Farelerde Akut Böbrek Hasarı ve Post Yaralanma Fibrozis iskemi-reperfüzyon Model

Biz fareler tabi olan orta ve ağır iskemi-reperfüzyon bağlı böbrek hasarı modelleri tanımlamak tek taraflı renal pedikül sırasıyla, eş zamanlı veya gecikmeli taraf nefrektomi takip sıkma. Bu modeller sürekli böbrek fonksiyon bozukluğu ve post-yaralanma fibrozis yol, ancak yaralanma şiddeti ve yaşam fare arka plan, yaş ve cerrahi ekipman bağlıdır.

Iskemi-reperfüzyon oluşturulan akut böbrek hasarı (IR-AKI) yaygın olarak farelerde AKI bir model olarak kullanılan, ancak sonuçlar genellikle analiz yanıltabilecek yüksek, sık sık rapor edilmemiş ölüm oranları ile oldukça değişkendir edilir. Bilateral renal pedikül sıkma yaygın IR-AKI ikna etmek için kullanılır, ama etkili kelepçe basınçları ve / veya böbrek arasında iskemi böbrek yanıtları arasındaki farklılıkları daha sık değişken sonuçlara yol olduğunu. Buna ek olarak, daha kısa kelepçe kat daha fazla değişken boru hasara yol bilinmektedir, ve daha uzun kelepçe kez ikili yaralanma geçiren fareler daha tutarlı boru hasarına yol ise, genellikle şiddetli böbrek yetmezliği nedeniyle yaralanma sonrası ilk 3 gün içinde ölür. Sonrası yaralanma hayatta kalma geliştirmek ve daha tutarlı ve öngörülebilir sonuçlar elde etmek için, biz taraf nefrektomi ardından tek taraflı iskemi-reperfüzyon hasarının iki model geliştirdik. Her iki ameliyat f sonuçlanan cerrahi stresi azaltarak, bir dorsal yaklaşım kullanılarak yapılmaktadıryaygın olarak fare IR-AKI ameliyatlar için kullanılan rom ventral laparotomi,. Orta derecede yaralanmaya BALB / c farelerde indüksiyonu için tek taraflı 26 dakika boyunca renal pedikül sıkma geçmesi ve aynı zamanda eş zamanlı kontralateral nefrektomi. Bu yaklaşımı kullanarak, farelerin% 50-60 yaralanma sonrası orta AKI 24 saat geliştirmek ama farelerin% 90-100 hayatta. Daha şiddetli AKI ikna etmek için, BALB / c farelerde 8 gün yaralanma sonrası kontralateral nefrektomi ardından 30 dakika için terminal böbrek pedikül tabi. Bu 90-100% hayatta kalma ile yaralanma sonrası böbrek iyileşme fonksiyonel değerlendirme sağlar. Erken sonrası yaralanma tübüler hasar yanı sıra sonrası yaralanma fibrozis bu modeli kullanarak son derece tutarlıdır.

