فحوصات البيوكيميائية لتحليل أنشطة ATP التي تعتمد على لونين إعادة عرض الانزيمات

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

وتشمل المجمعات SNF2 الكروماتين الأسرة على إعادة عرض مثل SNF2 المركزية أتباز فرعية ^1،2. ATPases بعض الوظائف مثل SNF2 كإنزيمات فرعية واحدة، في حين يعمل آخرون مثل الوحيدات الحفاز من أكبر المجمعات متعددة فرعية. توضيح الآليات الجزيئية التي فيها كل من مفارز الكروماتين تساهم المجمعات إعادة عرض لأنشطتها يتطلب القدرة على أداء فحوصات البيوكيميائية التي تشريح عملية التجديد.

إعادة عرض النيوكليوسومات ATP التي تعتمد من قبل مجمع INO80 البشري وغيرها من لونين إعادة عرض الانزيمات يمكن تصوره على أنه عملية متعددة الخطوات التي تبدأ مع ملزمة للانزيم إعادة عرض لnucleosomes، تليها تفعيل DNA- و / أو النيوكليوسومات التي تعتمد أتباز، إزفاء للانزيم إعادة عرض على الحمض النووي nucleosomal، وإعادة تموضع في نهاية المطاف nucleosomes ^1،2. فهم التفاصيل الجزيئية لعملية إعادة عرض الكروماتين ص تعتمد على ATPequires تشريح للتفاعل إعادة عرض في خطواتها الفردية وتعريف بمساهمات مفارز الفردية للمجمع لونين إعادة عرض لكل خطوة من خطوات التفاعل. مثل هذه التحليلات تتطلب القدرة على تحليل إعادة النيوكليوسومات وغيرها من الأنشطة باستخدام ركائز الجزيئية المحددة في المختبر.

في البروتوكول إن الرب السابق، وصفنا الإجراءات المستخدمة لتوليد INO80 المجمعات إعادة عرض الكروماتين وsubcomplexes مع مكونات فرعية محددة ^3. هنا، نقدم ثلاثة فحوصات البيوكيميائية التي تمكن التحليل الكمي للالنيوكليوسومات ملزمة، DNA- والنيوكليوسومات تنشيط أتباز، وأنشطة إعادة النيوكليوسومات المرتبطة بهذه المجمعات.

1. ATP-تعتمد النيوكليوسومات إعادة عرض فحوصات

لقياس ATP-تعتمد الأنشطة النيوكليوسومات إعادة عرض، immunopurified INO80 أو يتم تحضين subcomplexes INO80 مع ATP والركيزة mononucleosomal، الذي يحتوي على جسيم نووي واحد المتمركزة على واحدة من نهاية جزء DNA-BP 216، وصفت ^P-32. ثم يتعرضون المنتجات رد فعل الكهربائي في المواد الهلامية بولي أكريلاميد الأصلية.

