ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

SnF2 aile kromatin biçimlenme kompleksleri merkezi SnF2 gibi ATPaz alt birimini ^1,2 içerir. Tek alt-birim enzimler gibi bazı SnF2 gibi ATPaz fonksiyonu, diğer daha büyük bir çoklu alt birim kompleksi katalitik alt-birimi olarak işlev yaparken. Biçimlenme kompleksleri onların faaliyetlerine katkıda kromatinin alt birimlerinin her biçimlenme sürecini incelemek biyokimyasal analizleri gerçekleştirmek için yeteneği gerektiren hangi moleküler mekanizmaların tanıtılması.

İnsan INO80 kompleksi ve diğer enzimler tarafından yeniden yapılanma kromatin ATP'ye bağımlı nükleozom yeniden modelleme, kendi DNA- ve / veya nükleozom bağımlı ATPaz aktivasyonu takiben, nükleozomlann için yeniden şekillenme enzimin bağlanması ile başlayan bir çok-aşamalı bir süreç olarak tasavvur edilebilir nükleozomal DNA ve nükleozomlardan ^1,2 nihai konumlandırılması hakkında yeniden şekillenme enzim translokasyon. ATP'ye bağımlı kromatin değiştirme prosesinin r molekül ayrıntılarını anlamakreaksiyonun her aşaması için kromatin remodeling karmaşık bireysel alt birimlerinin katkıları biçimlenme kendi bireysel adımlar içine reaksiyonu ve tanımı diseksiyonu equires. Bu tür analizler in vitro tanımlanmış moleküler alt tabakalar kullanılarak nucleosome biçimlenme ve diğer faaliyetlerini analiz yeteneği gerektirir.

Önceki bir JOVE protokol, tanımlanmış ait birim bileşimleri ile ³ INO80 kromatin biçimlenme kompleksleri ve subcomplexes oluşturmak için kullanılan prosedürleri tarif. Burada, biz, DNA'ya ve nucleosome-aktive ATPaz ve bu kompleksleri ile ilişkili nucleosome biçimlenme faaliyetlerini bağlayıcı nucleosome kantitatif analizini sağlayan üç biyokimyasal analizler sunmak.

1. ATP'ye bağımlı Nükleozom Tadilat Tahliller

Nükleozom remodeling aktiviteleri ATP'ye bağımlı ölçmek için, ya da immüno-INO80 INO80 subcomplexes ATP ve 216 bp, ³² P-etiketli DNA fragmanının bir ucunda yer alan, tek bir nükleozom içeren bir alt-tabaka mononucleosomal, inkübe edilir. Reaksiyon ürünleri daha sonra yerli poli-akrilamid jeli içinde elektroforez işlemine tabi tutulmuştur.

