 범위를 제시한다. 우리는 두 개의 서로 다른 돌연변이 대립 유전자와 여기를 보여줍니다. 첫번째는 spastin 유전자 (온천 ^{5.75) (18)의} 완전한 결실로 인한 ​​유전자 spastin의 심한 대립 유전자이다. 이 라인 (스파 TM6b와 ^5.75)에서 햇 파리도 2 분 후 (WT) 등반 성능에 도달하지 않습니다. 이 돌연변이 라인은 유리 병 방법 (그림 1A, B)를 사용하는 경우에도 심각한 결함 제공합니다. 동일한 유전자뿐만 동일한 그룹 (TM3 온천과 ^{17-7) (18)에} 의해 출판 불완전한 결실과 변이를 연구 할 때 여기에 제시된 방법의 이점은 더욱 분명해진다. 팔일에이 경우 성능까지 정상 (그림 1C-F입니다 ). 팔일에서 그 파리 등반 결함 반복 동일한 번호 바이알 방법에서 온화한하지만 실린더있어서 상당한 아닌 것으로 주목 제시한다. 이것은 더 큰 목표 거리를 사용하면 덜 심각한 돌연변이의 결함 검출 할 수 있음을 제안 할 수 있습니다. 유 전적으로 해당 컨트롤의 선택은 효과가 유전자 발현 (그림 3) 또는 유전 적 상호 작용의 결과임을 보장합니다. 추가적인 증거 공부 유전자 야생형 단백질식이 행동 표현형의 구조를 포함한다. 상호 작용 연구의 경우, 만 관심 중 하나 돌연변이가 파리와 관심을 모두 돌연변이 이형 파리를 비교합니다. 분석은 하나가 시간이 지남에 따라 등반 결함의 진행, 진보적 인 전위의 장애를 (그림 4) 모델링의 중요한 측면을 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 2 분간 더 심한 돌연변이 등산의 진행을 표시 할 수있다.

그림 다른 등반 분석 1. 비교. 등반 결함의 다른 정도가 다양한 방법하지만 온화한 돌연변이를 사용하여 볼 수있는 심각한 돌연변이는 일부 분석과 검색되지 않을 수 있습니다. 우리는 두 개의 유전자 spastin에 대해 게시 된 돌연변이 라인 사용이를 보여주기 위해 :. spastin 유전자의 부분 삭제를 포함하는 spastin 유전자 spastin ^17-7의 전체 삭제를 포함 spastin ^5-75을 (를) 먼저, 등반 평가된다 함으로써 파리는 빈 식품 유리 병의 정상에 올라. 18 초 후 상단 파리의 번호가 기록된다. 상당한 결함 Spast ^5-75에서 볼이 프로토콜을 이용하여 / TM6b 야생형 대조군과 비교 될 때 (N = 10, p <0.001). (B) 다음에, 성능을 오르는 것은 여기에 기술 된 방법을 사용하여 평가된다. 등반도 거라고한다 동일한 유전자형 Spast ^5-75 / TM6b에 efective. 성능 차이가 매우 중요하다 (N = 5, P <0.001)이지만 성능 갭이 크다. 작은 효과의 생각을 보여 돌연변이를 들어, 여기에 제시된 실린더 방식이 더 민감 할 수있다 (예를 들면, Spast ^17-7는 spastin 유전자의 부분 삭제를 포함). (C) 유의 결함이 ^17-7 spast 삼일 이전에 관찰되지 바이알 방법 / TM3 (N = 5). (D) 심각한 결함 (N = 5), 실린더 방법 3 일간 오래 spast ^17-7 / TM3 관찰된다. (E) 이외의 통계적인 경향이 주목 팔일 이전 spast ^17-7 / TM3 파리와 (N = 5). (F)하지만 의미가 복제 같은 수의 제시 실린더 방법 (N 테스트 팔일 이전 spast ^17-7 / TM3에 대한 관찰 = 5, P <0.001).rget = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

