Method Article
Biz üç test örneklerinin hazırlanması ve nasıl optimize etmek ve STORM mikroskoplar performansını değerlendirmek için kullanılır açıklar. Bu örnekleri kullanarak biz ham veri almak ve daha sonra yaklaşık 30-50 nm çözünürlükte hücrelerinde süper çözünürlüklü görüntüleri elde etmek işlemek için nasıl gösterir.
FIRTINA standart floresan mikroskopi teknikleri en fazla 10 kat daha iyi çözünürlük ile yeni geliştirilen süper-çözünürlük mikroskopi tekniktir. Görüntü bir görüntü molekülü-by-molekülü oluşturarak, normalden çok farklı bir şekilde elde edilir Ancak, onların görüntü alımı optimize etmek için çalışırken kullanıcılar için bazı önemli sorunlar vardır. Bu süreci yardım ve FIRTINA biz 3 deney numunelerinin hazırlanması ve 30-50 nm arasında tipik çözünürlük ile süper çözünürlük görüntüleri edinme ve işleme fırtına metodoloji mevcut nasıl daha fazla fikir kazanmak için. Serbestçe kullanılabilir yağmur fırtınası işleme yazılımı kullanımı ile test örnekleri birleştirerek görüntü kalitesi ve çözünürlüğü hakkında bilgi büyük bir anlaşma elde etmek mümkündür. Bu ölçümleri kullanarak bu hazırlama, boya seçimi, tampon koşulları ve görüntü alma ayarları örnek, optik gelen görüntüleme işlemi optimize etmek mümkündür. BizBu tür görüntü alımı ve yoğunluğu sırasında numune hamle 'mislocalization' fenomen sonuçlanan ilgili sorunlar yanal sürüklenme, kötü görüntü kalitesine yol bazı ortak sorunlar, LSO örnekleri göstermektedir.
Son zamanlarda optik mikroskopi teknikleri bir dizi tipik kırılma sınırını aşmak ve 100 nm veya 1,2 daha iyi çözünürlükte görüntü üretebilir süper çözünürlüklü mikroskopi veya nanoscopy, olarak adlandırılan, geliştirilmiştir. 2008 yılında yılın Doğa Yöntemleri yöntem olarak süper çözünürlüklü mikroskopi açıklanmasından bu yana, lokalizasyon tabanlı mikroskoplar geliştirme büyük bir olmuştur. Örneğin, çok renkli uygulamalar 3-6, 3D uygulamaları 7-12 ve hatta canlı hücre uygulamaları 5,13-17 vardır. Bu sistemler hücre biyologların eline optik laboratuvarları dışında ticari ediliyor ve artık kendi yolunu yapıyoruz Dahası, biyomedikal sorulara verdikleri kullanımı ve uygulama daha artış olması muhtemeldir.
Bu ailenin bir dal bir görüntü molekülü-by-molekülü oluşturarak işe yerelleştirme-tabanlı yöntemler olduğunu. Bensadece bir kaç uzamsal olarak ayrılmış moleküller herhangi bir zamanda aktif olan, böylece bu yapmak için n düzeni, numune içindeki floresan moleküller çoğunluğunun kapatılmalıdır. Bu moleküller daha sonra hızla açılıp kapatılır ve nüfusun önemli bir kısmı alt kırınım hassasiyetle temel yapısını yansıtacak şekilde görüntülü o kadar çok görüntü alınır. Yaklaşımlar bir dizi GSDIM 18, PALM 19, fPALM 20, STORM 21 ve RESOLFT 22 dahil yayınlanmıştır. Tek bir molekül algılama konumunu ölçmek algoritmaları daha sonra örneğin rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, 12, ve bir yağmur fırtınası palm3d 27 Gauss montaj 23 ile 20 nm'den daha iyi kesinleşmemiş ile molekülün gerçek konumunu bulmak için de kullanılabilir. Hücre ya da yüksek molekül yoğunluğa sahip diğer biyolojik örnekler, görüntüleme, bu çerçevelerin binlerce almak nedenle gerekliBu, konumsal olarak ayrılmış, yanıp sönen bir görüntü için Etiketlenmiş moleküllerin önemli bir bölümü olarak işaret etmektedir.
Rasgele optik yeniden mikroskobu (STORM) ve yüksek ölçüde ilişkili dSTORM ve GSDIM yöntemler ticari olarak temin edilebilen organik boyalar 21 ile çalışmak için gösterilmiştir lokalizasyon tabanlı süper çözünürlük yöntemleri vardır. O zamandan beri, çünkü özgüllük ve floresan mikroskobu gerçekleştirmek için köklü immün yaklaşımların göreli kolaylık metodoloji özellikle cazip kılan farklı bir dizi boya için 28-30 için geçerli olduğu gösterilmiştir. Sonuç olarak, lokalizasyon tabanlı süper çözünürlük görüntülemede kullanılmak üzere potansiyeline sahip boya antikoru ve boya-biyomolekül konjugatlarının, bir dizi kolay erişim vardır. STORM ve benzeri yaklaşımların genel ilkeleri nispeten basit ve ilk bakışta donanım ve numune hazırlama nispeten stra görünüyor ikenightforward, yüksek kalite, artifakttan ücretsiz, süper çözünürlüklü görüntüler elde için kritik süreçte adımlar vardır.
Tüm mikroskopi teknikleri olduğu gibi süreç 3 ana adımda düşünülebilir: Birinci, ikinci numune hazırlama, görüntü alma ve, üçüncü, görüntü işleme ve / veya görüntü analizi ve yorumlanması. Ek çözme gücü ve yerelleştirme dayalı bir yaklaşım kullanarak süper çözünürlüklü görüntüler üreten yöntem bazı yeni sorunlar ve düşünceler 31-33 tanıttı. Immün, birincil ve ikincil antikor kombinasyonu kullanıldığında, özellikle dolaylı immünoflüoresans gerçekleştirirken numune hazırlama ile başlayarak, bu floresan boya uzak, ilgi konusu moleküle kadar 20 nm'ye kadar olabileceğini not edilmelidir. Mikrotübül durumunda, bu 25 nm 28,30 beklenen bir mikro tüp çapı ile karşılaştırıldığında, 35-50 nm çap ile sonuçlanır. Ayrıca, etiketleme yoğunluk gerekir mbir yüksek kaliteli görüntü 14 oluşturmak için Nyquist kriterlerini EET. Bir lifli yapı boyunca 20 nm beklenen bir resim çözünürlüğü için örneğin en az her 10 nm 27, bir boya molekülü olmalıdır. Üzerinde denge - birçok boyalar lokalizasyon tabanlı boya genel performansı en az dört önemli kriterlerin, olay anahtarlama başına yani tespit edilen fotonların (parlak iyidir her yanıp sönüyor parlaklık) bir karışımı olan yaklaşımları için çalışmak yayınlanmıştır iken -off görev döngüsü (devlete karşı off boyaların kontrast oranı - daha kapalı genellikle daha iyidir), hayatta kalma fraksiyonu (düşük bir ağartma oranı daha iyidir) ve döngüleri geçiş sayısı (floroforun başına yanıp sayısı - daha fazla floroforla başına 1 yanıp sönme) molekülü sayma amaçlar için bir avantaj olmasına rağmen, yüksek çözünürlük için daha iyidir. Bu durum, bundan başka, herhangi bir boya için, bu özellikler, farklı tampon şartlarında değişir ve gerçeği ile karmaşıkLazer gücü 28,29 ile. Buna ek olarak, aynı zamanda, bu benzersiz STORM düşünceler olarak, görüntü kalitesi sabitleme koşulları modifikasyonu ve söndürme reaktiflerin kullanımı ile otoflüoresanı en aza, örneğin daha geleneksel floresan mikroskopi teknikleri ile aynı şekilde örnek hazırlama optimize ederek arttırılabilir. Ayrıca, spesifik olmayan şekilde bağlanmış florofor minimize etiket konsantrasyonları, inkübasyon süreleri ve blokaj ve yıkama adımları ayarlama yapılabilir ki önemlidir.