1. لتوليد ف المسمى "601" جزء DNA ^32، تضخيم من pGEM-3Z-601 ⁴ جزء DNA 216 BP تحتوي على 601 تسلسل المواقع النيوكليوسومات-وضع نهاية، وذلك باستخدام [أليغنوكليوتيد 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG و5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG و إلى الأمام وعكس الاشعال.
   1. انشاء 100 ميكرولتر PCR رد فعل كما هو موضح في الجدول 1.
   2. إجراء تفاعلات PCR في cycler الحرارية باستخدام البرنامج التالي: 1 دقيقة في 96 درجة مئوية، واتباعها!د بنسبة 45 ثانية في 94 درجة مئوية، و 30 ثانية في 57 ° C، 60 ثانية عند 72 درجة مئوية لمدة 30 دورات. تنتهي مع 7 دقائق عند 72 درجة مئوية.
   3. بعد الانتهاء من رد فعل PCR، وإزالة النيوكليوتيدات الفردية عن طريق تمرير المنتجات رد فعل مرتين من خلال الأعمدة تدور nuclease خالية.
   4. تشغيل 5 ميكرولتر من المنتج PCR المنقى في 1.2٪ هلام الاغاروز للتأكد من أن رد فعل PCR إنشاء المطلوب ~ 216 DNA بي بي شظية.
   5. تمييع 5 ميكرولتر من المنتج PCR المنقى 20 أضعاف، وقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية. ومتوسط ​​العائد هو ~ 40 نانوغرام / ميكرولتر.
   6. قياس النشاط الإشعاعي من 1 ميكرولتر من المنتج PCR المنقى في عداد التلألؤ. تقدير كفاءة التوسيم عن طريق حساب الكلفة لكل ألف / نانوغرام. ومن المتوقع أن تسفر ~ 15،000 نسخة في الدقيقة / 601 نانوغرام من الحمض النووي جزء رد فعل التوسيم الناجح.
2. نقل nucleosomes خلية هيلا على 601 المسمى DNA باستخدام طريقة التخفيف المتسلسل ^5.
   1. مزيج من 2 بمول³² 601 شظية مع الحمض النووي المسمى P 6 ميكروغرام من nucleosomes هيلا (المعد كما هو موضح ⁵⁾ في 50 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على 1.0 M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، 0.1 ملي PMSF، و1 ملم DTT واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   2. بالتتابع تمييع الخليط إلى 0.8 M، M 0.6، و 0.4 M كلوريد الصوديوم عن طريق التخفيف مع 12.5 ميكرولتر، ميكرولتر 20.8، و 41.6 ميكرولتر، على التوالي، من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة)، 1 ملم EDTA، 0.1 ملي PMSF، و 1 ملم DTT، مع الحضانة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية بعد كل تخفيف.
   3. وعلاوة على ذلك تمييع الخليط إلى 0.2 M ثم إلى 0.1 M كلوريد الصوديوم عن طريق إضافة 125 ميكرولتر ثم 250 ميكرولتر من نفس العازلة التي تحتوي على 0.1٪ Nonidet P-40، 20٪ الجلسرين، و 200 ميكروغرام / مل BSA، مع الحضانة 30 دقيقة في 30 ° C بين الأخيرين التخفيفات. تخزين الركيزة mononucleosome في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
3. أداء النيوكليوسومات انزلاق ردود الفعل ATP-تعتمد في الحجم الإجمالي من 10 ميكرولتر. الجرميةوترد المكونات ction في الجدول 2. منذ تركيز كلوريد الصوديوم الأمثل لINO80 النشاط النيوكليوسومات إعادة عرض هو ~ 50 مم كلوريد الصوديوم (نتائج غير منشورة)، وضبط التركيز الكلي من كلوريد الصوديوم في كل رد فعل ل50 ملم، مع الأخذ في الاعتبار كمية كلوريد الصوديوم الواردة في استعدادات nucleosomes والانزيم.
   1. قبل البدء في إعداد المقايسات، ويلقي المواد الهلامية بولي أكريلاميد الأم (18 × 16 سم). لإعداد جيل واحد يحتوي على 5٪ الأكريلاميد (الأكريلاميد: bisacrylamide 37.5: 1)، TBE 0.5X (45 ملي تريس بورات، 1 ملم EDTA)، 0.01٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS)، و 0.001٪ N، N، N'، N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)، خلط المكونات المدرجة في الجدول 3. السماح لهلام تتبلمر لا يقل عن 2 ساعة على RT.
   2. وفي الوقت نفسه، لكل رد فعل يتعين القيام بها، والجمع في قبل المبردة صلكنزد أنبوب microcentrifuge 1.5 مل ~ 20 نانومتر INO80 أو INO80 subcomplex (المعد كما هو موضح ³⁾ مع كمية من العازلة EB100 ( الجدول 4) كافية لإعطاء حجم 4.75 ميكرولتر. على الفور إعادة تجميد أي المتبقية الكسور التي تحتوي على INO80 في الثلج الجاف المجفف أو النيتروجين السائل.
   3. انشاء كوكتيل رئيسية مع بقية المكونات، وزيادة بعامل 'X' (حيث X = العدد الكلي للتفاعلات +3). يتم سرد كمية كل عنصر اللازمة لواحد رد فعل 10 ميكرولتر في الجدول 5. يجب تحجيمها وصفة تصل وفقا لعدد من التفاعلات التي يتعين القيام بها. مزيج جيد من خلال الاستفادة من أنبوب أو عن طريق pipetting صعودا وهبوطا مع Pipetman وتدور الأنبوب لبضع ثوان في microcentrifuge الفوق.
   4. الاستغناء 5.25 ميكرولتر من الكوكتيل رئيسية لكل من أنابيب رد فعل بإعدادها في الخطوة 1.3.2. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا. بدء التفاعلات عن طريق نقل أنابيب رد الفعل إلى 30 ° C الحرارة أو كتلة ماء الحمام واحتضان لمدة 2 ساعة.
   5. وفي الوقت نفسه، وإعداد "إزالة مزيج" كوكتيل تحتوي على الحمض النووي منافسوnucleosomes، التحجيم من قبل عامل X (X = العدد الكلي للتفاعلات + 4). يتم سرد كمية كل عنصر اللازمة لإعداد 1.5 ميكرولتر إزالة مزيج لفعل واحد في الجدول 6؛ يجب تحجيمها وصفة يصل اعتمادا على عدد من المقايسات التي يتعين القيام بها.
   6. إنهاء ردود الفعل بإضافة 1.5 ميكرولتر من مزيج إزالة. تخلط جيدا، وتدور إلى أسفل، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى.
   7. وفي الوقت نفسه، قبل تشغيل هلام بولي أكريلاميد الأصلي في وحدة الكهربائي العمودي في 100 فولت لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وذلك باستخدام 0.5X TBE كما يعمل عازلة مع شريط مغناطيسي داخل مجلس النواب للحفاظ على دوران مستمر عازلة.
   8. لتحميل عينة، إضافة 2.5 ميكرولتر من صبغ تحميل تحتوي على TBE 3X، و 30٪ الجلسرين، 0.25٪ برموفينول الأزرق، و 0.25٪ الزيلين Cyanol FF. تخلط جيدا، وتدور لفترة وجيزة العينات، وتحميلها على هلام باستخدام نصائح تحميل.
   9. تشغيل هلام في 200 V ل 4.5 ساعة في 4 درجات مئوية مع دوران العازلة.
   10. للكشف عن إشارة، ونقل هلام إلى كومة من ورقتين من ورق الترشيح. التفاف ورقة الترشيح مع هلام على رأس باستخدام التفاف البلاستيك الشفاف، ثم تعريضها إلى شاشة تخزين الفوسفور في 4 درجة مئوية لمدة الوقت المطلوب.
   11. مسح الشاشة مع نظام الماسح الضوئي التصوير النظير وتحليل البيانات باستخدام البرمجيات المناسبة.