실험 그림 2. 도식 표현은 설정합니다. (20) 파리는 유리 실린더에 삽입 한 후 왁스 배리어 필름으로 덮인된다. 파리는 다음 아래 120 초 동안 카메라를 사용하여 기록 된 중간 선을 넘어 파리의 수를 탭합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

등반 실험 그림 3. 대표 결과. 파리의 비율은 임계 선이 durati을 통해 매 10 초를 표현 통과 한분석의에. 이 실험에서, 3 유전자 적절한 컨트롤 (야생 형, UAS 스파 -RNAi / +, Elav는-GAL4는 / +) UAS 및 GAL4 구성 요소 (Elav-GAL4 / UAS 스파 -RNAi) 모두를 포함하는 형질 전환 초파리 비교된다. UAS 스파-의 RNAi는 VDRC 번호 108739에서입니다. 이 표현은 각각의 유전자형에 대한 등반 속도의 평가를 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

많은 기관차 장애 진보적이기 때문에 그림 4. 노화 프로필 대표 그래프., 그것은 시간이 지남에 따라 진화를 묘사하는 것이 중요하다. 이 그래프에서, WT 파리 2 일간 (A) 및도 8 일째 이형 돌연변이 (스파 / WT) 및 돌연변이 이형 트랜스 (spast5-75 / spast17-7) (B)과 비교된다(N = 10, p <0.001). 결과는 120 초 동안 시간이 지남에 그려져있다. 시점 (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

초파리는 이미 파킨슨 병 ⁽¹⁴⁾ 및 다른 신경 퇴행성 조건 ^{1, 2에} 훌륭한 모델이 될 입증되었습니다. 초파리 가능한 유전 도구 외에도, 게놈이 높은 신경 질환 ^(19)에 관여하는 유전자를 위해 보존된다. (전체 엑솜 시퀀싱을 포함) 전체 게놈 유전자 스크리닝 방법의 출현은 인간의 운동 장애와 연관된 후보 유전자의 큰 목록을 계속 제공 할 가능성이있다. 이러한 조건에 대한 치료의 개발은 신경​​ 퇴행의 초기 단계에 관여하는 병태의 이해를 높이기 위해 동물 모델을 필요로한다. 초파리 및 네거티브 geotaxis 분석의 사용은 표현형의 구조에 대한 후보 약물을 기관차 결함에 관련된 유전자를 동정 및 선별하기 위해 후속 적으로 저렴하고 신뢰할 수있는 방법을 제공한다. 이 분자, 전기 생리에 추가, 및 이미징 증거의 T모자 또한 동일한 동물 모델에서 얻어 질 수있다. 등반 분석을 사용하여, 다른 사람이 성공적으로 인간의 운동을 방해 유전자 파리 돌연변이 모터 결함을 재현했다. 그럼에도 불구하고, 이전의 연구는 병리학 적 변화 며칠 기관차 ^(14)에 의해 결함을 검출 할 수 있음을 앞서 보여 주었다. 이 현상은 또한 우리가 무증상 변경 말하는 인간의 신경 퇴행성 조건에서 관찰된다. 우리는 이해하고 이러한 무증상 변화를 처리하여, 질병 수정이 크게 개선 될 수 있다고 생각합니다.