Görüntü alımı ikinci adımı da önemlidir. Mikroskop üzerinde optimum ayar boya, tampon koşulları, etiketleme yoğunluğu ve örnek tipi, cam, hücreler ya da doku örnekleri üzerinde, örneğin tekli katmanları bağlıdır. Ana hususlar kamera pozlama süresi, kare sayısı, aydınlatma açısı (TIRF, HILO, Epi) ve lazer güç vardır. Amaç mümkün olduğunca çabuk kadar çok parlak bir konumsal olarak ayrılmış yanıp toplamaktır. Eğer arka irekonstrüksiyon algoritması olarak doğru bir pozisyon lokalize etmek mümkün olmayacaktır, yüksek s veya yanıp söner, çok parlak değildir, başka bir deyişle, sinyal-gürültü oranı kötüdür. Yanı sıra ölçülebilir her molekül konumu ile doğruluk, yani yerelleştirme hassasiyet maksimize olarak, görüntü kalitesi de yerleşimlerin yüksek sayısına bağlıdır. Ilgi moleküllerin sayısı yetersiz yansıması, Nyquist kriterleri 14,27 karşılanmış olmayacak gibi, ya da kötü olması nedeniyle etiketleme verimliliği, aşırı ağartmanın veya yetersiz bir kare sayısına, daha sonra elde edilen süper çözünürlüklü görüntü noktasal ve süreksiz olacak .
Ve son olarak, Üçüncü adım, görüntü işleme, standart floresan mikroskopi teknikleri ile karşılaştırıldığında özellikle önemlidir. W bilmek kafa karıştırıcı olabilir tercih açısından bir avantaj, ve hem de bir dezavantaj serbestçe ve ticari olarak temin edilebilen algoritmaları, bir dizi bulunmaktadırhich kullanmak için en uygun olan. Örneğin ham veri mekansal ayrı yanıp iyi aralıklı varsa o zaman bir tek-molekül uydurma algoritması rainstorm 27 mevcut seyrek uydurma algoritmaları, örneğin son derece doğru ve verimli olabilir, rapidSTORM 24,25, QuickPALM 26 Yazılım 12 palm3d ve . Ham veriler daha sonra uygun olabilir algoritmaları sinyalleri örtüşen bir sürü varsa DAOSTORM 34, 3B 35 ve deconSTORM 36 içerir. Ayrıca bu algoritmalar, sinyal sayısı, ya da yanıp başına foton, yanı sıra düzeltilmiş Gauss fonksiyonları ile görüntülenmesi veya süper-çözünürlük piksel boyutu olabilir piksel ızgaraları ile histogramlar gibi farklı görüntü ekran seçenekleri gibi çeşitli kriterler için eşik içerir kullanıcı tarafından seçilir. Tüm bu seçenekler son görüntünün görünümünü değiştirmek ve görüntü analizi ve yorumlanması için etkileri vardır.
Bu nedenle, açıklık uğruna biz fırtına gibi sevk edecektir boya temelli lokalizasyon tabanlı süper-çözünürlük deneyleri, ve daha deneyimli kullanıcılar fırsat için bir başlangıç noktası ile yeni kullanıcı sağlayacak 3 test örneklerini sunmak daha da optimize deneyleri. İlk olarak, bu kat için dextran-boya konjugatının bir floresan tabakası ile cam yüzey mümkündür. Bu mikroskop, boya ve tampon floresan sinyal yanıp üretmek için çalıştıklarını söyledi kurmak için hızlı ve kolay bir yol sağlar. Yöntem daha sonra, tampon koşulları optimize görüntü toplama ayarları ve farklı boyalar test etmek için yağmur fırtınası tarafından üretilen ortalama yerelleştirme hassas ve sayı ölçümleri karşılaştırarak uzatılabilir. İkincisi, biz kolayca phalloidin-boya birleşimleri kullanılarak etiketli olabilir camına aktin filamentleri hazırlamak için basit bir protokol mevcut. Bu çözünürlükte 27 ve genellikle tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) ölçümleri almak için idealdir yapıları sağlamakbir filament çözünürlüğü 37 ampirik bir tahmini olarak verilmiştir. Bu lokalizasyon tabanlı süper çözünürlük mikroskopisinde çözünürlük florofor parlaklık, arka plan gürültüsü ve yerelleştirme yoğunluğu 27 bir fonksiyonudur ve bu numune boyunca mutlaka sabit olmadığı için çözünürlük örnekleri arasında ve aynı numune içindeki görüntüleri arasında değişir unutulmamalıdır. Aktin filamentleri gibi mislocalizations gibi potansiyel eserler göstermek ve sürüklenme için kullanılan ve yağmur fırtınası içinde yazılım özellikleri ile tespit edilebilir nasıl vardır. Ayrıca, ölçü ve doğru kayması hem de floresan referans işaretlerinin kullanılmasını tarif eder. Ve üçüncüsü, epidermal büyüme faktörü (EGF)-boya konjugatları ile hücrelerin boyanması tarif edilmektedir. Hücre yüzeyindeki reseptörünün bir kısmı, yaklaşık 50-150 n alt kırılma boyutlu yapılar vesiküller, endositoz yoluyla uğrar, çünkü EGF, süper çözünürlüklü görüntü performansı yararlı bir gösterge sağlarçapı 27,38,39 m.
Not: Bu protokol boyunca, ipuçları ve öneriler belirli adımları izleyerek bulunur. "* 1" notu 1 böylece bu özel adıma alakalı olduğunu ve gösterir.
