Plazma Protein Koruma Kan Alma Kitleri Genomik DNA Ayıklama Pratik ve Yeni Bir Yöntem

Bu plazma / seroloji alınan tam kandan genomik DNA'nın izole edilmesi için yeni bir yöntem tarif edilmektedir. Plazma toplama sonra, sıkıştırılmış kan genellikle atılır. Bizim yeni bir yöntem mevcut yöntemlere göre önemli bir gelişme gösteren ve ek kan almadan, DNA ve tek bir koleksiyon edinilebilir plazma yapar.

Laboratuvar testleri, kanın hücresel veya sıvı kısımlar üzerinde yapılabilir. Farklı kan toplama tüpleri kullanımı analiz edilebilir, kan (tam kan, plazma veya serum) kısmını belirler. Insan hastalıkların genetik temeli eğitim dahil Laboratuvarları genomik / genetik analiz için DNA kaynağı olarak EDTA içeren vacutainer toplanan antikoagüle tam kan güveniyor. En klinik laboratuvarlar fenotipik sonuç soruşturma bir ilk adım olarak biyokimyasal, serolojik ve viral test gerçekleştirmek için, antikoagüle kan da heparin içeren tüp (plazma tüp) toplanır. DNA ve plazma genomik ve proteomik her iki veri aynı anda ve paralel analizler için gerekli olan bu nedenle zaman, EDTA ve heparin tüpleri hem de kan toplamak için gelenektir. Kan tek bir tüp içerisinde toplanır ve plazma DNA ve hem de bir kaynağı olarak hizmet olabilir, bu yöntem, mevcut meth bir gelişme olarak düşünülebilirods. Plazma çıkarma sonra sıkıştırılmış kan kullanımı, böylece işlenmiş kan örnekleri miktarını en aza indirmek ve her bir hastanın gerekli olan örnek sayısını azaltarak, genomik DNA için alternatif bir kaynak oluşturmaktadır. Bu sonuçta zaman ve kaynak tasarrufu olur.

Plazma proteinlerine korunması için BD P100 kan toplama sistemi insan kanından daha iyi protein biyolojik keşif ve proteomik deney sağlayan, kan protein içeriği stabilize etmek, önceki plazma veya serum toplama tüpleri ¹ üzerinde geliştirilmiş bir yöntem olarak yaratılmıştır. BD P100 tüpler 15.8 püskürtülerek kurutulmuş K2EDTA ml ve pıhtılaşmayı önlemek ve plazma proteinleri stabilize proteaz inhibitörleri arasında, bir liyofilize edilmiş özel bir geniş spektrumlu bir kokteyl içerir. Ayrıca, uygulanan santrifüj işlemi sonrasında serum ve hücre topakları arasında fiziksel bir engel, mekanik ayırıcı, içerir. Birkaç yöntem pıhtılaşmış kan sa DNA elde etmek için icat edilmiştirmples eski plazma tüpler ^2-4 toplandı. Bu yöntemleri Zorluklar özellikle tüpler (jel ayırıcı) içinde ayırıcı türü ile ilişkili ve pıhtılaşmış kan kurtarma zorluk, parçalanan veya pıhtı dağıtma rahatsızlık, ve ayırma jel ile pıhtı çıkarma tıkanıklığı dahil edildi.

Biz yeni BD P100 tüplerde alınan kan genomik DNA ayıklar ve temizler ilk yöntem mevcut. Biz P100 tüplerinden EDTA tüpleri edilene DNA örneği kalitesini karşılaştırın. Yaklaşımımız basit ve etkilidir. ) Kan toplama, 2 mekanik ayırıcı ile sakaroz bir arada kullanarak mekanik ayırıcı çıkarılması ve 1) bir plazma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, ABD) kullanımı tüp: Aşağıdaki gibi dört ana adımdan oluşur steril ataç metal kanca, 3) beyaz hücreleri ve 4 içeren buffy coat tabakasının ayrılması) gelen genomik DNA izolasyonudüzenli bir ticari DNA ekstraksiyon kiti ya da benzer bir standart protokolü kullanarak buffy coat.

