La isquemia-reperfusión modelo de lesión renal aguda y post lesión fibrosis en ratones

Se describen modelos de lesión renal por isquemia-reperfusión inducida moderada y grave en la que los ratones se someten a pedículo renal unilateral de sujeción seguida de simultánea o en diferido nefrectomía contralateral, respectivamente. Estos modelos dan consistentemente lugar a la disfunción renal y la fibrosis después de la lesión, pero gravedad de la lesión y la supervivencia dependen de equipos de fondo, la edad y quirúrgicos ratón.

La isquemia-reperfusión lesión renal aguda inducida (IR-AKI) es ampliamente utilizado como un modelo de lesión renal aguda en ratones, pero los resultados son a menudo muy variables con altas tasas de mortalidad, a menudo no declarados que pueden confundir los análisis. Pedículo renal bilateral de sujeción se utiliza comúnmente para inducir IR-AKI, pero las diferencias entre las presiones dispositivo de parada y / o respuestas a isquemia renal entre los riñones a menudo conducen a resultados más variables. Además, se conocen tiempos más cortos de sujeción para inducir la lesión tubular más variable, y mientras que los ratones sometidos a lesión bilateral con tiempos de fijación más largos desarrollan lesión tubular más consistente, que a menudo muere en los primeros 3 días después de la lesión debido a la insuficiencia renal grave. Para mejorar la supervivencia después de la lesión y obtener resultados más consistentes y predecibles, se han desarrollado dos modelos de lesión por isquemia-reperfusión unilateral seguido de nefrectomía contralateral. Ambas cirugías se realizan usando un abordaje dorsal, reducir el estrés quirúrgico resultante from laparotomía ventral, comúnmente utilizado para ratón IR-AKI cirugías. Para la inducción de lesiones ratones BALB / c se someten a moderados unilateral de sujeción del pedículo renal por 26 min y también se someten a nefrectomía contralateral simultánea. El uso de este enfoque, el 50-60% de los ratones desarrollan moderada AKI 24 horas después del daño, pero 90-100% de los ratones sobreviven. Para inducir la más severa AKI, los ratones BALB / c se someten a pedículo renal de sujeción durante 30 min seguido de nefrectomía contralateral 8 días después de la lesión. Esto permite una evaluación funcional de la recuperación después de una lesión renal con 90 a 100% de supervivencia. Daño tubular después de la lesión temprana, así como la fibrosis después de la lesión son muy coherentes usando este modelo.