1.. Cam Floresan Dekstran Kaplama
Not 1: Diğer dekstran-boya konjugatlan kullanılabilir. Istenen kombinasyonları ticari olarak mevcut değilse, Konjuge olmamış dekstran da boyalar konjuge edilebilir.
Not 2: floresan muntazamlığı azaltabilir, ancak aynı dekstran odalar haftalık bir süre boyunca reimaged edilebilir. Herhangi bir tampon maddesi yokluğunda, 4 ° C de depolama önerilir.
2. Camına Floresan Aktin filamentler
Not 3: Poli-L-lisin kaplamalı cam bağlanabilen az filamentler odacık sonuçları içinde filaman çözelti hacmini arttırmak.
Not 4: 4 ° C'de en çok 48 saat inkübasyonu kez iyi sonuçlar ile test edilmiştir. Bir oda daha fazla gün için aynı örneği kullanmak için tavsiye edilmez yani tampon anahtarlama maruz edildikten sonra aktin filament görüntü kalitesi bozulur.
3. Fiducial Markers olarak kürecik Floresan Boncuk
Not 5 - seyreltme ve inkübasyon süresi boncuk farklı yoğunlukları elde etmek için ayarlanabilir. 20.5 mikron başına 10 boncuk x 20.5 mikron alan-view - Bu protokol genellikle 3 ile sonuçlanır.
4. Epidermal Büyüme Faktörü Hücre boyama
DİKKAT - formaldehit son derece zehirlidir. Uygun eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar mont giyilir emin olun. Formaldehit bertarafı için yerel kuralları kontrol edin.
5. Tampon Hazırlama anahtarlama
Not 6 - bu tamponu, Cy5 ve Alexa 647 gibi karbosiyanin bazlı boya ile kullanılmak için uygundur.
Not 7 - nihai enzim konsantrasyonu glikoz oksidaz, 50 ug / ml (5 birim / ml) ve katalaz 1 ug / ml (40-60 birim / ml) 'dir. Enzimatik etkinlik (adet) tedarikçiler tarafından verilir ve değişebilir. Katalaz için hesaplamalar adım 5.4 sonra 1 ug / ml 'lik son konsantrasyonu, enzim, 50 birimleri içeren varsayalım. Benzer oksijen tutucu bileşenleri dahil olmak üzere çeşitli tampon kompozisyonlar 21,30,40 bulunabilir. Tampon ve boya kombinasyonları bir özeti için başvurular 28,29 bakın. Gliserin ve TCEP -20 ° C'de uzun süreli depolama için gerekli olan
Not 8 - görüntüleme aktin filamentler t istikrara kavuşturmak için 2 mM MgCl2 ve 0.2 mM ATP eklersenizo filamentler.
6. (Alexa 647 boya kullanılarak) FIRTINA Veri mikroskop kazanılması
DİKKAT - objektif lens ile ilgili olarak örnek yan ve eksenel kayma en aza indirmek için bu örnek ve tampon dengelenmeye bırakılır önerilirönce görüntüleme için en az 15 dakika süre ile oda sıcaklığı arasında gerçekleştirilir.
Not 9 - 10000 çerçeveleri Burada açıklanan örnekler için uygundurancak diğer örnekler için 50.000 veya daha fazla çerçeve sayısını artırmak için gerekli olabilir.
7. Ham Veri Super-Çözünürlüklü resimler Yeniden (rainstorm kullanarak)
Not 10 - görüntü üzerinde piksel boyutu 160 nm olacak 100X objektif lens ile bir sistemde yani tipik bir EMCCD kamera 16 mikron piksel boyutu vardır. Ticari sistemlerde piksel boyutu genellikle yazılım içinde görüntülenir. Piksel boyutları en yerelleştirme mikroskopları için 100 nm ve 160 nm arasında değişmektedir.
Not 11 - aktin ve EGF veri 10.000 çerçeve dizileri Intel Xeon E5420 CPU ile bir PC kullanarak sırasıyla işlemek için 23 saniye ve 25 saniye sürdü. MATLAB bir paralel işleme alet kutusu olmadan aynı bilgisayarı kullanarak, ya da birden fazla çekirdekli işlemci olmadan bir bilgisayar ile, süreleri sırasıyla 66 saniye ve 81 saniye idi.
Not 12 - Sinyal Sayımlar parlaklık kriterlere göre yanıp reddeder. Değer parlak yüksek göz kırpma son görüntüde bir yerelleştirme olarak kabul haline olmalıdır. Bu durum, boya ve maruz kalma süresi ve kameranın duyarlılık foton çıkış bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilir. Sinyali ve monte Gauss yani d arasında anlamlı bir kare hata varsa Tolerans yanıp reddederouble zirveleri. PSF monte genişliği bu aralığın dışında yatıyor eğer PSF Sigma Range yanıp reddeder, yani dar bir aralık out-of-odak sinyallerini ve sürekli floresan büyük toplu lekeler reddetmek için kullanılabilir. Daha geniş bir yelpazede kullanarak son resimde görünen mislocalization eserler neden olabilir. Uygulamada, yerelleştirme hassas kesme parametre kullanarak ilk kalite kontrolünü gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
Not 13 - çözünürlük ölçümleri hakkında daha fazla bilgi için referanslar 23,27 bkz. Her tarafından üretilen fotonların sayısı her lokalizasyon yerelleştirme hassasiyet hesaplanması ve dolayısıyla genel tüm görüntü için hassas tahminler ortalama türeterek mümkündür yanıp bilerek kısaca. Foton değer başına 200 sayar bir kazanç ayarı ile bir Andor IXON DU-897E kullanılarak 9.04.
Not 14 - yerelleştirme mikroskopi Çözünürlük (basit bir histogram yeniden yapılanma piksel boyutuna yani) görselleştirme yanı sıra yerelleştirme hassasiyet için gerekli yumuşatma bağlıdır. Uygulamada, yeniden piksel boyutu genel olarak lokalizasyonu daha küçük olmalıdırhassas (info text dosyasına ortalama Hassas tahmini ölçüsünü görmek - 6,11 ve 6,12 adımlar). Bu durumda nedeniyle yeniden piksel boyutuna çözünürlük kaybı 23,27 küçük olacaktır. Örneğin satır ve Şekil 4E sütun yönünde ortalama hassas tahminler 16.1 nm ve 16.2 nm. 16 nm'lik bir piksel boyutu (160 nm bir orijinal piksel genişliği 10 ile yeniden ölçek faktörü) bu verileri görselleştirmek için kullanılır olmuştur.