Akut böbrek hasarı (ABH) deneysel modellerinde çeşitli insan durumu (yeni, kapsamlı bir yorum ¹ için referans bakınız) çeşitliliği ve karmaşıklığı maç için geliştirilmiştir. Bu modellerin her biri kendi güçlü ve zayıf yönleri vardır, ve her çeşitli verimliliği ile ilgili insan koşulları taklit ederken, hiçbiri tam olarak insan meslektaşları patofizyolojisi modeli. Iskemi reperfüzyon (IR)-kaynaklı AKI kemirgenlerde akut iskemi kaynaklı böbrek hasarının bir model olarak geliştirilmiştir. Bu modelde görülen renal tübüler hasar şiddeti nadiren sınırlamalara rağmen, renal hipoperfüzyon yaralanmaları olan hastalarda ² görülmektedir ve büyük ölçüde çünkü bu model nispeten tekrarlanabilir doğa, geniş kullanım sağlamıştır ve bu beklenirken, devam edecek ortak temel AKI mekanizmaları, onarım, ve tedavi ³ birçok içine önemli bilgiler sağlamak için. IR cerrahi fam gerektirir, Şekil 1 'de, basitleştirilmiş bir formda gösterilen adres fare böbrek anatomisi ile iliarity. Böbrek iskemi-reperfüzyon (IR) hasarı cerrahi ventral (laparatomi) veya dorsal (retroperitoneal) yaklaşımları ile yapılabilir. Daha az travmatik olduğundan daha hızlı iyileşme süreleri ve sağkalım (ilk işlem öğrenme özellikle) sağlayan, bir dorsal yaklaşım kullanın. Böbrek IR yaralanma tek taraflı veya iki taraflı yapılabilir. Bununla birlikte, etkili bir kelepçe basınçları (kelepçe çene arasına perihiler yağ araya girmesi sonucu olabilir) ve / veya yanlar arasında renal iskemi yanıtları arasında önemli farklılıklar daha değişken sonuçlara yol açar. Bu aşılamaz bir sorun olmasa da, bu model için önemli bir konu olan, deneyler arasında değişkenlik artırabilir. Tek taraflı IR kontra-yan nefrektomi ile yapılabilir. Bu da pediküller arasında sıkma değişkenlik azalttığı ve aynı zamanda seçim bizim yöntemdirllows tek başına tek taraflı IR ile etkilenmez böbrek fonksiyon, değerlendirmek. Farelerde böbrek fonksiyonu değerlendirmek için en pratik vs uygun yöntem ne olduğu hakkında tartışmalar vardır. Kan üre azotu (BUN) böbrek fonksiyon bir ölçü sağlar ve IR yaralanma da dahil olmak üzere AKI bazı modellerde, yararlı bir "ilk bakış" belirtecidir. Gecikmiş kurtarma gün sonrası cerrahi bir dizi için sıvı içirin azaltır Ancak, BUN seviyeleri, özellikle ventral yaklaşım IR yaralanma sonrası, etkilenebilir farelerin birim durumu etkilenebilir. Serum kreatinin az hidrasyon durumu etkilenir ama açıkça kas kütlesi etkilenir. Serum kreatinin ölçümleri ile ilgili zorluklardan biri pikrik asit bazlı teknikler kullanılarak fare serumu olmayan kromojenler kreatinin tespiti ile ilgili sorunlar olmuştur. Alternatif olarak, merkezleri bir dizi bu eser ⁴ etkilenmez fare kreatinin ölçmek için bir HPLC-tabanlı bir yöntem geliştirdik. Bununla birlikte, UNLike BUN ve sadece serum 5-10 ul gerektirir pikrik asit, kreatinin deneyleri, HPLC tahlilleri ~ 25 ul analiz başına, serum, iki kopya halinde gerçekleştirilir halinde analiz başına tam kan ~ 100 ul gerektirir. gerektirir Bu fare çalışmalar için sınırlayıcı olabilir. Bazı merkezlerde küçük örnek hacmi ^{5, 6} analizi izin daha duyarlı HPLC ve kütle spektrometresi tabanlı yöntemler geliştirdik. Ancak, bu teknolojilerin yaygın olarak mevcut değildir. Bir alternatif, enzimatik kaskad tahlili (serum sadece 5-10 ul gerektirir), fare ve sıçan serum numuneleri ile değerlendirilir ve yakından serum kreatinin pikrik asit testleri her zaman aşırı tahmin kreatinin değeri ise ⁷ HPLC ölçümleri paralel olduğu gösterilmiştir. Bu tahlilde yaygın AKI literatürde kullanılan olmasa da, tahlil, kullanımı basit, ticari olarak mevcuttur, ve farelerde IR indüklenen AKI Bu modelle güvenilir sonuçlar veren.