2. Mononucleosome ملزم فحوصات

لفحص تقارب ملزم من مجمع INO80 نظرا لmononucleosomes، إجراء التحول الكهربي التنقل الفحص (EMSA) باستخدام الركيزة mononucleosomal إنشاؤها في الخطوة 1.2.

1. إعداد رد فعل يمزج لفحوصات ملزمة كما هو موضح لفحوصات إعادة النيوكليوسومات لكن حذفت ATP وإزالة مزيج من التفاعلات؛ احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. إضافة 2.5 ميكرولتر من صبغ لتحميل كل خليط التفاعل، وتنطبق على هلام بولي أكريلاميد الأصلية التي تحتوي على مادة الأكريلاميد 3.5٪ (الأكريلاميد: مكرر 37.5: 1)، 1٪ الجلسرين، TBE 0.5X، 0.01٪ APS، و 0.001٪ TEMED.
3. باستخدام 0.5X TBE كما يعمل العازلة، تشغيل هلام في 200 V 2.5 ساعة في 4 درجات مئوية مع دوران العازلة وفضح إلى شاشة تخزين الفوسفور.

3. DNA- والنيوكليوسومات التي تعتمد على فحوصات أتباز

إجراء فحوصات أتباز في مخاليط رد فعل 5 ميكرولتر تحتوي على 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 60 مم كلوريد الصوديوم، 6.6 ملم MgCl _2، 0.8 ملي EDTA، 0.015٪ Nonidet P-40، 2.5٪ الجلسرين، 0.1 ملغ / مل BSA، 1 ملي DTT، 0.1 ملي PMSF، 2 مم ATP، 2 μCi من [α- ³² P] ATP (3،000 تسى / ملمول). لكل مجمع INO80 أو كمية مجمع INO80 أن يعاير إقامة ثلاثة ردود فعل موازية، واحدة تحتوي على عازلة EB100 لقياس DNA- أو جسيم نووي مستقل أتباز، واحدة تحتوي على الحمض النووي بلازميد دائرية مغلقة (5،000 نقطة أساس، ~ 30 نانومتر) لقياس DNA- أتباز المعالين، واحدة تحتوي على هيلا oligonucleosomes (~ 185 نانومتر) لقياس النيوكليوسومات التي تعتمد أتباز. إعداد كافة ردود الفعل على الجليد.

وتشير الأرقام نتائج ممثلة من فحوصات البيوكيميائية المستخدمة لتوصيف الأنشطة INO80، بما في ذلك النيوكليوسومات انزلاق (الشكل 1) وملزمة (الشكل 2) المقايسات وDNA- أو المقايسات أتباز تعتمد على النيوكليوسومات (الشكل 3).

التجربة هو مبين في الشكل 1 يقارن قدرة المجمعات INO80 سليمة تنقيتها من خلال FLAG-Ies2 أو FLAG-INO80E وINO80 subcomplexes تنقيتها من خلال إما FLAG-Ino80ΔN أو Ino80ΔNΔHSA لتحفيز إعادة تشكيل mononucleosomes تجميعها على 216 نقطة أساس، جزء DNA رديولبلد. موقف جسيم نووي على جزء الحمض النووي يؤثر التنقل الكهربي. أفقيا nucleosomes وضع تشغيل أسرع في هلام أكثر من nucleosomes وضع مركزيا. منذ المجمعات إعادة INO80 الكروماتين تفضيلي mononucleosomes تتحرك نحو وسط قطعة من الحمض النووي ^6،7،8، والنشاط هو إعادة عرض مونيtored بظهور عدد سكانها nucleosomes التي تظهر انخفاض التنقل الكهربي. في نهاية التفاعل، يجب إضافة جود فائض من oligonucleosomes هيلا والحيوانات المنوية السلمون أو DNA الآخر في مزيج التفاعل ومنافس لإزالة أي INO80 أو INO80 subcomplexes محددة الركيزة، منذ إعادة انزيم ملزمة ستغير التنقل الكهربي من النيوكليوسومات الركيزة. المجمعات تنقيتها من خلال Ino80ΔN FLAG تفتقر إلى مفارز metazoan محددة INO80D، INO80E، أميدا، MCRS1، NFRKB، وUCH37، في حين تفتقر أيضا المجمعات تنقيتها من خلال Ino80ΔNΔHSA Arp4، Arp8، وYY1. المجمعات تنقيتها من خلال FLAG-Ies2، FLAG-INO80E، وFLAG-Ino80ΔN لها أنشطة مماثلة، مشيرا الى ان مفارز metazoan محددة هي الاستغناء عنها لإعادة النيوكليوسومات من قبل مجمع INO80. في المقابل، تنقية المجمعات من خلال FLAG-Ino80ΔNΔHSA غير نشطة في هذا الاختبار، مشيرا إلى أن إعادة النشاط يعتمد على نطاق هائل سعيد أنعم للIno80 ATPبورصة عمان و / أو الوحدات الفرعية المرتبطة بها.

التجارب في الشكل 2 مقارنة لالنيوكليوسومات أنشطة INO80 وINO80 subcomplexes باستخدام التنقل الكهربي المقايسات تحول ملزمة. يتم تنفيذ هذه المقايسات على غرار فحوصات إعادة جسيم نووي، إلا أنه لا يوجد إضافة oligonucleosomes والحمض النووي في ختام رد فعل لإزالة مجمعات للالنيوكليوسومات ملزمة. وفقا لذلك، حضانة nucleosomes مع كميات متزايدة من المجمعات INO80 سليمة تنقيتها من خلال الوحيدات INO80E يؤدي إلى اختفاء تعتمد على الجرعة من الفرقة الموافق mononucleosomes مجانا وظهور الجديد 'تحول' الأنواع التي تهاجر بالقرب من أعلى هلام (الممرات 6-8). في المقابل، عندما يتم تحضين nucleosomes مع المجمعات الصغيرة التي تم تنقيتها من خلال Ino80ΔN والتي تفتقر إلى مجموعة فرعية من مفارز INO80، والأنواع تحول يهاجر بسرعة أكبر (الممرات 2-5 و 9-11)، مما يوحي بأن الغوغاء النسبييتم تحديد ility من الفرقة تحول عظمى بحجم المجمعات يعاير.

الشكل 3 يبين نتائج مقايسة مقارنة DNA- والأنشطة أتباز تنشيط النيوكليوسومات اثنين subcomplexes INO80 مختلف. البقع المهاجرة أكثر ببطء تتوافق مع انطلاق α- ³² P صفت ATP، والأنواع المهاجرة بسرعة أكبر من المنتجات رد فعل ADP. الأسهم تشير إلى اتجاه الهجرة المذيبات.