Not 15 - kamera kare sayısı ve sağ alt (Şekil 1F) yılında Thompson Yerelleştirme Precisions histogramında karşı kabul yerleşimlerin sayısını gösteren sağ üst grafik yerelleştirme hassas kesim incelemesi seçeneği bilgilendirmek için kullanılabilir. Örneğin, 50 nm kesme kullanarak nihai süper çözünürlüklü görüntü dahil olmaktan daha kötü hassasiyetle tüm bölgeselleştirmelerini dışlar.
Not 16 - 3 ila 5 dosya (toplamı görüntü, STORMdataImage, STORMprocessed, bilgi ve hists) seçilen seçeneklere bağlı olarak kaydedilebilir, Şekil 1G bkz. FIRTINA işlenmiş görüntü değiştirilmiş kontrastı ve renk haritaları ile gösterilir. STORMdataImage her pikselin gri seviye uyuşmuş eşittir hangi bir gri tonlamalı görüntüBunun içinde tespit edilmiştir yerleşimlerin er.
8. Kutu İzleme ve Drift Düzeltme (rainstorm kullanarak)
Dekstran
Dekstran Başarılı bir kaplama, bir floresan tek tabaka üretmek gerekir. Yüksek konsantrasyonda bu nispeten homojen görünmelidir. Düşük konsantrasyonlarda (Şekil 2A) seyrek görünür. Birçok FIRTINA / PALM mikroskoplar TIRF için epifluoresan gelen aydınlatma açısını değiştirmek için yeteneği var. Tipik bir EMCCD kamera 512 x 512 piksel, örneğin, bir full frame kamera görünümünü kullanırken, bir hatta aydınlatma dikkat edilmelidir. Herhangi çizgili veya out-of-odak bölgeleri varsa bu örnek objektif lens taze yağ ile numune tutucu içine yerleştirilemeyen gerektiğini gösterebilir. Alternatif olarak bu mikroskop ile bir sorun olduğunu gösterebilir.
Süper çözünürlük ham verileri edinirken görüntüleme lazer yaklaşık 2 kW / cm 2 güç olarak artırılmalıdır. Fluorophores tahrik gibi yanıp sönen ardından floresans bir ilk patlama olacakGeçici karanlık devletlere. Yüksek Dekstranın de yanıp söner özellikle görüntü elde başlangıcına yakın, üst üste muhtemeldir yoğunluklarından (Video 1). Orta ve düşük yoğunluklarda bu yanıp yani uzamsal ayrılmış, seyrek olmalı ve belirgin arka plan ile odak (Şekil 2A, Resim 2 ve 3 kare 2.000, 5.000 ve 8.000 bakınız). Bu görüntü alma aşamasında, sabit lazer aydınlatmada, yanıp sayısı (yüksek yoğunluklu numune, Şekil 2A çerçeve 8.000 çerçevesini 2,000 karşılaştırın) zamanla azalacaktır. Farklı dekstran konsantrasyonlarda (yüksek, orta ve düşük) ve çeşitli süper-çözünürlüklü görüntüler arasındaki temel fark yerleşimlerin azalan sayısı (Şekil 2A ve 2B) 'dir. Diğer bir deyişle, floresan moleküllerin konsantrasyonu, ham veri yanıp sayısı ve lokalizasyonu sayısı orantılı bir ilişki vardır. Bu ilişki,Ancak, çok yüksek molekül itibariyle (Şekil 2C kırmızı ve mavi çizgiler karşılaştırmak) yazılım başarıyla molekülleri lokalize etmek mümkün yoğunlaştıran basit doğrusal bir değildir. Bunun nedeni, işlem programı yanıp söner olmayan seyrek Gauss uydurma algoritması kullanılarak uygun pozisyonlar için en yüksek konsantrasyonda mümkün olmasıdır. Yanıp nedeniyle onlar (Şekil 2A ve 2C) seyrek olmak gibi yazılım daha yanıp söner daha uygun olabilir photobleaching edinim aşaması ile azalma gibi. Ayrıca, tek başına boya molekülleri yanıp olabilir ve bu nedenle daha 28,41,42 birden lokalize.
Bu örneklerin herhangi biri, fakat özellikle yüksek yoğunluklu dekstran bir görüntüleme genel bir sorun, hızlı bir STORM görüntü elde etme aşamasında difüzyon gibi görünen parlak ama odaklanmamış floresan bulanıklığın varlığı olabilir. Bu, üzerinde yüksek kontrast florofor farklıdır(Şekil 3A, video 5) yanıp sönen görülebilir camın yüzeyi. Bu müstakil floresan moleküller önce sviçleme tampon eklenmesi için PBS ile yıkama adımların sayısını arttırarak ya da bölmenin (Şekil 3B, Video 6) taze anahtarlama tampon eklenmesi ile önlenebilir veya kaldırılabilir. İşleme ve yerleşimlerin sayısı ve (Şekil 3C, 3D, 3E yanıp lokalize yazılım takılabilir hangi ile hassas hem de bir azalma var çok farklı süper çözünürlüklü görüntüler her görüntü sırası sonuçlarından verileri karşılaştırarak ve 3F).
Aktin filamentler
Önceden oluşturulmuş aktin filamentler kırınım sınırlı görüntüleme (Şekil 4A-4C) ile camın yüzeyine yapışmış görülebilir. Filaman sayısı çok aşağıda ise, o zaman daha uzun bir enkübasyon süresi, kullanılan ya da aktin hacminde bir azalma olabilirfilament çözüm de yardımcı olur. Daha kaliteli görüntüler tek nispeten parlak filamentler (Şekil 4D) ziyade karışık alanlar sonuçları seçilmesi. Satın alma aşamasında, aydınlık-odak yanıp söner filamanın uzunluğu (Video 7) birlikte görülmelidir. Seyrek Yanıp sönen edinim aşamasında görülmeli ve akabinde işlenen verilerle bir ince sürekli filaman (Şekil 4E) orada olmalı ve çerçeve başına lokalizasyonu gerektiği Şekil 3E aksine kademeli bir düşüş (Şekil 4F).