1. Ameliyat öncesi tüm cerrahi aletler otoklav. Bir farklı fareler üzerinde birden fazla cerrahisine ise, sıcak bir boncuk sterilizatör kullanılarak sterilize sonra kullanımdan sonra durulama ve unutmayın. Bu% 70 etanol emmek için yeterli değildir.
2. Ameliyat öncesi 0.5 ml S / C steril serum fizyolojik verin ve hemen ameliyat sonrası ameliyat sırasında vücudun sıvı kaybını telafi etmek için.
3. Farenin tartılır.
4. IP Xylazine / Ketamin karışımı kullanılarak fare anestezisi. Genellikle cerrahi uçak anestezi ulaşmak için fareler için 3-5 dakika sürer.
5. Kesi karışmasını saç tutmak için yeterli sınır bölgesi ile cerrahi alan tıraş. Bu ameliyat olduğu, bir hazırlık alanda değil yapılması gerekmektedir.
6. İşlem sırasında kurumasını önlemek için gözlere oftalmik yağlama merhem uygulayın.
7. Emici tezgah ped ile kaplı ısıtılmış yüzey üzerinde eğilimli fare yerleştirin. Cerrahi yüzeye Bant ayaklar.
8. Kullanıyorsanızsu banyosu sistemi, cerrahi öncesi 38 ° C 1 saat olarak belirlenmiştir ısı.
9. Aseptik hazırlık Betadine çözüm çubuk çubuk kullanarak: Betadine kaldırmak için Nolvasan ile ovma ardından her zaman, 3x çevreye doğru sitenin merkezine fırçalayın. Tüm Betadine Nolvasan ile durulayarak kesi önce cerrahi alanından çıkarılmalıdır. Aseptik işlem eldiven başlamadan önce steril olarak değiştirilmelidir.
10. Steril cerrahi örtü ile cerrahi alan kapsamaktadır. Bu cerrahi alanında girmesini sokak saç önlemek ve ameliyat sırasında steril aletleri koymak için bir alan sağlayacaktır.
11. Deri yoluyla böbrek yeri palpe ediniz.
12. Makas ve forseps kullanarak fare (yaklaşık 1.5 cm) orta hat boyunca dorsal cilt kesin.
13. Makas ve forseps kullanarak künt diseksiyon ile bu kesiden sol ve sağ dorsal tarafın üzerinden ayrı cilt ve cilt altı katmanları.
14. Sağ fl ile küçük bir kesi yapmakkas ve böbrek üzerinde fasya ank ve sağ böbrek exteriorize.
15. Dikkatlice çevre dokulara ücretsiz böbrek üst ve alt kutuplar incelemek. Üst kutup yerinden yağ dokusu böbrek kapalı itilebilir ama belli ki fare (Şekil 1) çıkarılmamalıdır kendi kan akımı taşıyan böbreküstü bezi içerdiğini unutmayın. Çevre dokudan özgürleştirici böbrek sonra, bir çift cerrahi düğüm kullanarak sağ böbrek hilusu etrafında 4-0 ipek sütür kravat. Siteye kesilecek görselleştirmek böylece düğüm distalinde kesim olarak böbrek tutmak için uzun dikiş ~ 2 bir ucunu bırakın. Steril serum fizyolojik ile güdük yıkayınız.
16. Emilebilir sütür kullanarak kas tabakası kapatın.
17. Sol kanattan kas ve böbrek üzerinde fasya üzerinden küçük bir kesi yapmak ve sol böbrek (Şekil 2A) exteriorize.
18. Dikkatle böbrek bırakırken künt forseps kullanarak böbrek tutunforseps (Şekil 2B-2F) kullanarak yağ dokusu çevreleyen pedikül. Çalışmaları için "sahte" kontrolleri tasarlarken bir ihtiyacı bu hatırlamak çok künt forseps kullanarak böbrek üzerinde çok fazla baskı renal hasar neden olabilir. Eğer sahte kontrol renal hasar (serum kreatinin bir artış kanıtladığı) gelişmekte fark ederseniz, alternatif bir yöntem renal pedikül çevreleyen yağ dokusu serbest bırakmak için düşünebilirsiniz hafifçe tuzlu ıslatılmış steril ile dokulara rulo için pamuk- uçlu çubuklar. Deneyimlerimiz yağ oldukça sıkı renal pedikül bağlı ve kolayca pamuklu ile kaldırılamaz, bu nedenle bu kullanmak isteyeyim ilk yaklaşım olmayabilir. Ancak, bu modelin diğer yönleri gibi, bu uygulama ve deneyim ile kendiniz için kurmak zorunda olacak bir şeydir.
19. Tutma forseps (kelepçe yerleştirme kolaylaştırmak için) kullanarak olmayan travmatik damar kelepçe sol renal pedikül Kelepçe, farklı CLA için zamanlayıcı kullanınmp kez fare zorlanma ve (bkz. Tablo 1) gerekli yaralanma şiddetine bağlı olarak.
20. Cilt (Şekil 2H) ile sol böbrek Kapak.
21. Tuzlu batırılmış gazlı bez ile cilt kesisi Kapak.
22. Böbrek exteriorize, düzgün esmer görünüm onaylamak ve belirtilen zaman sonra kelepçe serbest bırakın ve bu esmer görünüm (Şekil 2I / G) böbrek boyunca düzgün tersine onaylayın. Böbrek hızlı ve düzgün yeniden serpmek (pembe kadar) fare daha fazla analiz dışında tutulmalıdır yoksa. Yavaşça retroperitoneal uzaya geri böbrek itin.
23. Emilebilir sütür kullanarak kas tabakası kapatın.
24. Monofilament naylon emilmeyen sütür kullanarak cilt katmanı kapatın.
25. Buprenorfin analjezi yönetmek.
26. Onlar uyanmak kadar bir ısıtma yastığı üzerine uzakta cerrahi alanında fareler aktarın.
27. Hayvan odasına fareler dönün.
28. Yakından fareler izlemek ve ek doz vermekBuprenorfinin olarak ağrı veya rahatsızlık her 8-12 saat yukarıda belirtilen. Analjezik yönetiminde çıkan klinik belirtiler depresyon veya diğer davranış değişiklikleri, anormal görünüm veya duruş gibi pilo-ereksiyon olarak, kambur duruş, bakım ve beslenme eksikliği, ya da hareketsizlik içerir.