우리는 여기에 초파리 모델을 이용하여 신경 퇴행성 병리학 "증상하기 presymptomatic"에서 통로를 이해하는 데 도움이 될 수 가벼운 운동 결함의 검출을 가능하게하는 모델을 제시한다. 많은 그룹 우리 팔라디노 외. ^20과 17.5 cm 거리를 증가 등반 짧은 거리 (5-10 센티미터)를 사용하지만있다. 이 차이가 있지만오르는 높이 사소한 것처럼 보일 수 사이의 높이의 증가함으로써 비교적 작은 등반 결함의 식별을 돕고, 분석의 어려움을 증가시키기 위해 의도되었다. 또한, 몇 가지 방법은 성인 초파리의 phototaxic 응답을 활용, 광섬유 램프와 실린더의 상단을 조명하기로 결정했습니다. 그러나, 광원은 실린더 내에서 광 반사를 일으킬 수있다; 따라서, 확산 헤드 형광 광원이 대신 사용된다. 또한, 신경 퇴행에 관여하는 유전자의 돌연변이는 기능에 영향을 눈에 따라서 결과를 바이어 싱 할 수있다. 10 ~ 20 파리에서 샘플 크기의 증가는 각 시험의 통계적 전력을 증가시킨다. 처음에, 우리는 높은 30 파리이 번호가 증가하지만,이어서 파리 사이 과밀화 및 작용 효과를 최소화하기 위해 감소되었다. 샘플 페이​​지를 제거하기 위해, 오히려 샘플 당 네 개의 반복 실험에 대해 실행되는 것이 아니라, 하나의 사용 후 폐기학습 또는 피로의 ossibility. 매우 열악한 등반 성능 파리으로 인해, 그것은이 기준이 충족되기 위해서는 상당한 시간이 걸릴 수의 타겟 라인과 교차하는 파리의 50 %에 필요한 시간을 기록 역효과이었다. 오히려, 파리 목표 선을 교차하는 2 분의 시간이 주어졌다. 라인을 건너 파리의 수가 기록 10S 씩 비닝, 얻어진 값은 백분율로 표시 하였다.

생성 이러한 조건은 성인 파리의 등반 능력을 더 민감 평가입니다. 분석의 다른 설계는 여전히 유용하지만,이 패러다임은 이른 가벼운 결함이 조사되는 경우에 고려 될 수있다. 또한,이 분석은 도움 약물 실험 문맥에서 더 작은 변화를 검출 할 수있다.

중요한 문제는 파리가 실린더의 바닥에 두드려에 부정적인 geotaxis 동작이 기반한다는 것이다. 그것은 theref입니다같은 평면 또는 비행에 같은 운동의 다른 형태를 평가하는 것이 중요 광석. 이러한 동기 및 사회적 상호 작용과 같은 다른 양상들은 잠재적 혼동으로 고려 될 필요가있다. 또 다른주의가 제시 분석 하나만 성인 초파리 운동을 평가할 수 있다는 것이다. 이 질환의 발병 기전을 이해하는데 매우 중요한 관찰 행동 신경 병리학 적 상관 관계를 획득 할 수있는 능력을 제한한다. 사실, 대부분의 뇌 영상 작업은 지금까지 초파리 유충의 신경 근육 접합부에서 수행하고있다. 유충의 운동 동작을 얻는 것은 행동과 병리학 적 변화 사이의 직접적인 상관 관계가 산만 해지지 않도록하는 중요한 단계가 될 수 있습니다.

이는 온도 및 파리가 발생하고 테스트하는 습도를 제어하는​​ 것이 매우 중요하다. 플라이 개발에 대한 영향 외에도, 이러한 요인들은 올리고 비 이상적인 조건에 저장된 파리 등반 능력에 중요한 영향을 미쳤다. P IN증가 정전기 나 습도의 resence은, 파리는 최적의 성능을하지 않았다. 이 효과는 모든 유전자형 평등하지 않았다, 돌연변이는 일반적으로 더 대조군보다 같은 요인에 의해 영향을받지 파리. 또한, 실린더 세척 및 각 실험 사이에 적절하게 건조 될 필요가있다.

The authors have nothing to disclose.

This work is supported by a Canadian Health Research Institute (CIHR) Team Grant to Dr. Bolduc (co-PI) and Dr. Guy Rouleau (PI). We would like to thank Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, the members of the University of Alberta fly club and Dr. Clayton Dickson for help in development of the method and statistical analysis.