Yanıp Eğer seyrek olmayan, ya da yazılım molekülleri lokalize etmek mümkün değilse, daha incelikli bir eserdir, bir mislocalization 32 olarak adlandırılan, neden olabilir. Yazılım ortalamalar üst üste binen iki moleküllerinin konumu ve yerelleştirme aralarında orta konumda bir yoldur, bu ortaya çıkar. BLI örtüşen önemli sayıda henüz bir göstergesinks ve dolayısıyla mislocalizations, ortalama hassas tahminleri satır ve sütun yönleri, örneğin, yatay ve dikey olarak aynı olması gerektiğidir; mislocalizations olduğu yerde, bu filamanın uzunluğu boyunca meydana gelmiş olur, üretilen normal göz kırpma (daha büyük yani dolayısıyla yönden birine daha az doğruluk ile lokalize olurdu ki,) daha fazla piksel yayılmıştır. Orada görüntüleme alanında, tek filament aktin ve yatay veya dikey olarak yatan burada en kolay görülür. Bu durumda, STORM mikroskop, her iki yönde de 16 nm bir ortalama hassasiyeti elde etti. Bu hassas sınırı, yaklaşık 34 nm etkili görüntü çözünürlüğü ölçüsü sonuçlanır. Biz, görüntünün çözünürlüğü tahmin etmek FWHM bir önlem almak için çok küçük phalloidin-Alexa 647 etiket ile, homojen bir çapa, 7 nm bir ipliksi bir yapıya sahip gibi bu ölçümler, ancak, bir yağmur fırtınası 27 tarafından sağlanır. Dra tarafındankanat arsa profili özelliğini (Şekil 4H) kullanılarak ve ardından FWHM 43.2 nm olarak hesaplanan bir Gauss uyum (Şekil 4I) sahne ImageJ (Şekil 4G) olarak süper çözünürlüklü görüntünün filamanın düz bir çizgi. Bu ölçüm denerken biz piksel boyutu (info.txt dosyası Şekil 1G bakınız) maç veya görüntü için ortalama hassas tahmini biraz daha küçük olmalıdır öneririz. Bu durumda, 16 nm bir görüntü piksel yeniden oluşturmak için kullanıldı.
İki ilgili sorunları yanıp fluorophores, aynı zamanda, yaklaşık 250 nm yanıp içinde olmayan seyrek, örneğin, ayrı moleküller olabilir ve bu nedenle, üst üste sinyalleri STORM, oluşabilir. İlk algoritması ve kullandığı kalite kontrol kriterlere bağlı olarak, yanıp söner her lokalize olabilir olmasıdır. Bu az veya hiç lokalizasyonu ile süper çözünürlük görüntüler sonuçlanır. Ikinci sorunuiki yanıp sönme tek bir göz kırpma gibi görünmesini birbirine yeterince yakın meydana geldiği mislocalizations oluşur. Bu durumda, nihai görüntüdeki konumu bu ikisinin bir ortalamasını temsil eder. Bu konuda daha fazla ayrıntı için başvuru 32 bkz. Her iki durumda da, bu örneklerin çok yüksek yoğunluklu, yetersiz lazer gücü ile veya tampon sorunlar geçiş ile oluşabilir. Aktin filamentler çok sayıda dallanma ve / veya (Şekiller 5A-D, Video 9) birbirlerine geçiş burada, bu sorun belirgindir. Kare kümelerine işleme, ve ilk ve son 5.000 kareyi karşılaştırarak tarafından farklı bir çıkan görüntü görebilirsiniz. Ilk 5.000 kareleri (Şekil 5C) kullanılarak süper çözünürlüklü görüntü biz görüntünün ortasında birçok yerleşimleri son 5000 çerçeveleri kullanırken, ancak bu çok az görülür ve biz kalır, orada olduğunu görebilirsiniz sadece filamentler, imag içinde yerleşimlerin sayısının düşük borçlu biraz kesintili de olsae (Şekil 5D). Bir çok yüksek yanıp sönme yoğunluklu şüphesi varsa çerçeve verileri başına lokalizasyonu ile görüntülerin karşılaştırılması şiddetle bu sorunun oluştuğunu önerebilirsiniz, çerçevelerin ilk kurulum sırasında son seti ile karşılaştırıldığında üzerinden 10 kare başına yerleşimlerin ortalama bir sayı var yaklaşık 4 (Şekil 5E) olan kare. Yansıması için moleküllerinin büyük bir sayıda ise örneğin, yüksek yoğunluklu numune için, bu gereklidir, her ne kadar mümkün olduğu kadar az kare başına lokalizasyonu için idealdir meydana mislocalizations olasılığını en aza indirmek için bu satın alma çok sayıda çerçeveler sürüklenme FIRTINA mikroskopi başka bir soruna yol alınmalıdır.
Drift Yanal - Aktin filamentler ve Fiducial İşaretleyiciler
Drift oluştuğunda, veri toplama aşaması ile objektif lense ilişkin olarak örnek hareket eder. Bu Durin görmek için zor veya imkansızg görüntü elde etme aşaması, tipik haliyle nispeten kararlı bir mikroskop sistemleri için birkaç dakika boyunca en az 50 nm olduğu gibi özel olarak ise, ölçülen sürece daha çok eksenel ya da yanal fazla, özellikle de. Ancak, bu tür iyi tanımlanmış bir yapıya sahip aktin filamentler olarak bilinen yapıların yeniden görüntülerde, bu süper-çözünürlüklü görüntüler olarak tespit edilebilir. Yanal sürüklenme meydana gelmiş olabilir ilk işareti yapı 67 nm ile karşılaştırıldığında, bu durumda, bir yağmur fırtınası arasındaki hassas sınır verileri ile karşılaştırıldığında, nispeten büyük bir FWHM, örneğin (Şekil 6A, Video 8) 90 nm beklenenden daha büyük olmasıdır. Ancak, drift algılamak için daha iyi bir yolu, sonraki kare lokalizasyonu erken kare olanlarla karşılaştırıldığında yerinden ise, yani görme, zamanın bir fonksiyonu olarak bölgeselleştirmelerini karşılaştırarak olduğunu. Bu, açık bir şekilde, çok küçük ve tek biçimli bir yapıya sahiptirler aktin filamentler, durumunda görülebilir zamankutu izleme özelliğini yağmur fırtınası (Şekil 6B ve 6C) kullanarak bir renk kodu ile görüntülenir.
Drift iyi tanınan bir sorundur ve 19 aza indirmek veya alım sonrası ya fiducial işaretleri 21,43 veya çapraz-korelasyonu 44 kullanarak düzeltmek için kullanılabilecek stratejiler vardır. Sürüklenme ve bunun için doğru ölçmek için, 100 nm çaplı floresan boncuk referans işaretleri (Şekil 6D) olarak kullanılabilir. Onlar küçük ve parlak olduğu için kendi konumunu doğru gibi yağmur fırtınası gibi Gauss uydurma algoritmaları kullanarak ölçmek olabilir. 3 dakika 10 sn boyunca yaklaşık 100 nm nispeten ciddi sapma olduğu bir örnekte, bilgi edinme aşaması (Şekil 6E) sırasında, aynı kutu izleme özelliği renk kodu için kullanılan ve (Şekil 6F, bu sürüklenme meydana teyit edilebilir .) Bu örnekte dört boncuk yakın aynı sürüklenme göstermek gibi preferans olarak kullanmak ve diğer boncuklar (Şekil 6G) gelen sürüklenme çıkarmak için, bu durumda boncuk 2 bunlardan birini seçmek için ossible. Bu daha sonra, temel yapısı bilinmeyen ya da çok daha fazla değişken bir aktin tel ya da bir floresan kordonu daha herhangi bir sürüklenme ölçülmesi ve düzeltilmesi mümkün olur ilgi konusu bir biyolojik numuneye referans işaretleri ekleyerek.