Aynı anda karşı taraf nefrektomi ile Orta IR bağlı AKI. Tek taraflı IR ölçüde sonuçlarında değişkenlik azaltır, ancak bu işlem hayatta kalmak için fareler için gerekli kısa kelepçe kez, biz hala farelerin sadece% 50-60 beklenen böbrek yetmezliği 24 saat geliştirdiği bulundu sonrası travma (Şekil 3A). Çalışmaların zaman böbrek fonksiyonu değerlendirmek ve böbrek yetmezliği gelişmez fareler atmak için izin, yaralanma sonrası en az 24 saat başlatılabilir tedavi rejimleri içermediği sürece Pratik açıdan bu verileri değerlendirerek zorluklar yaratır.

Şiddetli IR bağlı AKI. Aynı anda karşı taraf nefrektomi ile tek taraflı IR performans ek olarak, yalnız tek taraflı IR gerçekleştirin. Fare iskemi çok daha uzun süre hayatta kalmak ve daha şiddetli sonrası yaralanma fibrozis geliştirmek eğilimi olabilir. Iskemi aynı dönemine, fareler tek taraflı iskemi deve tabinefrektomi ⁸ ile ikili iskemi veya tek taraflı iskemi daha sarkık daha şiddetli fibrozis, bu yüzden bu modeli aynı zamanda post-AKI fibrozis bir model olarak kullanılır. Dezavantajı böbrek dokuları ve daha uzun vadeli çalışmalar için mümkün olmayabilir olmadan yaralanma şiddeti değerlendirmek yolu yoktur bu yüzden tek taraflı IR hasarı sonrası fonksiyonel iyileşme değerlendirmek mümkün değildir olmasıdır. Bu nedenle biz ciddi tek taraflı IR yaralanma neden olan ve 8 gün orijinal yaralanma sonrası kontralateral nefrektomi yapılarak böbrek fonksiyonel iyileşme değerlendirmek için bir protokol geliştirdik. Yaralanma hayatta bu yaklaşımın farelerin% 90-100 kullanarak, ama önemlisi fareler çok tutarlı renal hasar geliştirmek ve Day AKI 9 itibaren (Şekil 3B) sonrasında fonksiyonel iyileşme için değerlendirilebilir. Bu bulgular, renal pedikül kelepçe kez kısa kelepçe ti daha fazla kurucu renal tübüler hasara yol gösteren sıçanlarda çalışmalar ile uyumludur mes AKI ⁹ hafif ve orta ikna etmek için tasarlanmıştır. Buna ek olarak, önceki çalışmalarda ⁸ ile tutarlı ^olması, bu farelerin sürekli yazılan yaralanma böbrek fibrozis (biz Günü 28 değerlendirilir olan) geliştirmek. Bu en az bir BALB / c arka plan üzerinde proteinüri ile ilişkili değildir: Gün 28 sonrası yaralanma idrar albümin / kreatinin oranında IR-AKI ciddi sonra 0.8 olduğunu ± 0.04 (mg / mg ortalama ± SEM). Bu ciddi IR-AKI modeli diğer arka üzerinde proteinüri yol açar bilinmemektedir.

Şekil 1. Üreter ile ilgili olarak renal vasküler kılıf, perinefrik yağ yastıkları ve böbreküstü bezi kan akımı ile de fare böbrek hilusu. Açıklamak üzere pozisyon anatomisi. Siyah daire mikro-kelepçe konumunu işaretler.

50495/50495fig2.jpg "/>
Şekil 2. Pozlama ve fare böbrek vasküler kılıf sıkma deri ve kas tabakasının diseksiyonu sonra sol böbrek (A), pozlama;. (B - E), sol böbrek perinefrik yağ dikkatlice forseps kullanılarak kaldırılır ise künt forseps kullanarak hafifçe tutulur. (F), renal pedikül (yeşil ok) sol Exposed. Beyaz kesikli çizgi perihiler yağ yastığı içinde üreter beklenen konumunu işaretler. Bu bölge, vasküler kelepçe. (G), sol böbrek. (H) yapılan mikro kelepçe ile kaçınılması gereken sol böbrek, deri ile kaplanmıştır. (I), (G), böbrek ortaya çıkmasından önce Sabitlenmiş (A), içinde (I) ve (G) vasküler kelepçe çıkarıldıktan sonra ve daha sonra.

fig3.jpg "/>
Şekil 3,. AKI sonrası fonksiyonel iyileşme. Orta IR hasarı (26 min klemp süresi) ve karşı nefrektomi sonrası serum kreatinin değişiklikler (enzimatik analizleri ile) (A), ağır hasarı oluşturulduktan sonra serum kreatinin değişiklikleri (30 dakika klemp süresi) ve de taraf nefrektomi Gün 8 (B). BALB / c farelerde yapılan çalışmalar, grup başına n = 6. Enzimatik deneyi ile ölçülen mg / dl + /-SEM serum kreatinin, ortalama olarak Sonuçları dile getirdi.

Tablo 1. Biz değerlendirdik, vasküler kelepçeler, iskemi kez, ve fare suşları önerilir.

Biz orta ve şiddetli renal hasar etkilerini incelemek için IR-AKI iki model açıklar. Bu modeller bize düşük mortalite ile tutarlı ve öngörülebilir hasara yol sağlar. Bizim protokol geleneksel olarak bu model ile ilgili zorluklar ve tuzaklar birçok özetliyor. Ayrıca, renal pedikül sıkma uzunluğuna bağlı olarak, model eksik kurtarma ve kalıcı böbrek fibrozis ile büyük ölçüde geri dönüşümlü hafif ve orta derecede AKI, ya da daha şiddetli AKI neden olduğunu göstermiştir. Ciddi IR-AKI modeli sonrası yaralanma fibrozis fareler bu uzun iskemik kez bilateral uygulanabileceğini olsaydı mümkün olacağını daha şiddetli renal hasar ile hayatta kalmak mümkün olduğu gerçeğinden neden olabilir. Ancak, ilk birkaç gün için bir zarar görmemiş kontralateral böbrek varlığı IR sonrası AKI fibrozis ⁸ geliştirir sonra bu çalışmalar da bulunmaktadır. Bu nedenle, süre yaralanmamış ve yaralı böbrekler arasında çapraz konuşma mekanizmaları KURULU olmaya devammamış, bu mekanizma da bu modelde gözlemlediğimiz gelişmiş sonrası yaralanma fibrozis sorumlu olabilir. Bu modelleri kullanarak bulgular insan hastalığı için tedavi tercüme edilebilir olmadığı belirlenmeye devam ederken, onlar IR-AKI mekanizmaları ve tedavi çalışma ve sonrası AKI böbrek fibrozis, bir olarak ortaya çıkmaktadır bir klinik sorunu önlemek için güvenilir modelleri sağlamak ilerleyici kronik böbrek hastalığı ^{10, 11} büyük katkı.

Fare suşu ^12, cinsiyet ^13, yaş ¹⁴ ve fare ağırlığı, kullanılan vasküler kelepçe ve ısıtma sistemleri ^15: dikkatle katıldı gereken IR yaralanma sonrası AKI şiddetini etkileyebilir kritik konularda bir dizi vardır. Doğru vasküler kelepçeler seçimi zor olabilir. Böbrek kelepçe yerleştirme 5-10 dakika içinde düzgün siyah olması gerektiğini gibi kelepçe etkinliği cerrahi işlem sırasında değerlendirilir. Ancak, aynı zamanda impo olduğunutüm böbrek kelepçe çıkarıldıktan sonra hızla (pembe kadar) yeniden perfüze olduğunu rtant. Biz ağır kelepçeler bazı (örneğin BALB / c ve C57BL / 6) bazı suşları ile iyi çalışır, ama diğerleri bu kelepçeler vasküler hasara yol ve renal reperfüzyon (: CD1 gibi) sık sık eksik bulduk. Biz değerlendirdik bu vasküler kelepçeler, kelepçe ağırlıkları (basınç) ve fare suşları bir özeti Tablo 1'de listelenmiştir. Isıtma sistemleri için, araştırmacılar bir dizi sabit vücut sıcaklığını izlemek ve korumak için sıcaklık probları ile otomatik ayarlı ısıtma pedleri kullanmayın. Teorik olarak avantajlı iken, bu ısıtma sistemi oldukça değişken sonuçlar sebebiyet veren, ameliyat boyunca vücut ısısı büyük hali neden olabilir bulundu. Buna ek olarak, bu sistemler nispeten pahalı böylece bir herhangi bir zamanda çalışabilir farelerin sayısı olarak sınırlayabilir. Deneme yanılma bir sürü sonra biz su hea dolaşan, sabit bir sıcaklıkta taşınmışting sistemi. Bu en büyük avantajı ısıtma platformu ameliyat boyunca sabit sıcaklık (38 ° C) sağlamasıdır. Büyük bir platform alanı ile, herhangi bir zamanda (ki çoğu IR AKI çalışmalar için pratik bir gerekliliktir) yüzeyinde farelerde bir dizi üzerinde işletmek de mümkündür. , Biz yaralanma önemli değişkenlik orta (ama ciddi değil) IR-AKI sonra orada hala buldun söyledikten sonra. Bu tedaviler, yetersiz veya aşırı ağır yaralanma geliştirilmesi farenin tarihi, 24 saat ya da daha fazla travma sonrası başlatılır serum kreatinin analizi ile, randomizasyondan önce çalışmadan çıkarıldı edilebileceği çalışmalar için bir sorun değildir. Fareler yaralanma öncesi tedavisi görmeniz durumunda ya da genetik modelleri kullanılmaktadır Ancak, deneysel değişkenlik ek kontroller getirmiştir gerekebilir. Çekirdek vücut sıcaklığındaki dalgalanma bu modelde IR yaralanma, değişkenliği sınırlamak için bir yaklaşım değişkenlik için önemli bir katkı olması muhtemeldir çünkü olacaktır meklemek veya sonraki analizlerde dışlamak için uygun hayvanları belirlemek için rektal problar kullanılarak onitor çekirdek sıcaklıkları. Nihai değerlendirmeler fare yaş, kilo ve cinsiyet vardır. Deneyimlerimiz çoğu BALB / c fareler ile olmuştur, ve fareler vücut ağırlıkları ile, yaş 4-5 ay istikrarlı vücut ağırlığı ulaştığınızda ~ 25-28 g biz en iyi sonuçlar elde ettik. Erkek kadın ¹³ daha IR-AKI daha fazla duyarlılık beri Son olarak, biz erkek fareler sadece kullanarak çalışmaların tüm gerçekleştirin. Ancak, kontrolü zor olan ek değişkenler, bu yüzden her laboratuvar ve her araştırmacı kendi seçtikleri fare zorlanma arzu yaralanma şiddeti ikna etmek için hassas kelepçe süreleri ve koşulları kurmak gerekir.

Yazarlar ifşa hiçbir çıkar çatışması var.

Dr de CAESTECKER laboratuvar NIH 1RO1 HL093057-01 ve 1RC4DK090770-01 tarafından desteklenmektedir. Dr Harris'in laboratuvar DK38226, DK51265, DK62794 ve Gaziler İdaresi fon tarafından desteklenmektedir. Ayrıca Vanderbilt O'Brien Böbrek Sakatlık Merkezi hibe 1P30 DK079341 tarafından sağlanan fare böbrek hasarı cerrahi, serum kreatinin ve fibrozis testleri için destek.