Una variedad de modelos experimentales de lesión renal aguda (LRA) se han desarrollado para que coincida con la diversidad y la complejidad de la condición humana (véase la referencia para una revisión reciente, amplio ^1). Cada uno de estos modelos tiene sus propias fortalezas y debilidades, y aunque cada imita las condiciones humanas correspondientes a diversas eficiencias, ninguno modelar con precisión la fisiopatología de sus homólogos humanos. La isquemia reperfusión (IR) inducida por AKI se ha desarrollado como un modelo de lesión renal inducida por isquemia aguda en roedores. Si bien la gravedad de la lesión tubular renal visto en este modelo se observa raramente en pacientes con lesiones de hipoperfusión renal ^2, a pesar de sus limitaciones y en gran parte debido a la naturaleza relativamente reproducible de este modelo, su extenso uso ha proporcionado y, se espera, continuará proporcionar pistas importantes sobre muchos de los mecanismos básicos comunes de AKI, reparación, y la terapia ^3. Cirugía IR requiere familiarity con la anatomía del riñón del ratón, que hemos ilustrado en una forma simplificada en la Figura 1. Cirugía de lesión renal por isquemia-reperfusión (IR) se puede realizar a través de enfoques ventrales (laparotomía) o dorsal (retroperitoneal). Nosotros usamos un enfoque dorsal ya que es menos traumática, lo que permite tiempos de recuperación más rápido y una mejor supervivencia (particularmente cuando primero aprender el procedimiento). Renal lesión IR se puede realizar de manera unilateral o bilateral. Sin embargo, las diferencias entre las presiones eficaces abrazadera (que pueden resultar de la interposición de grasa perihiliar entre las mordazas de sujeción) y / o diferencias en las respuestas a la isquemia renal entre los lados conduce a resultados más variables. Si bien esto no es un problema insuperable, puede aumentar la variabilidad entre los experimentos, que es un problema importante para este modelo. IR unilateral se puede realizar con nefrectomía contralateral. Este es nuestro método de elección, ya que reduce la variabilidad en la sujeción entre pedículos, y al mismo tiempo unallows uno para evaluar la función renal, que se ve afectada con IR unilateral solo. Se ha debatido sobre lo que es el método más práctico vs óptima para evaluar la función renal en ratones. Nitrógeno de urea en sangre (BUN) proporciona una medida de la función renal y es un "primer vistazo" marcador útil en algunos modelos de AKI, incluyendo lesión IR. Sin embargo, los niveles de BUN pueden verse afectadas por el estado del volumen de los ratones que pueden verse afectados, en particular después de enfoque ventral de la lesión por IR, cuando la recuperación retardada reduce la ingesta oral de fluidos para un número de días después de la cirugía. La creatinina sérica está menos influenciada por el estado de hidratación, pero está claramente afectada por la masa muscular. Una de las dificultades con las mediciones de creatinina sérica ha habido problemas con la detección de cromógenos no-creatinina en suero de ratón utilizando técnicas basadas en ácido pícrico. Como una alternativa, una serie de centros han desarrollado un método basado en HPLC para cuantificar la creatinina ratón que no se ve afectada por este artefacto ^4. Sin embargo, UNLIke BUN y de creatinina de ácido pícrico ensayos, que sólo requieren 5-10 l de suero, HPLC-ensayos requieren ~ 25 l de suero por ensayo, que si se realiza en duplicado requerirá ~ 100 l de sangre entera por ensayo. Esto puede ser limitante para los estudios del ratón. Algunos centros han desarrollado métodos de HPLC y espectrometría de masas basado más sensibles que permiten el análisis de los volúmenes de muestra más pequeños ^{5, 6.} Sin embargo, estas tecnologías no están ampliamente disponibles. Una, ensayo de cascada enzimática alternativa (que requiere sólo el 5-10 l de suero) se ha evaluado en muestras de suero de ratón y de rata y se muestra en paralelo estrechamente HPLC mediciones de creatinina en suero, mientras que los ensayos de ácido pícrico siempre los valores de creatinina sobre-estimación ^7. Mientras que este ensayo no se utiliza ampliamente en la literatura AKI, el ensayo está disponible comercialmente, fácil de usar, y nos encontramos da resultados fiables con este modelo de IR inducida por lesión renal aguda en ratones.