Epidermal Büyüme Faktörü
Son olarak, EGF-boyanmış HeLa hücreleri, hücreleri (Şekil 7A, Video 10) görüntü çözünürlüğü gerçekçi bir örnek vermek için kullanılabilir. Bu coverglass yakın hücre yüzeyi üzerinde düzlem-of-odak EGF-floresans çoğunluğu olmalıdır gibi bu hücreler, görüntü için nispeten doğru olan. Daha az parlak bölgesi merkezi çekirdeğin konumuna karşılık gelir. TIRF aydınlatma hücre m bölgelerinden gelen out-of-focus floresan ortadan kaldırarak görüntü kalitesini artırabilirsinizzarı böylesine cam (hücrelerine yaklaşık olarak 150 nm penetrasyon) yakınında. kırınım sınırlı görüntüde ilgi bölgelerinde Zoomed değildir (Şekil 7B ve 7C), tipik olarak silik olan, ancak süper çözünürlüklü görüntüler bir karışımı olmalıdır kümeleri ve zaman zaman izole tek bir piksel (Şekil 7D-7F). Bunlar, hücre yüzeyinde ya da spesifik olmayan bağlanma mümkün küçük bir miktarda izole edilmiş EGF reseptörleri ya da temsil edecektir. Kümeler çapı yaklaşık 100 nm olarak ve şekillendirme çukurlar ve vesiküller, EGF ağırlıklı aşağı regüle ve endocytosed olan yolu ile karşılık gelen muhtemel olacaktır. Tipik ortalama hassas tahminleri, yaklaşık 45 nm'lik bir hassasiyet limiti olan numune için bu tip yaklaşık 20 nm. Etkili çözünürlük bu hassas sınır ölçü referans işaretleri ile ölçülebilir hesap etiket boyutu, ya da herhangi bir sürüklenme, içine almaz belirtti, ama yine notic olduğunu edilmelidirkümeleri veya Şekil 6 özetlenen ve protokol bölümünde 8'de açıklandığı gibi kutu izleme özelliğini kullanarak "kuyrukluyıldız kuyrukları" tarafından Eable.
Bileşen | Final Konsantrasyon |
Katalaz | 1 ug / ml (50 ünite) |
Glikoz | 40 mg / ml |
Glukoz oksidaz | 50 ug / ml |
Gliserin | 12.50% |
KCl | 1.25 mM |
MEA-HCl | 100 mM |
TCEP | 200 uM |
Tris | 1 mM |
Tablo 3. Tamponu Switching
Tipik Toplama Ayarlar | Değer |
Piksel boyutu (nm) | 160 |
Pozlama süresi (msn) | 10 |
Kazanç | 200 |
Çerçeve boyutu (piksel) | 128 x 128 |
Çevrim süresi (fps) | 52.5 |
Şasi numarası | 10.000 |
640 nm lazer güç yoğunluğu (kW / cm 2) | 2 |
Tablo 4.. Edinme ayarları
Şekil 1. Yağmur fırtınası kullanma FIRTINA Görüntü Oluşturma. (A) MATLAB içinde yağmur fırtınası Açılış. (B) yağmur fırtınası grafik kullanıcı arayüzü (GUI). (C) rainstorm Yorumcu GUI. (D) kontrast pencere ayarlayın. (E) inceleme ve kontrast ayarı sonra FIRTINA görüntü. (F) Hisgörüntü kalitesi ölçümleri tograms. Yorumcusu GUI görüntü düğmesi kaydet tuşuna bastıktan sonra oluşturulan (G) Dosyaları. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2.. (A) Kırınım sınırlı (DL) görüntüleri dekstran önce FIRTINA görüntüleme farklı konsantrasyonlarını göstermektedir. Süper çözünürlüğü (SR) görüntü rekonstrüksiyonlar 25 nm'lik bir piksel boyutuna sahiptir. 10.000 resim 128 x 128 piksel kare boyutu ve bireysel kare (2.000, 5.000, 8.000) bu diziden gösterilmiştir ile toplanmıştır. Saniyede 52.5 kare bir 10 milisaniye pozlama süresi ile satın aldı. Görüntü 160 nm'lik bir piksel boyutuna sahiptir. % 0.1 piksel doygunluk kontrast görüntüleme netlik için ImageJ kullanılarak uygulandı. Ortalama hassasiyettahminler 28 nm (yüksek), 24 nm (orta) ve farklı dekstran görüntüler için (düşük) 16 nm. Yerelleştirme yoğunlukları um 2 (yüksek) ortalama 724 olan um 2 (orta) başına 526 ve (düşük) 2 um başına 13. (B) Grafik dekstran her bir konsantrasyonu üç 10000 çerçeve sekanslarının bir ortalamasını gösteren. Hata çubukları standart sapma gösteriyor. Yuvarlanan 100 kare ortalama kullanarak kare başına kabul yerleşimlerin sayısı çizilerek (C) Grafik. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Kötü kalite Dekstran Veri. 15.000 kare STORM diziden (A) Kırınım sınırlı çerçeve. Görüntünün genelinde yaygın floresan pus unutmayın. Bu fluoropho kaynaklanır res vasıtasıyla difüzyon. 128 x 128 piksel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare satın aldı. (B) tampon sonra, (A) ile aynı şekilde değiştirildi. Ilişkisiz flüoroforlar uzak yıkanmış olarak geliştirilmiş kontrast unutmayın. (C) (A) toplanan verilere karşılık gelen bir süper-çözünürlüklü görüntü oluşturma. Özdeş görüntü boyutu ama 25 nm piksel. Ortalama hassas tahmini 35 nm. (D) (B) toplanan verilere karşılık gelen bir süper-çözünürlüklü görüntü oluşturma. Özdeş görüntü boyutu ama 25 nm piksel. Ortalama hassas tahmini 30 nm. (E) Grafik yuvarlanan 100 kare ortalama kullanarak, kare başına kabul yerleşimlerin sayısını komplo. Kırmızı çizgi yüksek bir arka plan bulunmaktadır STORM dizisi (A ve C) karşılık gelir. Mavi çizgi plan düşüktür (Yatak & D), karşılık gelen verileri gösterir. Yüksek karşılık görüntüler için kabul yerelleştirme sayısını gösteren (F) Grafik (C) ve düşük (D) arka plan veri.href = "https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4. Tipik Aktin Veri. Önce tampon ve FIRTINA görüntüleme anahtarlama eklenmesinden aktin filamentler (AC) Kırınım sınırlı görüntüler. Filaman Değişken uzunlukları görülebilir. Çok parlak filamentler sık birlikte karışık çeşitli iplikçiklerdir. Piksel boyutu 160 nm. (D), tek bir aktin filamanın bir kırınım sınırlı görüntüsü. (E) STORM görüntü (ImageJ uygulanan% 0.1 kontrast). 128 x 128 pixel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen ile 10.000 kare dizisinden. Piksel boyutu 16 nm. Ortalama hassas tahmini 16 nm. (F) Grafik kabul lokalizasyonu sayısı çizilerekyuvarlanan 100 kare ortalama kullanarak kare başına s. Boyunca çizilen bir sarı çizgi profili ile kontrast geliştirme önce (E) aktin filamanın bölgesinde yakınlaştırılmış (G) A. (H) aktin ipliği boyunca çizilen sarı çizgiden bir arsa profil görünümü. ImageJ oluşturuldu. (I) ImageJ eğri uydurma aracı kullanılarak arsa profilinin bir Gauss uyum sağlar. Standart sapma, d, 43.2 nm FWHM ölçüm almak için 2,35 ile çarpılarak. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 5,. Mislocalized Aktin Filaments. (A) Kırınım-sınırlı aktin filament. 160 nm piksel. (A) 'da gösterilen aktin filamanın (B) STORM image. 128 x 128 piksel Fram ile 20.000 kare dizisindene boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare satın aldı. FIRTINA piksel boyutu 16 nm. Tüm 20000 çerçeveler işlenmiştir. Ortalama hassas tahmini 17 nm. (B) olarak, ancak işlenmiş olan 20.000 çerçeve dizisinin sadece ilk 5000 çerçeveli (C). Ortalama hassasiyet tahmini 18 nm'dir. (D) (B) olarak, ancak işlenmiş olan 20.000 çerçeve dizinin sadece son 5.000 kare. Ortalama hassas tahmini 17 nm. Tam 128 x 128 piksel kare görünümünde çerçeve verileri başına yerleşimlerin (E) Grafik.