1. ³² P-etiketli, '601' DNA fragmanını meydana getirmek için, gelen amplifiye pGEM-3Z-601 ⁴ oligonükleotitleri olarak 5'-ve 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG kullanan bir uç konuma 601 nükleozom konumlandırma dizisini ihtiva eden bir 216 bp'lik bir DNA fragmanı ileri ve geri primerler.
   1. Tablo 1 de tarif edildiği gibi, bir 100 | il PCR reaksiyonu ayarlayın.
   2. Aşağıdaki programı kullanarak bir termal döngü PCR reaksiyonları gerçekleştirin: 1 dk 96 ° C, followe de94 ° C, 57 ° C, 30 döngü için 72 ° C'de 60 saniye, 30 saniye ile 45 saniye D; 72 ° C 'de, 7 dakika ile biten.
   3. PCR reaksiyon tamamlandıktan sonra, nükleaz içermeyen döndürme kolonları boyunca iki kez, reaksiyon ürünlerinin geçirilmesiyle mümkün bağlanamayan nükleotidleri gidermek.
   4. PCR reaksiyonu, arzu edilen ~ 216 bp'lik bir DNA fragmanı elde onaylamak için% 1.2 agaroz jeli içinde saflaştırılmış PCR ürünü 5 ul çalıştırın.
   5. Saflaştınlmış PCR ürünü, 20-kat 5 ul seyreltin ve bir UV spektrofotometresi kullanılarak DNA konsantrasyonları ölçülür. Ortalama verim ~ 40 ng / ul.
   6. Bir ışıma sayacı içinde arıtılmış PCR ürünü 1 ul radyoaktivite ölçülür. Cpm / ng hesaplayarak etiketleme verimliliği tahmin. Başarılı bir etiketleme reaksiyonu 601 DNA fragmanının ~ 15,000 cpm / ng elde etmesi beklenmektedir.
2. Bir seri seyreltme yöntemi kullanılarak ⁵ etiketli 601 DNA üzerine Hela hücre nükleozom aktarın.
   1. 2 pmol karıştırın³² P-etiketli 601 DNA fragmanı ile HeLa nükleozom 6 ug 1.0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF ve 1 mM ihtiva eden bir tampon maddesi 50 ul ⁽⁵ tarif edildiği gibi hazırlanmıştır) DTT ve 30 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
   2. Sıralı 0.8 M, 0.6 M seyreltin ve 10 mM Tris-HCI (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, sırasıyla 12.5 ul, 20.8 ul, 41.6 ul, seyreltme ile 0.4 M NaCI, ve 1 mM DTT, her bir seyreltmeden sonra 30 ° C de 30 dakika inkübasyon ile.
   3. Bundan başka, bir 30 dakika inkübasyon ile, sonra% 0.1 Nonidet P-40,% 20 gliserol ve 200 ug / ml BSA ihtiva eden aynı tampon 250 ul, 125 ul eklenmesi ile 0.1 M NaCl, sonra 0.2 M ve seyreltin ve son iki dilüsyonu arasında 30 ° C'de ilave edildi. 3 aya kadar 4 ° C 'de mononucleosome tabakayı saklayın.
3. 10 ul bir toplam hacim içinde ATP'ye bağımlı nükleozom kayar reaksiyonları gerçekleştirmek. ReaINO80 nükleozom biçimlenme aktivitesi için en uygun NaCl konsantrasyonu olduğu ölü m bileşenler. Tablo 2'de listelenen 50 mM NaCI (yayınlanmamış sonuçlar) dikkate bulunan NaCI miktarı göz önüne alındığında, 50 mM NaCl, her reaksiyonda toplam konsantrasyonunu ayarlamak nükleozomlardan ve enzim preparatları.
   1. Tahlillerinde başlamadan önce, yerli poli-akrilamid jelleri (18 x 16 cm) attı. % 5 akrilamid içeren, tek bir jel hazırlamak için (akrilamid: bisakrilamid 37,5: 1) ile, 0.5x TBE (45 mM Tris, borat, 1 mM EDTA),% 0.01 amonyum persülfat (BP), ve% 0.001 N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamin (TEMED). Tablo 3'te listelenen bileşenler karışımı jel oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca polimerize olmaya bırakın.
   2. Her bir reaksiyonun gerçekleşmesi için arada, önceden soğutulmuş bir silikonize 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ~ 20 nM ya da INO80 INO80 subcomplex birleştirmek (EB100 tampon miktarı ile ⁽³ tarif edildiği gibi hazırlanmıştır) yeterli Tablo 4) 4.75 ul bir hacim elde edildi. Hemen toz halinde kuru buz veya sıvı azot içinde kalan INO80 içeren fraksiyonların yeniden dondurma.
   3. 'X' faktörü ile yukarı ölçeklendirme, bileşenlerin geri kalanı ile bir usta kokteyl kurmak (nerede reaksiyonlar X = toplam sayı +3). Tek bir 10 ul reaksiyon için gerekli olan her bir bileşenin miktarı, Tablo 5'te listelenmiştir; tarifi yapılacak reaksiyon sayısına göre büyük çapta üretim için gerekmektedir. Bir Pipetman tüp dokunarak veya yukarı pipetle ve aşağı İyice karıştırın ve bir tezgah üstü mikrosantrifuj'de birkaç saniye boyunca tüp spin.
   4. Adım 1.3.2 kurmak reaksiyon tüplerinin her için ana kokteyli 5,25 ul koyun. Yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. 30 ° C ısıtma bloğu ya da su banyosuna reaksiyon tüpleri transfer reaksiyonları başlatmak ve 2 saat süreyle inkübe edin.
   5. Bu arada, rakip DNA içeren kokteyl 'mix kaldırarak' hazırlamakve nukleosomlar, X (reaksiyonlar + 4 X = toplam sayısı) bir faktör tarafından ölçeklendirme. Tek bir reaksiyon karışımı için kaldırma 1,5 ul hazırlamak için gerekli olan her bir bileşenin miktarı, Tablo 6'da listelenmiştir; tarifi yapılacak deneyler sayısına bağlı olarak büyük çapta üretim için gerekmektedir.
   6. Çıkarmadan karışımı 1.5 ul ekleyerek reaksiyonları sonlandırın. İyice karıştırın, aşağı doğru dönmeye ve bir 30 dakika daha 30 ° C'de inkübe edin.
   7. Bununla birlikte, sabit bir tampon dolaşımını sağlamak için, alt odasının iç tarafında bir manyetik karıştırma çubuğu ile tampon olarak 0.5x TBE kullanılarak 4 ° C'de 30 dakika boyunca 100 V'ta elektroforez birimi dikey olarak yerli poliakrilamid jel ön çalıştırın.
   8. , Örnek yük 3x TBE,% 30 gliserol,% 0.25 bromofenol mavisi,% 0.25 ksilen siyanol FF ihtiva eden yükleme boyası 2.5 ul ekleyin. Kısaca örnekleri döner, iyice karıştırın ve yükleme uçları kullanılarak jel üzerine yerleştirin.
   9. Tampon sirkülasyon ile 4 ° C sıcaklıkta 4,5 saat boyunca 200 V'de jel çalıştırın.
   10. Sinyali tespit etmek için, filtre kağıdı iki tabakanın bir yığın jel aktarın. Şeffaf bir plastik sarım ile üst jeli ile filtre kağıdı sarın ve daha sonra arzu edilen süre boyunca 4 ° C'de depolama fosfor ekranına maruz kalmaktadır.
   11. Bir izotop görüntüleme tarayıcı sistemi ile ekran tarama ve uygun yazılım kullanarak verileri analiz.