1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía. Tenga en cuenta que si se está realizando múltiples cirugías en diferentes ratones, enjuague los instrumentos después de su uso y después esterilizar con un esterilizador de cuentas caliente. No es suficiente en remojo en etanol al 70%.
2. Dale 0,5 ml de S / C de solución salina normal estéril inmediatamente antes de la cirugía y después de la operación para compensar la pérdida de fluido corporal durante la cirugía.
3. Pesar los ratones.
4. Anestesie ratón usando IP xilazina / mezcla de ketamina. Por lo general toma 3-5 minutos para los ratones para llegar a la anestesia plano quirúrgico.
5. Afeitar el sitio quirúrgico con suficiente área de la frontera para mantener el cabello de la contaminación de la zona de la incisión. Esto necesita ser realizado en una zona de preparación, donde no se realiza la cirugía.
6. Aplicar pomada oftálmica de lubricante a los ojos para evitar el secado durante el procedimiento.
7. Ponga el ratón boca abajo en la superficie climatizada cubierta con banco de pad absorbente. Piernas de cinta a la superficie quirúrgica.
8. Si se utilizael sistema de baño de agua, sistema de calor a 38 º C 1 hora antes de la cirugía.
9. Preparación aséptica utilizando una solución de Betadine hisopo de palo: frote desde el centro del sitio hacia la periferia 3x, cada vez seguido de lavado con Nolvasan para eliminar el Betadine. Todos Betadine debe ser retirado del campo quirúrgico antes de la incisión de un enjuague con Nolvasan. Antes de iniciar el procedimiento de guantes asépticos se debe cambiar de ser estéril.
10. Cubra campo quirúrgico con un paño quirúrgico estéril. Esto evitará que el pelo no penetre en el campo quirúrgico y proporcionar un área en la que para sentar instrumentos estériles durante la cirugía.
11. Palpar ubicación riñón a través de la piel.
12. Cortar la piel dorsal a lo largo de la línea media del mouse (aproximadamente 1,5 cm) con unas tijeras y pinzas.
13. Piel separada y capas subcutáneas en los lados dorsal izquierda y derecha a través de esta incisión por disección roma con tijeras y pinzas.
14. Haga una pequeña incisión a través de la fl derechoank muscular y fascia anterior del riñón y exteriorizar el riñón derecho.
15. Diseccionar cuidadosamente los polos superior e inferior del riñón libres del tejido circundante. Tenga en cuenta que el tejido graso de todo el polo superior contiene la glándula suprarrenal llevar su propio suministro de sangre que puede ser empujado contra el riñón pero, obviamente, no debe ser retirado del ratón (Figura 1). Después de la liberación del riñón del tejido circundante, atar la sutura de seda 4-0 alrededor del hilio del riñón derecho con un nudo quirúrgico doble. Deja un extremo de la sutura ~ 2 en tiempo de sostener el riñón que usted está cortando distal al nudo para que pueda visualizar el sitio a cortar. Riegue el muñón con solución salina estéril.
16. Cierre la capa de músculo mediante el uso de sutura absorbible.
17. Hacer una pequeña incisión a través del músculo flanco izquierdo y la fascia por encima del riñón y exteriorizar el riñón izquierdo (Figura 2A).
18. Sostenga con cuidado renal utilizando pinzas romas mientras que la liberación renalpedículo del tejido circundante grasa con fórceps (Figuras 2B-2F). El exceso de presión sobre el riñón utilizando las pinzas romas puede causar lesión renal por lo que uno necesita recordar esto al diseñar controles "simulados" para los estudios. Si usted encuentra que sus controles simulados están desarrollando lesión renal (como lo demuestra el aumento de la creatinina sérica), un método alternativo que puede considerar para liberar el tejido graso circundante del pedículo renal es rodar suavemente los tejidos con solución salina estéril empapada de algodón hisopos con punta. En nuestra experiencia, la grasa es bastante firmemente unido al pedículo renal y no puede ser fácilmente removido con hisopos de algodón, por lo que este puede no ser el primer enfoque que se desea utilizar. Sin embargo, al igual que otros aspectos de este modelo, esto es algo que tendrá que establecer por sí mismo con la práctica y la experiencia.
19. Abrazadera izquierda pedículo renal mediante pinza vascular no traumático con fórceps de sujeción (para facilitar la colocación de abrazadera), utilice el temporizador para diferentes clapf veces dependiendo de la cepa del ratón y gravedad de la lesión requerido (véase la Tabla 1).
20. Cubra el riñón izquierdo con la piel (Figura 2H).
21. Cubra incisión de la piel con una gasa empapada en solución salina.
22. Exteriorizar riñón, confirmar aspecto oscuro uniforme y suelte la pinza después de los tiempos indicados, y confirme que el aspecto oscuro invierte de manera uniforme en todo el riñón (Figura 2I / G). Si el riñón no rápida y uniformemente re-perfuse (pink) el ratón debe ser excluido de mayor análisis. Empuje suavemente riñón nuevo en el espacio retroperitoneal.
23. Cierre la capa muscular con sutura absorbible.
24. Cierre la capa de la piel usando sutura de nylon monofilamento no absorbible.
25. Administrar buprenorfina analgesia.
26. Transfiera los ratones lejos del campo quirúrgico en una almohadilla de calentamiento hasta que se despiertan.
27. Volver a los ratones para sala de animales.
28. Seguir de cerca los ratones y administrar dosis adicionalesde buprenorfina como se ha indicado anteriormente cada 8-12 horas para el dolor o malestar. Los signos clínicos que resultan de la administración de analgésicos incluyen depresión u otros cambios de comportamiento, la apariencia anormal, o postura como pilo-erección, postura encorvada, la falta de preparación y de comer, o inmovilidad.

Moderado IR inducida AKI. IR unilateral con nefrectomía contralateral simultánea reduce sustancialmente la variabilidad en los resultados, pero con cortos tiempos necesarios para los ratones para sobrevivir este procedimiento de fijación, todavía encontró que sólo el 50-60% de los ratones desarrolló la esperada insuficiencia renal 24 horas después de la lesión (Figura 3A). En términos prácticos, esto crea dificultades para la evaluación de los datos a menos que los estudios implican regímenes de tratamiento que se pueden iniciar por lo menos 24 horas después del daño, dejando tiempo para evaluar la función renal y descartar los ratones que no desarrollan insuficiencia renal.