واحدة من المجمعات يعاير هنا، INO80ΔN، يتضمن فرعية Ino80 أتباز الذي يمتد إلى وضعها الطبيعي C-محطة البروتين، في حين أن البعض، INO80ΔNC، تفتقر المنطقة C-محطة Ino80. على الرغم من هذه المجمعات اثنين متطابقة خلاف ذلك، فإن معدل التحلل المائي ATP (تقاس تحويل ATP المسمى الراديو لADP) هو أكبر في وجود INO80ΔNC، مما يشير إلى C-محطة من Ino80 أتباز قد سلبا تنظيم نشاطها. نلاحظ أن معدل ATP هيدروليكيةolysis من قبل كل من أكبر المجمعات في وجود nucleosomes من الحمض النووي، مما يشير إلى النيوكليوسومات INO80 إعادة عرض المجمعات تفضل ركائز nucleosomal لاعبي التنس المحترفين المائي.

في مقايسة هو مبين في الشكل، هو فقط هناك مستوى منخفض جدا من ATP المائي في ردود الفعل التي تفتقر DNA أو nucleosomes (تتراوح بين غير قابل للكشف إلى <5٪ من تلك التي لوحظت في وجود الحمض النووي / nucleosomes). لأن النشاط أتباز من INO80 وغيرها من الانزيمات إعادة عرض SNF2 الكروماتين الأسرة تشجيعا قويا من DNA أو nucleosomes، فإن وجود DNA- كبيرة و / أو النشاط أتباز جسيم نووي مستقل في الأعمال التحضيرية المنقى من مجمع INO80 توحي وجود تلوث الخلوية DNA، أو بدلا من ذلك، وتلويث ATPases غير INO80 التي لم يتم إزالتها بنجاح خلال تنقية. ويمكن اتخاذ العديد من الخطوات للحد من إدخال الحمض النووي غير المرغوب فيها و / أو أتباز خلال تنقية.

1) زيادة قتركيز بديل (كلوريد الصوديوم) في الخطوات الملزمة والغسيل خلال تنقية. استخدام أقل من 200 مم كلوريد الصوديوم في ملزمة وغسل الخطوات عادة ما ينتج الاستعدادات المجمعات إعادة عرض مع مستويات غير مقبولة من تلويث الحمض النووي و / أو ATPases. نحن بشكل روتيني تنقية المجمعات INO80 باستخدام العازلة التي تحتوي على 450 ملي كلوريد الصوديوم لتقليل الملوثات (وصفها في ^3). وقد استخدمنا مخازن تحتوي على قدر 1 M كلوريد الصوديوم لتنقية المجمعات INO80 النشطة. إلا أننا الحصول على العائد انخفض من مجمعات نشاطا في ظل هذه الظروف.

2) تقليل نسبة FLAG الاغاروز لالمحللة خلية أثناء immunopurification. يجب تحديد المبلغ الأمثل للFLAG-الاغاروز بواسطة المعايرة.

3) مرافقين تعتمد على ATP قد تظل ملزمة للبروتينات الموسومة FLAG خلال immunopurification. هذه كثيرا ما يمكن إزالته من قبل بما في ذلك 1 ملي ATP في المخزن المؤقت أثناء غسل immunopurification.

4) لدينا النجاحذ أخرجت تلويث الحمض النووي من قبل بما في ذلك benzonase بتركيز 25 وحدة / مل خلال حضانة استخراج مع الخرز FLAG الاغاروز. تنبيه: من الضروري لجعل تتم إزالة متأكد benzonase خلال خطوات الغسيل اللاحقة، كما الدناز المتبقية سوف تتحلل DNA الركيزة أو nucleosomes خلال فحوصات للنشاط INO80.

تفسير هذه المقايسات أتباز يمكن، من حيث المبدأ، أن تكون معقدة بسبب حقيقة أن المجمعات INO80 الكروماتين إعادة تحتوي على عدة ATPases المحتملة، بما في ذلك SNF2 تشبه الأساسية أتباز Ino80، مثل الأكتين البروتينات Arp5، Arp8، Baf53a، الأكتين، وAAA + ATPases Tip49a وTip49b. على الرغم من الوجود المادي للATPases متعددة، ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات السابقة أن المجمعات الوحيدة التي تحتوي على ناشطة تحفيزيا Ino80 يمكن أن تدعم DNA- أو النيوكليوسومات تنشيط ATP التحلل. المجمعات التي تحتوي على شكل غير نشط E653Q حفاز من Ino80 أتباز تفشل لعرض DNA- كشفها أو حفز النيوكليوسومات أتباز تشغيل إشاراتvity تحت أي ظرف من الظروف اختبارها ^8. وهكذا، وساهم DNA- و / أو حفز النيوكليوسومات النشاط أتباز من INO80 أو subcomplexes INO80 أساسا من الوحيدات Ino80 أتباز.

الرقم 1. INO80 النشاط النيوكليوسومات إعادة يعتمد على المجال Ino80 هائل سعيد أنعم و / أو وحدات فرعية ترتبط ولكن مستقلة عن Ino80 NTD ومفارز metazoan محددة. أجريت فحوصات إعادة النيوكليوسومات مع مجمعات للimmunopurified FLAG من مقتطفات النووية المعدة من خطوط الخلايا معربا عن FLAG الإصدارات -tagged من النوع البري أو مفارز INO80 متحولة. تم تنقيته المجمعات INO80 سليمة من خطوط الخلايا معربا عن FLAG-Ies2 أو FLAG-INO80E. تم تنقيته subcomplexes INO80 من خطوط الخلايا معربا عن FLAG-Ino80ΔN أو FLAG-Ino80ΔNΔHSA. والتركيز النسبي (نسبي اضرب.) من 1 يناظر ~ 10 نانومتر مجمع INO80. أ href = "https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51721/51721fig1highres.jpg" الهدف = "_ على بياض"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. النيوكليوسومات ملزمة من قبل مجمع INO80 مستقلة عن Ino80 NTD ومفارز metazoan محددة. أجريت فحوصات ملزمة النيوكليوسومات في وجود كميات متفاوتة من مجمع INO80-immunopurified FLAG المشار إليه. ربط INO80 أو subcomplexes INO80 إلى mononucleosomes النتائج في ظهور العصابات المهاجرة بطيئة "فائقة تحول" الموافق mononucleosomes مستقر ملزمة INO80 أو subcomplexes INO80. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51721 / 51721fig3highres.jpg "/>
الرقم 3. DNA- والمقايسات التي تعتمد أتباز النيوكليوسومات. TLC (طبقة رقيقة اللوني) ومقرها أجريت فحوصات أتباز لقياس معدل ATP التحلل بواسطة INO80 subcomplexes تنقيتها من خلال FLAG-Ino80ΔN (ΔN) أو FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC) في وجود تشبع كميات من الحمض النووي أو nucleosomes. أجريت فحوصات باستخدام اثنين من تركيزات مختلفة من كل مجمع (5 نانومتر و 10 نانومتر) وثلاث مرات رد فعل مختلفة. يشار إلى كمية ATP تحلل (في بمول) في التفاعلات تحت كل لوحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول مزيج 1. رد الفعل لPCR التضخيم من رديولبلد جزء الحمض النووي "601".

الجدول 2. مكونات النيوكليوسومات ATP التي تعتمد على إعادة عرض المقايسات.

الجدول 3. إعداد هلام بولي أكريلاميد الأصلي للالنيوكليوسومات إعادة عرض المقايسات التي تعتمد على ATP.

الجدول 4. عازلة EB100.

الجدول 5. مكونات كوكتيل رئيسية لإعادة عرض النيوكليوسومات المقايسات التي تعتمد على ATP.

الجدول 6. إزالة خليط كوكتيل.

لضمان إعادة النيوكليوسومات والأنشطة أتباز نلاحظ في المقايسات تعتمد على النشاط التحفيزي المجمعات INO80، وليس على إعادة تلويث و / أو الأنزيمات أتباز، فإننا النيوكليوسومات الفحص بشكل روتيني ويعيد النشاط أتباز من الإصدارات نشطة حفاز المجمعات INO80، طهروا في بالتوازي مع النوع البري INO80 باستخدام نفس الإجراء. عنصر تحكم رد الفعل السلبي تفتقر ATP ينبغي أيضا أن يؤديها عندما يعاير النشاط إعادة النيوكليوسومات لاختبار وجود تلوث ATP و / أو أنشطة إعادة ATP-المستقلة، والتي يمكن أن تعقد تفسير التجارب بمقارنة أنشطة استعدادات مختلفة من مجمع INO80 أو subcomplexes. حفاز الإصدارات نشطة من INO80 أو subcomplexes INO80 يجب أن تظهر أي إعادة جسيم نووي أو أنشطة أتباز. بالإضافة إلى ذلك، كشف DNA- أو جسيم نووي مستقل النشاط أتباز يدل على وجود تلوث أتباز (ق) في انزيماتالبريد الكسر. إذا كان لا يزال يتم الكشف النشاط في وجود حفاز Ino80 غير نشطة أو إذا كان هناك DNA- كبيرة أو نشاط أتباز جسيم نووي مستقل حتى بعد تحسين تنقية كما هو موضح في "ممثل النتائج،" المجمعات يمكن تنقيتها باستخدام مزيد من الخطوات الإضافية مثل التبادل الأيوني أو هلام الترشيح أو الترسيب التدرج اللوني.

عند قياس إعادة النيوكليوسومات والأنشطة أتباز، فإنه من المستحسن لإجراء فحوصات لفترات زمنية مختلفة ومع تركيز أكثر من INO80 أو subcomplexes INO80 لضمان يتم أخذ القياسات عندما المنتج لمرة ومنحنيات الاستجابة للجرعة هي الخطية. وبالمثل، ينبغي إجراء فحوصات النيوكليوسومات ملزمة باستخدام عدة تركيزات من مجمع INO80 (الخانات). خلاف ذلك، لا يمكن مقارنة موثوق أنشطة الاستعدادات INO80 مختلفة.

النيوكليوسومات منزلقة وينبغي أن تشمل فحوصات ملزمة دائما ردود فعل السيطرةالتي تشمل mononucleosome الركيزة وحده كعلامة لإظهار التنقل الكهربي من السكان النيوكليوسومات البدء. بهذه الطريقة، يمكن للمرء بسهولة تحديد التغييرات الناجمة خصيصا لحضور جزء الانزيم. ردود الفعل تحكم هذه أيضا تقييم سلامة mononucleosomes تشكيلها.

من أجل إجراء النيوكليوسومات التأويل بالانزلاق بسهولة والمقايسات ملزمة، فمن المفيد لتوليد ركائز mononucleosomal متجانسة. لهذا السبب، الفحص الموصوفة في هذا البروتوكول يستخدم nucleosomes تجميعها على جزء DNA تحتوي على تسلسل قوي النيوكليوسومات تحديد المواقع. على الرغم من أن مجمع INO80 يميل إلى إعادة nucleosomes وضعه أفقيا إلى موقع أكثر مركزية على جزء الحمض النووي، وغيرها من لونين إعادة عرض الإنزيمات، مثل مجمع NURF ISWI التي تحتوي على ^9، تتحرك nucleosomes من أكثر المواقع المركزية نحو نهايات شظايا الحمض النووي. وهكذا، خلال توصيف أي إعادة عرض الكروماتين ENإنزيم من المفيد إعداد ركائز mononucleosome التي تتابع المواقع النيوكليوسومات هو في مواقع مختلفة. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن استخدام ركائز التي تم تجميعها nucleosomes على شظايا الحمض النووي من دون تسلسل المواقع جسيم نووي. في هذه الحالة، سوف تشمل السكان النيوكليوسومات بدءا خليط من nucleosomes أكثر مركزيا وضعه أفقيا.

يمكن أن تؤدي عملية إعادة النيوكليوسومات ATP التي تعتمد على إعادة عرض نتائج مختلفة، بما في ذلك التشريد التام النيوكليوسومات من الحمض النووي، حركة جسيم نووي على الحمض النووي، أو تغيرات عابرة في هيكل النيوكليوسومات التي قد لا تؤدي إلى تغييرات في مواقف nucleosomes عندما يصل رد الفعل التوازن ولكنها مع ذلك كبيرة وظيفيا. وصف النيوكليوسومات انزلاق الفحص يمكن رصد ردود الفعل الأولين، ولكن قد لا تكون قادرة على الكشف عن التعديلات عابرة في هيكل جسيم نووي. واحد الفحص التي يمكن الكشف عن بعض هذا بديل عابرعمليات التشغيل يستفيد من حقيقة أن الحمض النووي nucleosomal على سطح octamer النيوكليوسومات غير قابلة للوصول إلى حد كبير إلى قطع بواسطة إنزيم تقييد، في حين رابط DNA الذي شردوا من سطح octamer بواسطة النيوكليوسومات انزلاق أو الفك الجزئي للDNA nucleosomal هو عرضة للقطع ^10،11،12. مثل هذا الفحص يمكن أيضا أن تكون مفيدة بشكل خاص في حالة ما الانزيم إعادة النيوكليوسومات حتى يتحد بقوة إلى ركيزة لها أنه لا يمكن إزالتها عن طريق منافس ^13.

لدينا النيوكليوسومات انزلاق وملزمة فحوصات قياس الأنشطة INO80 باستخدام ركائز mononucleosomal أعدت مع الأم الهستونات خلية هيلا. ومع ذلك، وأنشطة إعادة عرض من INO80 أخرى أو لونين إعادة عرض الانزيمات يمكن من حيث المبدأ أن تتأثر وجود أو غياب التعديلات بعد متعدية محددة أو متغيرات هيستون. وبالإضافة إلى ذلك، قد mononucleosomes تحفيز أنشطة مجمع INO80 بشكل مختلف من دى nucleosomes،أو مجموعة من nucleosomes. وهكذا، والأنشطة قياس مجمع INO80 باستخدام أكثر تعقيدا وتنوعا nucleosomal الركيزة قد توفر نظرة ثاقبة الآلية التي تنظم المجمعات INO80 إعادة عرض الكروماتين.

كبديل لاستخدام شظايا الحمض النووي رديولبلد في إعادة النيوكليوسومات والمقايسات ملزمة، بعض المحققين تصور nucleosomes و / أو عن طريق الحمض النووي DNA nucleosomal تلطيخ مع بروميد إيثيديوم ^14؛ مع ذلك، قام فحوصات باستخدام طرق الكشف غير المشعة يمكن أن يكون أقل حساسية بكثير من تلك التي وصفها في هذا البروتوكول، والتي تتطلب عادة استخدام أكثر من ذلك بكثير الانزيم.

رصد التقدم المحرز في ردود الفعل أتباز بوصفها وظيفة من الوقت باستخدام مقايسة أساس ^P-32 هو موضح هنا يتطلب جولات منفصلة لمعالجة العينات وتحليلها في كل نقطة زمنية. كنهج بديل، والنشاط أتباز يمكن قياسها باستخدام فحوصات على أساس مضان ^{و15،16، والتي تستفيد من حقيقة أن تغيير إشارة مضان يمكن رصدها بسهولة في الوقت الحقيقي، وبالتالي توفير فرصة أفضل لتتبع تحويل الركيزة إلى المنتج في الوقت الحقيقي. ويمكن لهذه المقايسات، ومع ذلك، يكون تحديا فنيا وتكون بشكل عام أقل حساسية من الفحص هو موضح هنا.}

وقد استخدمت الإجراءات وصفنا في هذه الورقة إن الرب لتوصيف ثلاث خصائص كيميائية حيوية مختلفة من INO80 أو INO80 subcomplexes في عملية ATP التي تعتمد على النيوكليوسومات إعادة عرض. باستخدام مختلف subcomplexes INO80 أو المسوخ INO80 في هذه المقايسات، فمن الممكن لتشريح المساهمات الوظيفية لمختلف مفارز INO80 و / أو هياكل المجال إلى إعادة النشاط INO80 النيوكليوسومات وتحديد الخطوة (ق) في رد فعل على إعادة عرض الذي مفارز INO80 و / أو مجالات قد تكون مهمة. ويمكن تكييف هذه الإجراءات لإعادة دراسة أخرى النيوكليوسومات والانزيمات ملزمة وATPases ثإيث كلا DNA- والأنشطة التي تعتمد على النيوكليوسومات أو مستقلة. نلاحظ أن مختلف الكروماتين إعادة عرض الإنزيمات قد يكون لها أنشطة أتباز أو إعادة النيوكليوسومات أعلى أو أقل جوهرية من مجمع INO80 البشري. وبالتالي، عندما تكيف هذه البروتوكولات لتحليل إنزيمات أخرى لونين إعادة عرض، ينبغي للمرء أن تختلف تركيزات الانزيم، ATP، DNA أو nucleosomes، وأوقات رد الفعل و / أو درجات الحرارة من أجل تحسين فحوصات لأنزيمات معينة تجري دراستها.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Work in the authors' laboratory is supported by a grant from the National Institute of General Medical Sciences (GM41628) and by a grant to the Stowers Institute for Medical Research from the Helen Nelson Medical Research Fund at the Greater Kansas City Community Foundation.