2. Mononucleosome Bağlanma Analizleri

Mononucleosomes için belirli bir INO80 kompleksinin bağlanma afinitesini tahlil edilmesi için, Adım 1.2 üretilen mononucleosomal alt-tabaka kullanılarak bir elektroforetik mobilite kayma deneyiyle (EMSA), gerçekleştirin.

1. Reaksiyon nükleozom yeniden modelleme deneyleri için anlatıldığı şekilde, fakat reaksiyonlardan ATP kaldırma karışımı ihmal bağlayıcı bağlanma analizleri için karışımları ayarlama; 30 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
2. Her reaksiyon karışımına yükleme boyası 2.5 ul,% 3.5 akrilamid (akrilamid içeren bir yerli poliakrilamid jel için geçerlidir: 3 bis7.5: 1),% 1 gliserol, 0.5x TBE% 0.01 APS ve% 0.001 TEMED.
3. Tampon olarak kullanarak 0.5x TBE tampon sirkülasyon ile 4 ° C 'de 2.5 saat boyunca 200 V'de jel üzerinde çalıştırıldı ve depolama fosfor ekranına maruz kalmaktadır.

3. DNA-bağımlı ve Nükleozom ATPaz Tahliller

20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 60 mM NaCI, 6.6 mM _MgCl2, 0.8 mM EDTA, 0.015% Nonidet P-40,% 2.5 gliserol, 0.1 mg / ml BSA, 1 ihtiva eden 5 ul reaksiyon karışımlarında ATPase deneyleri gerçekleştirmek mM DTT, 0.1 mM PMSF, 2 mM ATP, [α- ^32P] ATP, 2 uCi (3,000 Ci / mmol) eklenmiştir. INO80 kompleksinin her INO80 kompleksi ya da miktar için dairesel plazmid DNA ölçmek için (5000 bp ~ 30 nM) kapalı içeren DNA- ya nucleosome bağımsız ATPaz, bir ölçmek için üç paralel reaksiyonlar, tek içeren EB100 tampon kurmak denenmiştir için DNA- bağımlı ATPaz ve nucleosome-bağımlı ATPaz ölçmek için bir HeLa oligonüklezomlar (~ 185 nM) içeren. Buz üzerinde bütün tepkileri ayarlayın.

1. Her bir reaksiyon için, önceden soğutulmuş yağlanmış bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 2.2 ul bir hacim elde etmek için yeterli EB100 tampon bir miktarı ile ya da immüno INO80 INO80 subcomplexes 10-50 nM birleştirir. Hemen toz halinde kuru buz veya sıvı azot içinde bir INO80 içeren fraksiyonların yeniden dondurma.
2. Bir usta kokteyl ayarlayın. Tek bir reaksiyon için gerekli olan her bir bileşenin miktarı, Tablo 7'de listelenmiştir., X = INO80 preparatların bir sayısının tahlil edilmesi 3 (X + 2) +1 bir unsur tarafından ölçekleme ile tarifi ölçeğinin.
3. 'Sub-Kokteylleri' içeren tampon hazırlamak için sadece, DNA veya nukleosomlar, üç ayrı tüpler içine usta kokteyl 2.5 (X + 2) ul dağıtmak. 0.3 ya da EB100 bölgesinin (X + 2) ul, kapalı, dairesel plazmid DNA (1.5 ug / ml) ya da Hela oligonüklezomlar (1.5 ug / ul) ekleyin ve iyice karıştırın.
4. St kurmak enzim içeren bir reaksiyon tüpüne uygun alt kokteyli 2.8 ul koyunep 3.1. Hafifçe karıştırın aşağı yukarı pipet ve; kabarcıkları tanıtan kaçının.
5. , Reaksiyonlarını başlatmak 30 ° C ısı bloğu reaksiyon tüpleri aktarmak için.
6. En az 1.5 cm uzakta alt kenarı düz bir hat içinde 5, 15, 30, ve inkübasyon 60 dakika sonra, bir selüloz polietilenimin ince tabaka kromatografisi üzerine her tepkime karışımı 0.5 ul nokta (TLC), levha (20 x 10 cm) . Hemen birden çok zaman noktaları, tek bir tüpten alınabilir 30 ° C ısıya bloğuna reaksiyon tüpleri döner. Boyandıktan sonra, bir fön makinesi kullanıyorsanız TLC plakaları kurulayın.
7. TLC plakasının alt 0.5 cm çözelti içinde sokulmasına izin kadar 0,375 M potasyum fosfat (pH 3.5) ihtiva eden bir cam bölmeye TLC plakalarına aktarın.
8. Bölmesi kapağı ve sıvı fazın ön TLC plakalarının üst ulaşana kadar gelişir. Anında iyice bir darbe kurutma makinesi kullanarak plakaları kurulayın.
9. Oda sıcaklığında depolama fosfor ekranına kurutulmuştur, TLC plakaları Açığa.Bir izotop görüntüleme tarayıcı sistemi ile ekran tarama ve radyoaktif ATP substrat ve ADP ürünün miktarını belirlemek.
10. ATP hidroliz miktarının hesaplanması için aşağıdaki formül kullanılarak başlangıç ​​reaksiyon karışımı içinde mevcut olan ATP miktarı ile hidrolize% ATP çarpma: pmol ATP hidroliz = 10 pmol ATP Reaksiyon x başlayarak [ADP / (ATP + ADP)]

Rakamlar nükleozom kayar (Şekil 1) ve bağlayıcı (Şekil 2) ve deneyler DNA- veya nükleozom bağlı ATPaz deneyleri (Şekil 3) de dahil olmak üzere INO80 aktivitelerini karakterize etmek için kullanılır biyokimyasal tahlillerde temsili sonuçlar göstermektedir.

Şekil 1 'de gösterilen deney sağlam INO80 komplekslerinin yeteneği FLAG Ies2 veya FLAG INO80E ile arıtılmış INO80 bir 216 bp radyo etiketli DNA parçası üzerine monte mononucleosomes remodeling katalize etmek üzere FLAG Ino80ΔN veya Ino80ΔNΔHSA ya arıtıldı subcomplexes karşılaştırır. Bu DNA fragmanı üzerinde nükleozom konumu elektroforetik hareketlilik etkiler; yanal konumlandırılmış nukleosomlar daha hızlı daha merkezi bir konuma nükleozomların daha jel çalıştırın. INO80 kromatin yeniden modelleme, DNA kompleksleri, tercihen ^6,7,8 parçasının merkezine doğru mononucleosomes hareket halinde olduklarından, yeniden modelleme aktivitesi olan monielektroforetik hareketliliği azalmış sergileyen nükleozomlann bir nüfusun ortaya çıkması tarafından izlenir. Reaksiyonun sonunda, Hela oligonüklozomlann ve somon sperm ya da diğer DNA 'sının aşırı bağlı biçimlenme enzim nükleozom elektroforetik mobilite değiştirme çünkü, herhangi bir alt-tabaka ya da bağlı INO80 INO80 subcomplexes çıkarmak için rakip olarak, reaksiyon karışımına ilave edilmelidir alt-tabaka. Ino80ΔNΔHSA ile saflaştırılmış ve kompleksleri de Arp4, Arp8 ve YY1 eksikliği ise BAYRAK Ino80ΔN arıtıldı Kompleksi metazoan spesifik alt birimleri INO80D, INO80E, Amida, MCRS1, NFRKB ve UCH37 yoksundur. FLAG Ies2, FLAG INO80E ve FLAG-Ino80ΔN arıtıldı Kompleksi metazoan özgü alt birimleri INO80 kompleksiyle nükleozom yeniden için vazgeçilmez olduğunu gösteren, benzer aktiviteler. Biçimlenme aktivitesi Ino80 ATP HSA etki alanına bağlıdır belirten tersine, kompleksler FLAG Ino80ΔNΔHSA ile saflaştırılmış, bu deneyde aktif değildirlerase ve / veya ilişkili alt birimi.