Grave AKI IR inducida. Además de realizar IR unilateral con nefrectomía contralateral simultánea, realizamos IR unilateral solo. Los ratones pueden sobrevivir períodos mucho más largos de isquemia y tienden a desarrollar la fibrosis después de la lesión más grave. Con el mismo período de isquemia, los ratones sometidos a isquemia unilateral develop la fibrosis más grave que la isquemia bilateral o isquemia unilateral con nefrectomía ^8, por lo que este modelo también se utiliza como un modelo de la fibrosis posterior a la lesión renal aguda. La desventaja es que no es posible evaluar la recuperación funcional después de una lesión unilateral de IR lo que no hay manera de evaluar la gravedad de la lesión sin obtención de los tejidos del riñón y que puede no ser posible para los estudios a largo plazo. Por esta razón hemos desarrollado un protocolo para la inducción de la lesión IR unilateral severa, y la evaluación de la recuperación de la función renal mediante la realización de nefrectomía contralateral 8 días después de la lesión original. El uso de este enfoque de 90-100% de los ratones sobrevivir a la lesión, pero es importante que los ratones desarrollar lesión renal muy consistente y pueden ser evaluadas para la recuperación funcional después de lesión renal aguda a partir del día 9 en adelante (Figura 3B). Estos hallazgos son consistentes con estudios en ratas indican que los tiempos de fijación de pedículo renal ya inducen lesión tubular renal más constituyente más corta que la abrazadera TI mes diseñado para inducir leve a moderada AKI ^9. Además, consistente con estudios previos ^8, estos ratones desarrollan consistentemente la fibrosis renal después de la lesión (que hemos evaluado en el Día 28). Esto no se asocia con proteinuria, al menos, sobre un fondo BALB / c: luego de severa IR-AKI en el día 28 después de la lesión urinaria cociente albúmina / creatinina es de 0,8 ± 0,04 (media ± SEM en mg / mg). Se desconoce si el modelo IR-AKI severa provoca proteinuria en otros fondos.

Figura 1. Anatomía del ratón hilio renal. Ilustrando la posición de la vaina vascular renal en relación con uréter, almohadillas de grasa perirrenal y la glándula suprarrenal con suministro de sangre. El círculo negro marca la posición del micro-clamp.

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Figura 2. La exposición y el apriete de ratón vaina vascular renal (A), la exposición del riñón izquierdo después de la disección de la piel y la capa muscular,. (B - E), el riñón izquierdo se mantiene suavemente con unas pinzas romas mientras que la grasa perirrenal se retira cuidadosamente con unas pinzas. (F), Expuesto dejó pedículo renal (flecha verde). La línea discontinua blanca marca la posición esperada del uréter en la almohadilla de grasa perihilar. Esta región debe ser evitado con la pinza vascular. (G), micro-pinza aplicada al riñón izquierdo (H)., Blocado riñón izquierdo se cubre con la piel. (I), (G), Apariencia del riñón antes (A), durante (I) y después (G) después de la eliminación de la pinza vascular.

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Figura 3. La recuperación funcional después de la lesión renal aguda. Los cambios en la creatinina sérica (por ensayos enzimáticos) después de la lesión IR moderada (26 min tiempo de fijación) y la nefrectomía contralateral (A), los cambios en la creatinina sérica después de la inducción de lesiones graves (30 min de tiempo de abrazadera) y nefrectomía contralateral en Día 8 (B). Estudios realizados en ratones BALB / c, n = 6 por grupo. Resultados expresados ​​como media + /-SEM de creatinina en suero en mg / dl, medida usando el ensayo enzimático.

Tabla 1. Pinzas vasculares, tiempos de isquemia, y cepas de ratones recomendado que hemos evaluado.

Se describen dos modelos de IR-AKI para estudiar los efectos de la lesión renal moderada y grave. Estos modelos nos permiten provocar daño consistente y predecible con baja mortalidad. El protocolo describe muchas de las dificultades y peligros asociados tradicionalmente con este modelo. Por otra parte, hemos demostrado que, dependiendo de la longitud del pedículo renal de sujeción, el modelo induce una gran parte reversible leve y moderada AKI, o más severa AKI con una recuperación incompleta y la fibrosis renal persistente. La fibrosis después de la lesión en el modelo IR-AKI severo puede resultar del hecho de que los ratones son capaces de sobrevivir con lesión renal más grave de lo que sería posible si estos tiempos isquémicos ya se habían realizado bilateralmente. Sin embargo, también hay evidencia de que la presencia de un riñón contralateral no lesionado durante los primeros pocos días después de IR mejora post-AKI la fibrosis ^8. Por lo tanto, mientras que los mecanismos de diafonía entre los riñones lesionados y heridos siguen siendo estableestablecido, este mecanismo también puede dar cuenta de la fibrosis mejorada después de la lesión que se observa en este modelo. Aunque queda por determinar si los hallazgos utilizando estos modelos se pueden traducir en la terapéutica para la enfermedad humana, que proporcionan modelos fiables para estudiar los mecanismos y la terapéutica en IR-AKI y para prevenir post-AKI fibrosis renal, un problema clínico que se está convirtiendo en un principal contribuyente en la enfermedad renal crónica progresiva ^{10, 11.}

Hay una serie de cuestiones importantes que pueden influir en la gravedad de la lesión renal aguda después de la lesión IR que se tienen que atender cuidadosamente a: cepa de ratón ^{12, 13} géneros, ¹⁴ años ^de edad y el peso del ratón, la pinza vascular utilizado y los sistemas de calefacción ^15. La elección de las pinzas vasculares adecuados puede ser un desafío. Eficiencia de la abrazadera se evalúa durante el procedimiento quirúrgico como el riñón debe ser de color negro uniforme dentro de 5-10 minutos de la colocación de la abrazadera. Sin embargo, también es importante que todo el riñón es re-perfusión (rosas arriba) rápidamente después de la eliminación de la abrazadera. Hemos encontrado algunas de las abrazaderas más pesados ​​funcionan bien con ciertas cepas (por ejemplo, ratones BALB / c y C57BL / 6), pero en otros estas abrazaderas inducir la lesión vascular y la reperfusión renal es a menudo incompleta (por ejemplo: CD1). Un resumen de las pinzas vasculares, pesos de fijación (presión) y las cepas de ratón que hemos evaluado se enumeran en la Tabla 1. Para los sistemas de calefacción, un número de investigadores utilizar compresas calientes auto-regulados, con sondas de temperatura para controlar y mantener la temperatura corporal constante. Aunque teóricamente ventajoso, nos pareció que este sistema de calefacción puede dar lugar a grandes oscilaciones en la temperatura corporal durante el curso de la cirugía, dando lugar a resultados muy variables. Además, estos sistemas son relativamente caros por lo que puede limitar, en el número de ratones que se puede operar sobre en un momento dado. Después de mucho ensayo y error, hemos pasado a una temperatura constante, circulando hea del aguasistema ting. La principal ventaja de esto es que la plataforma de calefacción da temperaturas estables (38 ° C) durante toda la cirugía. Con la gran área de la plataforma también es posible operar en un número de ratones en la superficie en un momento (que es un requisito práctico para la mayoría de los estudios de IR-AKI). Una vez dicho esto, nos dimos cuenta de que había todavía una variabilidad significativa en lesiones tras moderada (pero no severos) IR-AKI. Esto no es un problema para los estudios en los que los tratamientos se iniciaron 24 horas o más después de la lesión, ya que los ratones en desarrollo lesión insuficiente o excesivamente severa pueden ser retirados del estudio antes de la aleatorización por el análisis de la creatinina sérica. Sin embargo, si los ratones son tratados antes de la lesión o si se están utilizando modelos genéticos, pueden necesitar ser introducido controles adicionales de variabilidad experimental. Dado que la fluctuación de la temperatura corporal central es probable que sea el principal contribuyente a la variabilidad en la lesión por IR en este modelo, un enfoque para limitar la variabilidad sería mtemperaturas centrales Onitor utilizando sondas rectales con el fin de determinar los animales apropiados para incluir o excluir en los análisis posteriores. Las consideraciones finales son la edad del ratón, peso y sexo. La mayor parte de nuestra experiencia ha sido con los ratones BALB / c, y hemos obtenido los mejores resultados cuando los ratones alcanzan el peso corporal estable por 4-5 meses de edad, con pesos corporales ~ 25-28 g. Por último, ya que los machos tienen una mayor susceptibilidad a la IR-AKI que las hembras ^13, realizamos todos nuestros estudios con ratones machos solamente. Sin embargo, hay variables adicionales que son difíciles de controlar, por lo que cada laboratorio y cada investigador tendrá que establecer los tiempos de fijación y las condiciones exactas para inducir la gravedad de la lesión que desean en la cepa de ratón de su elección.

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

El laboratorio del Dr. de Caestecker el apoyo de NIH 1RO1 HL093057-01 y 1RC4DK090770-01. Laboratorio del Dr. Harris es apoyado por DK38226, DK51265, DK62794 y la financiación de la Administración de Veteranos. Apoyo a cirugías renales ratón lesiones, creatinina sérica, y ensayos de fibrosis también proporcionadas por la Vanderbilt O'Brien Kidney Injury Center subvención 1P30 DK079341.