1. Örnek Toplama

1. Uygun bilgilendirilmiş onam bireylerin kan örnekleri toplayın. Her birey için, bir P100 tüp (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, ABD) içine kan 4 ila 5 ml çizin. Karşılaştırma amacıyla, aynı anda bir EDTA tüp kan toplamak.
2. BD P100 tüpler 15.8 mi püskürtülerek kurutulmuş K2EDTA ve pıhtılaşmayı önlemek ve plazma proteinleri stabilize proteaz inhibitörleri arasında, bir liyofilize edilmiş özel bir geniş spektrumlu bir kokteyl içerir. Bunlar, aynı zamanda, mekanik bir ayırıcı içerir. Işleme oluşana kadar tam kan toplanmasından sonra, bir gece için 60 dakika için oda sıcaklığında iki tüp tutun.
3. Oda sıcaklığında on beş dakika boyunca 2.500 g BD P100 tüpler santrifüj. Mikro santrifüj tüplerine mekanik ayırıcı üzerinde toplanır Plazma aktarın.
4. -80, Ayırıcı altında sıkıştırılmış kan içeren, P100 tüpler saklayın ° C DNA dahili başlamak için hazır olana kadarraction.

P100 tüp kan (P100_DNA) itibaren 2.1

1. P100 tüpler -80 saklanır ° C plazma çekimi sonrası. 3-4 ay içinde, 5 dak (Şekil 1A) için bir su banyosu içinde 37 ° 'de dondurucu ve çözülme sıkıştırılmış kanı içeren P100 tüpü alır. Ayırıcı oturur kalan plazma çıkarın. Ayırıcı yukarıdaki P100 tüpleri (Şekil 1B) -% 17 sakaroz çözeltisini (yayınlanmamış veri evde test degrade çözelti) 2 ml ekleyin. 2500 g, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında Santrifüj tüpleri, bu süreç tüpün üstüne mekanik ayırıcı iter ve buffy coat (Şekil 1C) gibi çözelti üç tabaka elde edilir. El ile sterilize kanca metal ataç (Şekil 1D) kullanarak ayırıcı ayıklayın.
2. Her bir tüp (Şekil 1D) gelen mekanik ayırıcı aldıktan sonra çıkarın ve Discard En iyi sukroz tabaka. Steril bir 15 ml konik bir tüp içine buffy coat (BC) katmanı temsil eden orta tabaka, aktarın. 3 ml buffy coat hacmi artırmak için fosfat tampon tuzu (PBS) ekleyin. Üreticinin tavsiye başı olarak Qiagen Puregene Kan Seti reaktifler kullanarak buffy coat DNA ayıklayın, 2.500 g santrifüj hızı (yerine 2.000 g) hariç.
3. Kırmızı kan hücreleri (RBC) lyse ve kaldırmak için, buffy coat 3 ml RBC parçalama 9 ml ekleyin. Her bir tüp birkaç kez ters çevirin ve inkübasyon esnasında zaman zaman Çeviren ile 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 5 dakika boyunca 2.500 g her karışım aşağı Spin ve süpernatant atın. 15 saniye için hücre parçalama çözeltisi ve vorteks 3 ml Her bir tüp içinde kalan topak Treat. 1 proteini çökelme çözeltisi ilave edildi ve 15 saniye boyunca girdap ile lizat tedavi.
4. 5 dakika boyunca 2500 g'de santrifüj ihtiva eden bir taze 15 ml konik bir tüp içine süpernatantı transfer% 100 izopropanol, 3 ml. 3 dakika 2500 g yeni tüpler 10 kez ve santrifüj ters. Süpernatant atılır ve% 70 etanol içinde 1 ml. Konik tüpler DNA pelet çıkarmak ve yıkamak için birkaç kez ters. 1 dakika 2.500 g santrifüj. Pelet, oda sıcaklığında 3 dakika (ters tüp yerleştirmek), kuru ve daha sonra 10 dakika karıştırıldı ve bir ön-etiketli 1.7 mL mikrotüp transfer etmek için 37 ° C'de rehidrasyon solüsyonu, 250 ml ile DNA askıya izin verin. -80 Tüpler Mağaza ° C kullanana kadar.

EDTA Ttube Kan (EDTA_DNA) itibaren 2.2

1. Immunohematology rutin test için tam kan _K2 EDTA, 10.8 mg püskürtülerek kaplanır ve -80 ° C de saklanır vaccutainer plastik tüplerde toplanır Tüpler bir mekanik ayrıştırma içermediklerinden, DNA ekstraksiyon mekanik ayırıcı (2.1.1 ve 2.1.2), ilgili adımları içermez.
2. Kan depolama, DN 3 ila 4 ay içindeBir yalıçapkını Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) ile elde edilir. Bu manyetik parçacık teknolojisine dayanan ve hücre parçalama / DNA bağlanma, birçok yıkama aşamaları ve DNA elüsyon oluşan bir DNA ekstraksiyon otomasyon sistemidir.
3. DNA ekstraksiyonu kullanılan kit, Kingfisher'a Flex 24 DNA'nın kan kiti (Qiagen, Almanya) 'dir.

3. DNA Miktar ve Kalite Değerlendirmesi

Genomik DNA miktar, kalite ve bütünlüğü PicoGreen, spektroskopi ve elektroforez içeren yönteminin bir kombinasyonu ile değerlendirildi.

1. Genomik DNA'nın konsantrasyonu Nanodrop ve PicoGreen ölçümü ile tespit edilir.
2. Saflık NanoDrop spektrofotometresi üzerinde 260/280 oranı ölçümü ile tespit edilir.
3. Numune (500 ng), DNA bütünlüğü (bozulma) değerlendirmek için% 1 agaroz jel üzerine yüklenir.

4. Genotyping Tahliller ve Kalite Kontrol

1. Beş P100_DNA ve bunların karşılık gelen EDTA_DNA rastgele seçilen özel Immunochip (Immuno DNA analiz BeadChip) kullanarak, daha fazla analiz için seçilmiştir. Immunochip 196.524 polimorfizmleri içeren bir Infinium genotiplendirme çip ve immünogenetik çalışmaları ⁵ için tasarlanmıştır.
2. Her numune için, DNA 200 ng, parçalanmış güçlendirilmiş çöktürülmüş ve uygun hibridizasyon tamponu içinde tekrar süspanse edilir.
3. Denatüre numuneler 16 saat arasında, en az 48 ° C 'de Immunochips üzerinde melezlendi.
4. Hibritlemeden sonra, Immunochips tek-baz uzatma reaksiyonları ve lekeli için işlenir.
5. Immunochips sonra Illumina HiScan Boncuk dizi okuyucu ve normalize boncuk yoğunluğu veri Illumina GenomeStudio yazılım yüklenir ve genotipleri dönüştürülür kullanarak görüntülü. Genotipler arasında GenomeStudio autocalling algoritması kullanılarak adlandırılır. Içinde kalite kontrolBir arama oranı <% 95 ile tek nükleotid polimorfizmlerinin dışlama (SNP) volves.
6. SNP arama oranı immunochip tahlilinde etkinliğinin bir ölçüsü olarak kullanılır. Bu otomatik bir genotip atama almak için yeterli sinyal yoğunluğu ve kalitesi elde çip (196.524 SNP her çip üzerinde kodlanmış) üzerindeki deneyleri toplam sayısı yüzdesi olarak hesaplanır. Yüksek kaliteli DNA (260 / 1.8 280 oranı veya daha yüksek ve bozulma olmaması) immunochip testi dahil HapMap kontrol DNA olarak en azından aynı arama oranı elde etmesi bekleniyor. Kalite kontrol bir arama oranı <% 95 her bir veri seti ile SNP dışlanması içerir.

DNA kalite değerlendirme ve konsantrasyon ölçüm

P100_DNAs bir verim EDTA_DNAs (Tablo 1 ve 2) göre daha düşüktü. Onun 260/280 oranı değeri temsil DNA saflık P100_DNA ve EDTA_DNA örnek seti (Tablo 1 ve 2) her ikisi için de benzer. DNA kalitesi örneğin her resim grubu bazı bozulma EDTA_DNA örneklerde görüldüğü halde, olarak (Şekil 2) ışık yayma ile gösterilen içinde oldukça düzenlidir. Bozulmanın daha belirtileri gösterdi EDTA_DNAs da düşük DNA konsantrasyonu gösterdi.

Genotiplendirmesi

EDTA_DNAs ve P100_DNAs hem genotiplendirme arama oranı karşılaştırıldı. Onlar benzer arama oranları vermiştir ve hem iç HapMap kontrol DNA (Tablo 3) karşılaştırılabilir.

Şekil 1. Buffy kat izolasyon.

Tablo 1. DNA örneği verim (PicoGreen) ve oranı (Nanodrop).

Tablo 2'de. Verim ve saflık karşılaştırılması (iki kuyruklu, Eşleştirilmiş t-testi).

Tablo 3. Genotiplendirmesi arama oranı (iki kuyruklu, Eşleştirilmiş t-testi).

Ek. Kırmızı kan hücreleri (RBC) tabakasında bulunan DNA miktarının değerlendirilmesi.

Birçok insan hastalıkları genetik nedenleri ve insan hastalığın genetik temeli keşfetmek giderek artan kaliteli DNA gerektirir. Genetik çalışmalar kullanılan DNA'nın en yaygın kaynağı tam kan antikoagüle edilir. En klinik laboratuvarlar fenotipik sonuç soruşturma bir ilk adım olarak, biyokimyasal serolojik ve viral test gerçekleştirmek için, kan genellikle plazma tüp toplanır. Plazma toplama sonra, sıkıştırılmış kan genellikle atılır. Bu nedenle, DNA genetik çalışmalar veya test yapmak için gerektiğinde, ek bir kan beraberlik aynı hastadan gereklidir. Bu beyaz kan hücreleri içeren olarak atılır sıkıştırılmış kan DNA potansiyel bir kaynağıdır. Bu nedenle, plazma tüpler sıkıştırılmış kan kullanarak fazla kan çekmek veya ek kan için hasta hatırlamak gerek kalmadan, daha verimli alınan kan örneği kullanmak için bir fırsat sunuyor.

Eski için çeşitli yöntemlersıkıştırılmış ya da pıhtılaşmış kan akyuvar ikinci yolu DNA ^6-10 bildirilmiştir. Bu yöntemlerin zorlukları çoğu plazma toplama tüp tasarımı ile ilişkili bulunmuştur. Daha önce plazma toplama tüpleri santrifüj zaman, plazma (ayırıcı üstünde), kan hücreleri (ayırıcı aşağıda tuzak) ayırmak için bir bariyer oluşturduğu, bir jel (jel ayırıcı) yapılmış bir ayırıcı içeriyordu. Jel malzeme ile kan hücrelerinin kirlenmesini önlemek için, ayırıcı ilk dikkatle tüp ¹¹ uzaklaştırılmalıdır. Bu verimli DNA izolasyonu garanti altına almak için kan pıhtısı bir parçalanma takip eder. Parçalama işlemi genellikle kan örneğinin önemli bir kayıp ve DNA veriminde bir düşüşe neden olur. Örnek kaybını en aza indirmek ve sürecini iyileştirmek için, küçük gözenek örgü mekanik küçük parçalar ¹² içine kan pıhtısı dağınık için kullanılır, ama parçalanma hala etkilenen DNA verim ve kalite ve e olduven teknisyen ¹³ bir sağlık tehlikesi oluşturmaktadır.

BD biyobilim gelen BD P100 tüpler çok merkezli immünolojik araştırma ¹⁴ değerlendirilmiştir plazma toplama tüpleri en son kuşak vardır. Önceki plazma tüpler gibi, plazma proteinleri stabilize etmek ve proteaz inhibitörleri koagülasyon önlemek için antikoagülan içerir. BD P100 tüpün en büyük yenilik, her tüp içindeki mekanik ayırıcı (bir jel ayırıcı) içinde bulunur. Mekanik ayırma da santrifüj işleminden sonra, plazma ve hücre pelletini arasında fiziksel bir bariyer sağlar, ancak jel ayırıcı farklı olarak, bir jel, örnek kirlenme riski vardır. Bu çalışmada kullanılan protokol, bir parçalanma dahil değildir, bu nedenle herhangi bir sağlık tehlikesi riski yoktur.

DNA (DNA ekstraksiyon bakınız), ticari bir kit protokolü kullanarak, buffy coat elde edildi. BD P100 tüpler içinde sıkıştırılmış kan cryop idiDNA ekstraksiyon öncesinde 3-4 aylık bir süre için ayrılmıştır. EDTA tüpleri (EDTA_DNA) elde edilen DNA bunlara karşılık gelen P100_DNA verimi ve kalite değerlendirilmesinde bir kontrol olarak kullanılmıştır. Daha önceki çalışmalarda ^12,13,15 itibaren, EDTA_DNA örneklerin verim önceki plazma tüplerin kandan DNA göre anlamlı olarak yüksek bulundu. Bu çalışmada, her bir hastadan toplanan aynı miktarda tam kan, kan sıkıştırılmış buffy coat az DNA (Tablo 2, p = 0,00221) elde edilmiştir. (Bkz. ek yeni P100 plazma tüplerine kan DNA ekstraksiyonu sırasında, buffy kıyıdan bazı beyaz kan hücreleri, alyuvar hücresi tabakasına kaybolur (aşağıya), ancak, buffy coat elde edilenlere kıyasla DNA önemsiz bir miktarını temsil eder tablo). EDTA_DNAs görülen verim değişimi de P100_DNA bağımlı örnek olduğunu düşündüren ile taklit edilir. Yüksek hacimli numuneler normalde daha fazla DNA ve örnekleri doğuracakdüşük ses ve / veya hafif bozulmuş DNA ile daha az DNA doğuracak.

Agaroz jel (Şekil 2) Analizleri EDTA_DNAs bunlara karşılık gelen P100_DNAs görülmeyen bozulma belirtileri (smear) göstermek olduğunu ortaya koydu. Özellikle, düşük verim iki EDTA_DNA örnekleri (EDTA_01053 ve EDTA_06030) diğerlerine göre daha fazla yayma göstermektedir. Yaptıkları çalışmada, Wong ve ark. ¹¹ artan depolama süresi azalmıştır DNA verim bildirdi. Bizim depo tüm kan örnekleri aynı depolama durumuna tabi tutuldu ve bu çalışmada kullanılan örnek alt rastgele seçilen bu yana, depolama uzunluğu ve durumu P100_DNAs ve EDTA_DNAs arasındaki agaroz jel üzerinde görülen farklılıkların hesaba olası değildir. Sadece EDTA_DNAs gösterisi bozulması EDTA tüplerde proteaz inhibitörlerinin eksikliği ile ilişkili olabilir olması.

P100_DNAs ve EDTA_DNAs saflığını anlamlı olarak farklı değildi ( Tablo 2, p = 0,09836). Bu kaliteli DNA verimli rutin bir ticari kit kullanılarak P100 plazma tüpler elde edilebilir olduğunu göstermektedir. Biraz bozulmuş EDTA_DNA örnekleri de bu saflık düşündüren, iyi saflık göstermek gerçeği DNA örneği bütünlüğünün iyi bir ölçü değildir.

Kullanılan örnekler enflamatuvar bağırsak hastalığı genetik çalışmalar için seçilmiştir. Bu nedenle, çıkarılan DNA örnekleri performansını karşılaştırmak için, immunochip ⁵ genotiplendirme test platformu olarak seçildi. Immunochip immünogenetik ^16,17 için iyi bir eşleme genotiplendirme platform olarak kullanılmıştır. SNP genotipleme tahlillerin genom DNA doğası performans sıkı bir ölçüsü olarak kullanılmıştır. Tüm DNA testi ve HapMap kontrol örnekleri için ortalama genotiplendirme arama oranları, tüm fişleri arasında, kan alma tüpleri hem de DNA karşılaştırılabilir mükemmel performans gösteren, sırasıyla 97.76% ve 97.4% idi ( Tablo 3, p = 0,67970).

Sonuç

DNA plazma proteomik çalışmaları için çizilmiş aynı kan numunesinden genomik test kolaylaştırmak BD P100 borular, sıkıştırılmış kandan izole edilebilir. Sonuçlarımız P100 tüp araştırma programı uzatmak. P100 toplanan kan hücresel içeriği DNA genomik analizler için kullanılabilir olması proteomik ve genomik hem analizleri yapılacak olan çalışmalar için örnek toplama basitleştirmeye yardımcı olabilir. Bu nedenle, daha az kan her insan konudan gereklidir ve çalışma sponsorlar ve personel için ilişkili bir maliyet ve çaba tasarruf artırıldı. Göstermiştir çeşitli avantajları vardır:

• Hem genomik ve proteomik çalışmalar yapılması gerek daha az kan insan konu başına gereklidir. Bu çizilebilir kan hacminin dikkat sınırlama gerektirir hastalık durumları olan hastalarda (örneğin, lösemi gibi) için özel değer taşımaktadır.
• Sadece bir kan tüpü genel protokol basitleştirilmesi, örnek toplama ve işleme aşamalarında gereklidir.
• Bir rutin ticari kit BD P100 tüpler toplanan kandan DNA açılan etkili kanıtlamıştır.
• Kullanım, satın alma ve bir tüp işleme ile ilişkili maliyet tasarrufu artar.

Çıkar çatışması ilan etti.