Şekil 6,. Drift yanal., 64 x 64 piksel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 64.6 kare ile alındığını 10.000 çerçeve dizisinden yeniden bir aktin filamanın (A) STORM görüntü. FIRTINA piksel boyutu 32 nm. Ortalama hassas tahmini32 nm. (B) A STORM görüntü 'Kutu İzleme' özelliğini yağmur fırtınası kullanılarak görüntülenir. Lokalizasyonlarına edinildiğini ne zaman kare sayısına karşılık gelen bir renkle gösterilir, örneğin, erken satın alma sırası gelen lokalizasyonu mavi, geç elde etme sırası gelen lokalizasyonu kırmızı. Yerinden renkler sürüklenme meydana geldiğini göstermektedir. (C) (A) bölgesinde yakınlaştırılmış Box Takip özelliğini yağmur fırtınası kullanılarak görüntülenir. Yerinden renkler sürüklenme oluştu gösterir. (D) referans işaretleri olarak kullanılabilir, dört 100 nm flüoresan boncuklar bir kırılma kısıtlı görüntü. Piksel boyutu 160 nm. Sayılar 1-4 gösteri kırpılmış ve ayrı ayrı boncuk yakınlaştırılmış. (E) 128 x 128 pixel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen ile 10.000 kare dizisinin gelen yağmur fırtınası yeniden (D) karşılık her floresan boncuk. FIRTINA piksel büyüklüğü 5 nm. Ortalama hassas tahmini 7 nm. (F) (D) 'ye karşılık gelen boncuk ve (E),'Kutu İzleme' özelliğini kullanarak görüntülenir. Yerinden renkler sürüklenme oluştu gösterir. (G) sayısı 2 kordon kullanarak referans olarak, boncuklar 1, 3 ve 4 'Çıkart Drift' özelliği sonra gösterildi yağmur fırtınası kullanılır. (E) ile karşılaştırması yanal sürüklenme düzeltilmiş olduğunu göstermektedir. FIRTINA piksel büyüklüğü 5 nm. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 7. Tipik EGF veriler. Bazal hücre yüzeyinde odaklı bir HeLa hücresinin bir kısmının (A) sınırlıdır kırınım görüntüsü. Sarı kutular (B) 'de gösterilen ilgi bölgelerde yakınlaştırılmış göstermektedir & (C). (B), hücre (kutu B) kenarına yakın bölgedeki kırılma kısıtlı görüntü Zoomed. (C) sınırlı kırınımında Zoomed Çekirdeğin (kutu ° C) altında bölgesinden görüntüsü. (D) 'e uygun STORM görüntüsü (A). 128 x 128 pixel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen ile 10.000 kare dizisinden. FIRTINA piksel boyutu 25 nm. Ortalama hassas tahmini 21 nm. (E) E (D) kutusuna karşılık FIRTINA görüntü. (F) F (D) kutusuna karşılık FIRTINA görüntü. (D) frame veri başına (G) Yerleşimleri. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
. Videolar 1-4 Videolar değişen dekstran konsantrasyonları ile 2A Şekil karşılık: 1 = yüksek, 2 = orta, 3 = düşük, 4 = hiçbiri). Saniyede 52.5 kare bir 10 milisaniye pozlama süresi ile edinilen 128 x 128 piksel kare boyutları ile 10.000 çerçeve dizileri. videoyu 1 görmek için buraya tıklayın ,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> Video 2 Video 3 , Video 4
Videolar 5-6. Videoları 3 A & B video 5 Şekil karşılık ilişkisiz flüoroforlar çıkarıldıktan sonra ön yıkama ve video 6 yıkama sonrası olmasıdır. 128 x 128 piksel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen kullanarak 15.000 kare dizileri. Videoyu 5. görmek için buraya tıklayın , videoyu 6 .
Video 7. Video Şekil 4E STORM görüntü oluşturmak için işlendi ham kare dizisini gösteren. 10.000 kare seque128 x 128 pixel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen ile nce. Videoyu 7. görmek için buraya tıklayın .
Video 8. Video Şekil 5B STORM görüntü oluşturmak için işlendi ham kare dizisini gösteren. 128 x 128 pixel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen ile 20.000 kare dizisi. Videoyu 8. görmek için buraya tıklayın .
Video 9. Video Şekil 6A'da STORM görüntü oluşturmak için işlendi ham kayıt birimi dizisini gösteren. 64 x 64 piksel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 64.6 kare alınır. 10.000 kare dizisi CLIBurada ck videoyu 9 görüntülemek için.
Video 10. Şekil 7D STORM görüntü oluşturmak için işlendi ham kare dizisini gösteren video. 128 x 128 pixel çerçeve boyutu, 10 msn maruz kalma süresi ve saniyede 52.5 kare edinilen ile 10.000 kare dizisi. Videoyu 10. görüntülemek için buraya tıklayın .