Şekil 2'de deneyler elektroforetik mobilite kayma analizleri kullanılarak INO80 faaliyetlerine ve INO80 subcomplexes bağlayıcı nükleozom karşılaştırın. Bu deneyler, nükleozom bağlı kompleksler kaldırmak için reaksiyonun sonuca oligonüklozomlann ve DNA'nın herhangi bir ek var olması dışında, nükleozom yeniden şekillenme deneylere benzer şekilde gerçekleştirilir. Bu duruma göre, bozulmamış INO80 komplekslerinin artan miktarları ile nükleozom inkübasyon INO80E alt birim yoluyla saflaştırılarak serbest mononucleosomes ve jelin en yakın yer değiştirmektedir türlerin yeni bir "kayar ', bir görünüm (kulvarlar tekabül eden bandın bir doza bağımlı ortadan kalkmasına yol açar 6-8). Buna karşılık, zaman nukleosomlar, kaydırılan türler daha hızlı göç eder INO80 alt biriminden oluşan bir alt kümesini eksikliği Ino80ΔN ile arıtılmış edilmiş küçük kompleksleri ile kuluçkalanır (kuşak 2-5 ve 9-11) ve bu nispi kalabalıkSüper-kaydırılmış bandının lü k test komplekslerinin boyutu tarafından belirlenir.

Şekil DNA-ve iki farklı INO80 subcomplexes nükleozom aktive ATPaz etkinliklerini karşılaştırmak, bir deneyin sonuçlarını göstermektedir, 3. Daha yavaş göç noktalar başlangıç ​​α- ³² P ATP etiketli, ve daha hızlı göç türleri ADP reaksiyon ürünleri gelmektedir; oklar çözücü göç yönünü gösterir.

Burada test komplekslerinin biri INO80ΔN, diğeri ise INO80ΔNC, Ino80 C-terminal bölgesini yoksun, proteinin normal C-terminaline kadar uzanan bir Ino80 ATPaz alt birimini içermektedir. Bu iki kompleksleri ile diğerleri özdeş olan, ancak, (ADP radyo etiketli ATP dönüşümü ile ölçülmüştür) ATP hidroliz hızı olumsuz aktivitesini regüle edebilir Ino80 ATPaz C-ucunu göstermektedir, INO80ΔNC mevcudiyetinde daha fazladır. Not ATP hydr oranıHer iki kompleksleriyle onikolizis kompleksleri ATP hidroliz için nükleozomal substratlar tercih biçimlenme INO80 nükleozom işaret DNA'dan daha nükleozom mevcudiyetinde daha fazladır.

Şekilde gösterilen deneyde, yalnızca DNA ya da (tespit edilemeyen DNA / nükleozom varlığında gözlenene göre <% 5 arasında değişen) nükleozom yoksun reaksiyonlarda ATP hidroliz çok düşük seviyede mevcuttur. INO80 ve diğer aile SnF2 kromatin biçimlenme enzimlerin ATPaz aktivitesinin büyük DNA veya nükleozom ile uyarılır için, INO80 kompleksinin saflaştırılmış preparasyonlarda ehemmiyetli DNA- ve / veya bağımsız nükleozom ATPaz aktivitesi varlığının hücre kirletici varlığını düşündürmektedir olur , DNA, ya da alternatif olarak, başarılı bir şekilde saflaştırma işlemi sırasında kaldırılmamışsa olmayan INO80 ATPazlar kirlenmesine neden olur. Çeşitli adımlar saflaştırılması sırasında istenmeyen DNA ve / veya en aza indirmek için ATPaz sokulması alınabilir.

1) s artırınSaflaştırma sırasında bağlama ve yıkama adımları alt konsantrasyonu (NaCl) değiştirildi. Bağlama ve yıkama basamağı, az 200 mM NaCl kullanımı genellikle DNA ve / veya kabul edilemez ATPazlar, kirletici seviyeleri ile yeniden şekillenme komplekslerinin preparatlannı verir. Rutin olarak ⁽³ açıklanmıştır) kirletici maddelerin en aza indirmek için 450 mM NaCl içeren bir tampon kullanılarak INO80 kompleksleri arındırmak. Bu aktif INO80 kompleksleri saflaştırmak için 1 M NaCI kadar ihtiva eden tamponlar, kullandık; Bununla birlikte, bu koşullar altında, aktif komplekslerin bir azalma ürününü elde etmek;

2) agaroz immün-sırasında hücre lizata FLAG oranını azaltır; FLAG agaroz optimum miktar, titrasyon ile tespit edilir;

3) ATP-bağımlı şaperonların immün-sırasında FLAG-etiketli proteinlere bağlı kalabilir. Bunlar genellikle immün-sırasında yıkama tamponunda 1 mM ATP içeren çıkarılabilir;

4) sahip SUCCESSFULLy / ml İŞARET-agaroz taneleri ile özü inkübasyonu boyunca 25 adet arasında bir konsantrasyonda Benzonase verilen DNA kirletici kaldırılır. DİKKAT: kalıntı, DNase INO80 aktivitesi için deneyler esnasında alt-tabaka DNA ya da nükleozom indirgeme gibi emin benzonaz, daha ileri bir yıkama adımları sırasında uzaklaştırılır olmak için gereklidir.

Bu ATPaz deneylerin yorumlanması, ilke olarak, INO80 kromatin biçimlenme kompleksleri SnF2 gibi çekirdek ATPaz Ino80, aktin-benzeri proteinler Arp5, Arp8, Baf53a, aktin dahil olmak üzere birçok potansiyel ATPazların içermesi gerçeğine ve AAA + ile karmaşık hale gelecek ATPazlar Tip49a ve Tip49b. Birden çok ATPaz'ların fiziksel varlığı rağmen, daha önceki çalışmalar, sadece kompleksleri, DNA-ya da Ino80 nükleozom aktive ATP hidroliz destekleyen içeren, katalitik olarak aktif olduğunu göstermiştir; Ino80 ATPaz katalitik olarak aktif olmayan E653Q formunu içeren komplekslerin tespiti DNA-ya da nükleozom uyarılmış ATPaz etkinlik gösterdiği başarısızherhangi bir koşul altında vity ⁸ test. Bu durumda, DNA-ve / veya INO80 veya INO80 subcomplexes nükleozom uyarılmış ATPaz etkinliği esas olarak Ino80 ATPaz alt-birimi ile katkıda bulunur.

Şekil 1. INO80 nükleozom biçimlenme aktivitesi Ino80 HSA etki ve / veya ilgili alt birimlerin ilgili olmakla Ino80 NTD ve metazoan spesifik alt birimlerinin bağımsızdır. Nükleozom yeniden modelleme deneyleri, FLAG ifade eden hücre sıralarından hazırlanan çekirdek ekstraktlanndan FLAG immüno-kompleksleri ile uygulandı Vahşi tipli ya da mutant INO80 alt birimden etiketli versiyonları. Bozulmamış INO80 kompleksleri FLAG Ies2 veya FLAG INO80E ifade eden hücre çizgilerinden saflaştırıldı; INO80 subcomplexes FLAG Ino80ΔN veya FLAG Ino80ΔNΔHSA ifade eden hücre çizgilerinden saflaştırıldı. 1 bir görece konsantrasyonu (rel. Kons.) ~ 10 nM INO80 karmaşık karşılık gelir. = "https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51721/51721fig1highres.jpg" target = "_blank" href> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

INO80 kompleksi ile bağlama Şekil 2. Nükleozom Ino80 NTD ve metazoan spesifik alt birimlerinin bağımsızdır. Nükleozom bağlanma deneyleri, belirtilen FLAG İmmüno INO80 kompleksinin değişen miktarlarının varlığında yapıldı. INO80 veya INO80 subcomplexes bağlayıcı stabil INO80 veya INO80 subcomplexes bağlı mononucleosomes karşılık yavaş göç "-süper kaymıştır" bantların ortaya çıkması sonuçlarını mononucleosomes için. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3 "src =" / files / ftp_upload / 51721 / 51721fig3highres.jpg "/>
Şekil 3. DNA-bağımlı ve nükleozom ATPaz tahlilleri. TLC (ince tabaka kromatografi) ATPaz deneyleri ile saflaştırılmış ve subcomplexes INO80 ATP hidroliz hızını ölçmek için yapılmıştır tabanlı FLAG Ino80ΔN (ΔN) veya FLAG Ino80ΔNC (ΔNC) olarak DNA ya da nükleozom miktarda saturasyon varlığı. Deneyler, her bir kompleks iki farklı konsantrasyonunun (5 nM ve 10 nM) ve üç farklı reaksiyon süresi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Reaksiyonlarda (pmol'lük olarak) hidroliz ATP miktarı her panelin altında belirtilmektedir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Radyo-etiketli "601" bir DNA fragmanının PCR ile yükseltilmesi için Tablo 1. Reaksiyon karışımı.

ATP-bağımlı nucleosome biçimlenme tahlillerin Tablo 2. Bileşenleri.

ATP-bağımlı nükleozom remodeling tahliller için yerli poliakrilamid jel Tablo 3. hazırlanması.

Tablo 4. EB100 tamponu.

Tablo ATP-bağımlı nucleosome biçimlenme tahliller için ana kokteyli 5. Bileşenleri.

Tablo 6. karışımı kokteyl çıkarma.

Tablo ATPaz deneyleri için ana kokteyli 7. Bileşenleri.

, Ve yeniden modelleme ve / veya enzimler ATPaz kirletici biz deneylerde uyulması, nükleozom şekillenmesi ve ATPaz aktiviteleri INO80 komplekslerin katalitik aktivitesine bağlı sağlamak için, rutin deney nükleozom modelleme ve INO80 komplekslerin katalitik olarak aktif olmayan ATPaz aktivitesi, saflaştırılır Yabani tip INO80 aynı prosedür kullanılarak paralel. INO80 kompleksi ya da subcomplexes farklı preparatlar içinde etkinliklerini karşılaştırmak, deney yöntemi için karmaşık hale ATP ve / veya ATP-bağımsız yeniden şekillenme aktivitelerini kirletici varlığında test edilmesi için yeniden modelleme nükleozom faaliyetini incelemek zaman ATP eksik bir negatif kontrol Reaksiyon de yapılmalıdır. Katalitik INO80 veya INO80 subcomplexes inaktif versiyonları hiçbir nucleosome yenileme ya da ATPaz etkinliklerini sergilemek gerekir. Buna ek olarak, veya DNA- nükleozom bağımsız ATPaz aktivitesinin tespiti Enzym ATP'AZ (ler), kirletici varlığını belirtire kesir. Faaliyetin yine katalitik olarak aktif olmayan Ino80 mevcudiyetinde tespit edildiğinde veya önemli DNA-ya da nükleozom bağımsız ATPaz aktivitesi daha da tarif edildiği gibi saflaştırma optimize sonra varsa 'Örnek Sonuçlar,' kompleksleri ayrıca, iyon değişimi ya da ilave adımlar kullanılarak saflaştırılabilir jel filtrasyon kromatografi ya da meyilli sedimentasyon.

Nükleozom yeniden yapılanma ve ATPaz aktivitelerini ölçme, bu ürün, zaman ve doz-tepki eğrileri doğrusal olan ölçümlerin alınmaktadır sağlamak için, değişen zaman uzunlukları için ve INO80 veya INO80 subcomplexes birden fazla konsantrasyonu olan deneylerin yapılması tavsiye edilir. Benzer bir şekilde, bağlama deneyleri, nükleozom INO80 kompleks (ler) çeşitli konsantrasyonları kullanılarak yapılmalıdır; aksi takdirde, birinin güvenilir farklı INO80 hazırlıkları faaliyetlerini karşılaştırmak olamaz.

Nükleozom sürgülü ve bağlama deneyleri her zaman kontrol reaksiyonları içermelidirbu başlangıç ​​nükleozom nüfusun elektroforetik hareketlilik için bir işaretleyici olarak, tek başına mononucleosome alt tabakayı içerir. Bu şekilde, özellikle kolayca enzim fraksiyonu varlığı nedeniyle değişiklikleri tespit edebilir. Bu tür bir kontrol tepkisi de yeniden mononucleosomes devamlılığını değerlendirmek.

Kayma ve bağlanma deneylerinde iyi biçimde nükleozom yapabilmek için, homojen mononucleosomal tabakaları oluşturmak için kullanışlıdır; bu nedenle, bu protokolde tarif edilen deney, güçlü bir nükleozom konumlandırma sekansını ihtiva eden bir DNA fragmanı üzerinde monte nükleozom kullanır. INO80 kompleks bir DNA fragmanı üzerinde daha merkezdeki bir pozisyona yanal olarak konumlandırılmış nükleozom konumlandırmak eğiliminde olmasına rağmen, bu tür ISWI NURF kompleksi ihtiva eden ⁹ gibi başka kromatin biçimlenme enzimler, DNA fragmanlarının uçlarına doğru daha fazla merkezi konumdan hareket nükleozom. Böylece, herhangi bir kromatin yeniden karakterizasyonu sırasında trBu pozisyonlandırma nükleozom dizisinin çeşitli yerlerde olduğu mononucleosome malzemenin hazırlanması için yararlıdır Zyme. Alternatif olarak, bir nükleozom bir nükleozom konumlandırma dizisi olmaksızın DNA fragmanları üzerinde monte edildiği substratlar kullanabilir. Bu durumda, başlangıç ​​nükleozom nüfusun daha merkezi ve yanal olarak yerleştirilmiş nükleozom bir karışımını içerecektir.

ATP-bağımlı nükleozom değiştirme prosesinin tepkime dengeye ulaştıktan sonra nükleozom pozisyonlarda değişikliklere neden olabilir DNA tam nükleozom değiştirme, DNA nükleozom hareket veya nükleozom yapısının geçici değişiklikler de dahil olmak üzere, çeşitli yeniden şekillenme sonuçlara yol açabilir ama yine de, fonksiyonel olarak önemli bulunmaktadır. Nükleozom kayma deneyi ilk iki reaksiyon izleyebilir tarif edilmesine rağmen, nükleozom yapıdaki geçici değişiklikleri tespit etmek mümkün olmayabilir. Bu gibi bazı geçici alt algılayabilir Bir tahlilmalara göre kayan veya nükleozomal DNA'nın mevcut kısmi çözülme kesme duyarlı nükleozom ile oktamer yüzeyinden kaymıştır, bağ maddesi DNA ise, nükleozom oktamer yüzeyinde nükleozomal DNA, bir kısıtlama enzimi ile kesilmesi büyük ölçüde erişilmez olduğu gerçeğinden yararlanır ^10,11,12. Nükleozom yeniden modelleme enzim, yarışmacının ¹³ ile çıkarılamaz substratına çok sıkı bir şekilde bağlanan bu tür bir deneyi de durumunda özellikle yararlı olabilir.

Bizim nükleozom kayar ve deneyler, doğal Hela hücresi histonlarla hazırlanan mononucleosomal substratlar kullanılarak INO80 aktivitelerini ölçmek bağlayıcı. Bununla birlikte, INO80 veya başka kromatin biçimlenme enzim aktiviteleri biçimlenme prensipte varlığında veya spesifik post-translasyonel modifikasyonlar ya da histon varyantlarının yokluğu ile etkilenebilir. Ayrıca, mononucleosomes di-nükleozomlann daha farklı INO80 Kompleksin faaliyetleri uyarabilir,veya nükleozomlann bir dizi. Böylece, daha karmaşık ve çeşitli nükleozomal substratı kullanılarak ölçüm INO80 Kompleksin faaliyetleri INO80 kromatin remodeling kompleksleri düzenlenir hangi mekanizma fikir sağlayabilir.

Nükleozom yeniden bağlama deneylerinde ve radyo-etiketli DNA fragmanlarının kullanımına bir alternatif olarak, bazı araştırmacılar, etidyum bromür ile ¹⁴ nükleozomal DNA boyanarak nükleozom ve / veya DNA görselleştirmek; Bununla birlikte, deneyler, tipik haliyle çok daha fazla enzim kullanımını gerektiren, bu protokolde tarif edilen ve çok daha az hassas olduğu, non-radyoaktif ölçüm yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Burada açıklanan ³² p-temelli test kullanılarak zamanın bir fonksiyonu olarak ATPaz reaksiyonların ilerleyişini izleme her zaman noktasında, numune işleme ve analizi turunu gerektirir. Alternatif bir yaklaşım olarak, ATPaz aktivitesi flüoresan bazlı deneyler kullanılarak ölçülebilir ^{floresans sinyalinin değişimi kolay, böylece gerçek zamanlı olarak alt-tabakanın ürüne dönüşüm daha iyi takip imkanı sağlayan, gerçek zamanlı olarak izlenmesini avantajını 15,16. Bu tahliller, ancak, teknik olarak zor ve burada açıklanan deneyde daha genel az duyarlı vardır yapabilirsiniz.}

Bu JOVE yazıda anlatılan prosedürler ATP'ye bağımlı nükleozom biçimlenme işleminde INO80 veya INO80 subcomplexes üç farklı biyokimyasal özelliklerini karakterize etmek için kullanılmaktadır. Çeşitli INO80 subcomplexes veya bu deneylerde INO80 mutantları kullanılarak, INO80 nükleozom yeniden şekillenme aktivitesi için çeşitli INO80 alt birimlerde ve / veya etki yapılarının işlevsel katkı incelemek için ve yeniden modellenmesine reaksiyonunda adım (lar) tanımlanması mümkündür hangi alt-birimleri INO80 ve / veya etki önemli olabilir. Bu prosedürler diğer nucleosome yeniden incelenmesi ve bağlayıcı enzimlerin ve ATPazların w için adapte edilebiliri'inci DNA- ve-nucleosome bağımlı ya da bağımsız faaliyetleri hem de. Biz farklı kromatin remodeling enzimler insan INO80 kompleksi daha yüksek veya daha düşük içsel ATPaz veya nucleosome yeniden şekillenme faaliyetleri var unutmayın. Diğer kromatin remodeling enzim analiz için bu protokollerin uyarlanması, sözkonusu enzimlerin çalışılan için Dolayısıyla, bir tahlilleri optimize etmek için enzim, ATP, nükleozomlann DNA ya da, ve tepkime süreleri ve / veya sıcaklıklarına konsantrasyonlarının değişmelidir.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Work in the authors' laboratory is supported by a grant from the National Institute of General Medical Sciences (GM41628) and by a grant to the Stowers Institute for Medical Research from the Helen Nelson Medical Research Fund at the Greater Kansas City Community Foundation.