Biz bazı basit test örnekleri ve STORM süper çözünürlük görüntüleme optimize etmek mümkündür özgürce kullanılabilir işleme yazılımı yağmur fırtınası ile göstermektedir. Bu araçlar ve yöntemler yeni kullanıcılar ve mikroskoplar güven ve görülmemiş detaylar biyolojik ve hücresel yapıları incelemek için bunların kullanımını artırmak için deneyimli kullanıcılar için yollar için yararlı başlangıç noktaları sağlayacaktır. Bu görüntü kalitesini iyileştirmek ve daha fazla güven olması mümkündür gösteren bu tür ortalama hassas tahminler, yerelleştirme numarası ve histogramlar olarak yararlı bir görüntü kalitesi ölçümleri bir dizi üretebilir, bilinen ya da iyi anlaşılmış yapıları ve algoritma ile numunelerin bir arada kullanarak STORM görüntüleme işleminde. Kimse-boyut kullanılabilir farklı ticari ve kendini inşa mikroskop yapılandırmaları bir dizi olduğu gibi verileri elde etmek, tüm yaklaşım uyar vardır. Üstelik şekilde etkilenir birçok örnek hazırlama ve görüntü alma adımlar vardırson görüntü bu nedenle yazılım araçları ve test örneklerine sahip anlayış ve FIRTINA görüntü kalitesini optimize etmek önemlidir yaşamaktadırlar.
Ayrıca bu protokoller ortaya çıkabilecek sorunları giderme kullanışlı ve daha az belirsiz yollar sağlayabilir. Örneğin dekstran örnek, herhangi bir lazer ışını kayma veya numunenin dengesiz aydınlatma var olup olmadığını belirlemek için çok kullanışlı bir yoldur. Anahtarlama tampon herhangi bir 'yanıp sönen' yardımcı olacak olup olmadığını görmek için çok basit bir görsel testi çalışmıyor olabilir ki endişeler varsa. Aktin filamentleri FWHM karşılaştırmalar kullanarak yanı sıra sürüklenme ve mislocalization eserler vurgulayarak çözünürlük ölçmek yararlı bir yoludur. Ancak, lokalizasyon tabanlı süper-çözünürlük yöntemleri gibi pozlama süreleri, çerçeve oranları, lazer güçler ve görüntü işlenir yolu olarak katkıda bulunan diğer faktörler, rağmen, duyarlı fluoroforun yoğunluk olabileceği unutulmamalıdır, bu atamak mümkün değildir Bir bir çözünürlükÖzellikle mikroskop ve tüm görüntüleri bu çözünürlüğe sahip olacağını varsayabiliriz. Ne mümkün, ancak bu tür ortalama yerelleştirme kesinleşmemiş, yerelleştirme numarası gibi çözünürlük çeşitli yönlerini ölçmek ve 27 sürüklenmeye olduğunu. Fiducial belirteçler onlar her deneyde dahil olamaz bile, en azından, bir mikroskop sistemi, çevresini karakterize ve daha iyi gibi çok zaman sonra başlatmak termal dengeye ulaşması için gerekli ne gibi operasyonel konuları anlamak için kullanılabilir. Bu görüntüler 43 satın ediliyor iken örnek konumunu düzeltmek için bir astigmat lens kullanımı ve bir geri besleme mekanizması gerektirir rağmen yanı sıra yanal sürüklenme için düzeltme olarak, referans işaretleri, karakterize etmek için kullanılan ve eksenel sürüklenme için doğru olabilir. Ticari süper çözünürlük sistemleri genellikle stabilite kontrolü veya odak kayması düzeltmek için daha pratik bir çözüm olabilir odak-kilit mekanizması, çeşit içerecektir.
Orada birspesifik olmayan bu tür boyalar, doğrudan ya da sekonder antikor olarak başka bir konjugat moleküllerin kullanılarak dekstran, ile cam kaplama alternatif re. Bu yaklaşımların bir sınırlama cama bağlı moleküllerinin sayısı bilinmemektedir olmasıdır. Kullanılmıştır alternatif lifli yapıları mikrotübülleri 28 ve DNA 21 içerir. Ancak, çok küçük boyutlu ve kolay bir ticari olarak temin edilebilen reaktifler kombinasyonu farklılaştı ya da kollara ayrılmış filamentlerin ayırma mesafesi de 27 sistem performansı yararlı bir ölçüm olabilir özellikle, çekici bir alternatif aktin olun.
Test örneklerinin daha da geliştirilmesi için oda bu alanda 28,29,46,47 son ilerlemelere rağmen, var. Özellikle, çok renkli görüntüleme bir görüntüleme 3 ana açıdan zorluklar sayıda örnek etiketleme, görüntü alma (donanım) ve yazılım (görüntü işleme ve hizalama) sunuyor. Bir olmuşturyayınlarda bu yönlerini 4-6 adresleme ve uygun test örnekleri ve metodolojileri görüntülerin bu tür üreten ve güvenilir bir yorumlama için kritik olan bu nedenle açıktır bir dizi. Nitekim, son zamanlarda dSTORM iki renkli görüntüler almak ve çözümlemek, nükleer gözenek kompleksinin son derece simetrik doğa için kullanılan olabilir ve yazarlar bu renk sapmaları düzeltmeler 45 performansını değerlendirmek için ideal bir yol olacağını önerdi gösterilmiştir. Bir başka ilginç yaklaşım dışında 46 özel alt-kırılma mesafelerde konumlandırma Flüoroforlann olasılığını yaratan bir nanoruler oluşturmak için DNA origami kullanılmasıdır. Bu çözünürlük değerlendirilmesi ve mesafe ölçümleri yapmak bir yol sağlar. Ancak, nihai amacı karmaşık üç boyutlu yapılardır gibi hücreleri gibi olmayan idealize örneklerinin, bu süper-çözünürlük tekniklerini uygulamaktır. Bu durumda, bir t daha kapsamlı bir anlayış bir aradaO, veri edinme uygun şekillerde işlenmesi ve görüntü ölçümleri sağlayan kullanıcı yardım yazılım araçları ile kombine teknik nihai cevabı olması muhtemeldir. 28,29,47,48
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Biz İngiltere'nin Ulusal Ölçme Dairesi Kimyasal ve Biyolojik Metroloji programından fon kabul. Biz teknik tavsiye ve önerileriniz için Sebastian van de Linde, Miklos Erdélyi ve Eric Rees teşekkür ederim. Biz yararlı yorumlarından ve bu yazının üzerine tartışmalar için Miklos Erdélyi, Eric Rees ve Max Ryadnov teşekkür ederim.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
*Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
Table 1. Materials & Equipment | |||
[header] | |||
PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
EGF - Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
Formaldehyde - 10 % solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
Table 2. Reagents |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır