Method Article
Bu plazma / seroloji alınan tam kandan genomik DNA'nın izole edilmesi için yeni bir yöntem tarif edilmektedir. Plazma toplama sonra, sıkıştırılmış kan genellikle atılır. Bizim yeni bir yöntem mevcut yöntemlere göre önemli bir gelişme gösteren ve ek kan almadan, DNA ve tek bir koleksiyon edinilebilir plazma yapar.
Laboratuvar testleri, kanın hücresel veya sıvı kısımlar üzerinde yapılabilir. Farklı kan toplama tüpleri kullanımı analiz edilebilir, kan (tam kan, plazma veya serum) kısmını belirler. Insan hastalıkların genetik temeli eğitim dahil Laboratuvarları genomik / genetik analiz için DNA kaynağı olarak EDTA içeren vacutainer toplanan antikoagüle tam kan güveniyor. En klinik laboratuvarlar fenotipik sonuç soruşturma bir ilk adım olarak biyokimyasal, serolojik ve viral test gerçekleştirmek için, antikoagüle kan da heparin içeren tüp (plazma tüp) toplanır. DNA ve plazma genomik ve proteomik her iki veri aynı anda ve paralel analizler için gerekli olan bu nedenle zaman, EDTA ve heparin tüpleri hem de kan toplamak için gelenektir. Kan tek bir tüp içerisinde toplanır ve plazma DNA ve hem de bir kaynağı olarak hizmet olabilir, bu yöntem, mevcut meth bir gelişme olarak düşünülebilirods. Plazma çıkarma sonra sıkıştırılmış kan kullanımı, böylece işlenmiş kan örnekleri miktarını en aza indirmek ve her bir hastanın gerekli olan örnek sayısını azaltarak, genomik DNA için alternatif bir kaynak oluşturmaktadır. Bu sonuçta zaman ve kaynak tasarrufu olur.
Plazma proteinlerine korunması için BD P100 kan toplama sistemi insan kanından daha iyi protein biyolojik keşif ve proteomik deney sağlayan, kan protein içeriği stabilize etmek, önceki plazma veya serum toplama tüpleri 1 üzerinde geliştirilmiş bir yöntem olarak yaratılmıştır. BD P100 tüpler 15.8 püskürtülerek kurutulmuş K2EDTA ml ve pıhtılaşmayı önlemek ve plazma proteinleri stabilize proteaz inhibitörleri arasında, bir liyofilize edilmiş özel bir geniş spektrumlu bir kokteyl içerir. Ayrıca, uygulanan santrifüj işlemi sonrasında serum ve hücre topakları arasında fiziksel bir engel, mekanik ayırıcı, içerir. Birkaç yöntem pıhtılaşmış kan sa DNA elde etmek için icat edilmiştirmples eski plazma tüpler 2-4 toplandı. Bu yöntemleri Zorluklar özellikle tüpler (jel ayırıcı) içinde ayırıcı türü ile ilişkili ve pıhtılaşmış kan kurtarma zorluk, parçalanan veya pıhtı dağıtma rahatsızlık, ve ayırma jel ile pıhtı çıkarma tıkanıklığı dahil edildi.
Biz yeni BD P100 tüplerde alınan kan genomik DNA ayıklar ve temizler ilk yöntem mevcut. Biz P100 tüplerinden EDTA tüpleri edilene DNA örneği kalitesini karşılaştırın. Yaklaşımımız basit ve etkilidir. ) Kan toplama, 2 mekanik ayırıcı ile sakaroz bir arada kullanarak mekanik ayırıcı çıkarılması ve 1) bir plazma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, ABD) kullanımı tüp: Aşağıdaki gibi dört ana adımdan oluşur steril ataç metal kanca, 3) beyaz hücreleri ve 4 içeren buffy coat tabakasının ayrılması) gelen genomik DNA izolasyonudüzenli bir ticari DNA ekstraksiyon kiti ya da benzer bir standart protokolü kullanarak buffy coat.
1. Örnek Toplama
P100 tüp kan (P100_DNA) itibaren 2.1
EDTA Ttube Kan (EDTA_DNA) itibaren 2.2
3. DNA Miktar ve Kalite Değerlendirmesi
Genomik DNA miktar, kalite ve bütünlüğü PicoGreen, spektroskopi ve elektroforez içeren yönteminin bir kombinasyonu ile değerlendirildi.
4. Genotyping Tahliller ve Kalite Kontrol
DNA kalite değerlendirme ve konsantrasyon ölçüm
P100_DNAs bir verim EDTA_DNAs (Tablo 1 ve 2) göre daha düşüktü. Onun 260/280 oranı değeri temsil DNA saflık P100_DNA ve EDTA_DNA örnek seti (Tablo 1 ve 2) her ikisi için de benzer. DNA kalitesi örneğin her resim grubu bazı bozulma EDTA_DNA örneklerde görüldüğü halde, olarak (Şekil 2) ışık yayma ile gösterilen içinde oldukça düzenlidir. Bozulmanın daha belirtileri gösterdi EDTA_DNAs da düşük DNA konsantrasyonu gösterdi.
Genotiplendirmesi
EDTA_DNAs ve P100_DNAs hem genotiplendirme arama oranı karşılaştırıldı. Onlar benzer arama oranları vermiştir ve hem iç HapMap kontrol DNA (Tablo 3) karşılaştırılabilir.
Şekil 1. Buffy kat izolasyon.
Tablo 1. DNA örneği verim (PicoGreen) ve oranı (Nanodrop).
DNA Verim | DNA Saflık | |||
Örnekleri | P100 | EDTA | P100 | EDTA |
1 | 135 | 340 | 1.79 | 1.9 |
2 | 119 | 344 | 1.85 | 1.89 |
3 | 57 | 129 | 1.88 | 1.88 |
4 | 159 | 640 | 1.86 | 1.88 |
5 | 140 | 430 | 1.86 | 1.88 |
6 | 150 | 673 | 1.86 | 1.9 |
7 | 139 | 425 | 1.74 | 1.88 |
8 | 118 | 240 | 1.87 | 1.86 |
9 | 51 | 86 | 1.87 | 1.83 |
p değeri | p = 0,00221 | p = 0,09836 |
Tablo 2'de. Verim ve saflık karşılaştırılması (iki kuyruklu, Eşleştirilmiş t-testi).
Hücre Hızı genotiplendirmesi | ||
Örnekleri | P100 | EDTA |
1 | 97.9 | 97.5 |
2 | 97.9 | 97.8 |
4 | 97.4 | 97.5 |
7 | 97.5 | 98.2 |
8 | 97.9 | 98 |
P değeri | p = 0,67970 |
Tablo 3. Genotiplendirmesi arama oranı (iki kuyruklu, Eşleştirilmiş t-testi).
Örnekleri | Katmanlar | Verim (mikrogram) | Oranı (260/280) |
Buffy kat | 150 | 1.86 | |
RBC | 4.13 | 1.73 | |
P100_07 | Buffy kat | 139 | 1.74 |
RBC | 1.00 | 1.70 | |
P100_08 | Buffy kat | 118 | 1.87 |
RBC | 3.72 | 1.78 | |
P100_09 | Buffy kat | 51 | 1.87 |
RBC | 0.23 | 0.98 |
Ek. Kırmızı kan hücreleri (RBC) tabakasında bulunan DNA miktarının değerlendirilmesi.
Birçok insan hastalıkları genetik nedenleri ve insan hastalığın genetik temeli keşfetmek giderek artan kaliteli DNA gerektirir. Genetik çalışmalar kullanılan DNA'nın en yaygın kaynağı tam kan antikoagüle edilir. En klinik laboratuvarlar fenotipik sonuç soruşturma bir ilk adım olarak, biyokimyasal serolojik ve viral test gerçekleştirmek için, kan genellikle plazma tüp toplanır. Plazma toplama sonra, sıkıştırılmış kan genellikle atılır. Bu nedenle, DNA genetik çalışmalar veya test yapmak için gerektiğinde, ek bir kan beraberlik aynı hastadan gereklidir. Bu beyaz kan hücreleri içeren olarak atılır sıkıştırılmış kan DNA potansiyel bir kaynağıdır. Bu nedenle, plazma tüpler sıkıştırılmış kan kullanarak fazla kan çekmek veya ek kan için hasta hatırlamak gerek kalmadan, daha verimli alınan kan örneği kullanmak için bir fırsat sunuyor.
Eski için çeşitli yöntemlersıkıştırılmış ya da pıhtılaşmış kan akyuvar ikinci yolu DNA 6-10 bildirilmiştir. Bu yöntemlerin zorlukları çoğu plazma toplama tüp tasarımı ile ilişkili bulunmuştur. Daha önce plazma toplama tüpleri santrifüj zaman, plazma (ayırıcı üstünde), kan hücreleri (ayırıcı aşağıda tuzak) ayırmak için bir bariyer oluşturduğu, bir jel (jel ayırıcı) yapılmış bir ayırıcı içeriyordu. Jel malzeme ile kan hücrelerinin kirlenmesini önlemek için, ayırıcı ilk dikkatle tüp 11 uzaklaştırılmalıdır. Bu verimli DNA izolasyonu garanti altına almak için kan pıhtısı bir parçalanma takip eder. Parçalama işlemi genellikle kan örneğinin önemli bir kayıp ve DNA veriminde bir düşüşe neden olur. Örnek kaybını en aza indirmek ve sürecini iyileştirmek için, küçük gözenek örgü mekanik küçük parçalar 12 içine kan pıhtısı dağınık için kullanılır, ama parçalanma hala etkilenen DNA verim ve kalite ve e olduven teknisyen 13 bir sağlık tehlikesi oluşturmaktadır.
BD biyobilim gelen BD P100 tüpler çok merkezli immünolojik araştırma 14 değerlendirilmiştir plazma toplama tüpleri en son kuşak vardır. Önceki plazma tüpler gibi, plazma proteinleri stabilize etmek ve proteaz inhibitörleri koagülasyon önlemek için antikoagülan içerir. BD P100 tüpün en büyük yenilik, her tüp içindeki mekanik ayırıcı (bir jel ayırıcı) içinde bulunur. Mekanik ayırma da santrifüj işleminden sonra, plazma ve hücre pelletini arasında fiziksel bir bariyer sağlar, ancak jel ayırıcı farklı olarak, bir jel, örnek kirlenme riski vardır. Bu çalışmada kullanılan protokol, bir parçalanma dahil değildir, bu nedenle herhangi bir sağlık tehlikesi riski yoktur.
DNA (DNA ekstraksiyon bakınız), ticari bir kit protokolü kullanarak, buffy coat elde edildi. BD P100 tüpler içinde sıkıştırılmış kan cryop idiDNA ekstraksiyon öncesinde 3-4 aylık bir süre için ayrılmıştır. EDTA tüpleri (EDTA_DNA) elde edilen DNA bunlara karşılık gelen P100_DNA verimi ve kalite değerlendirilmesinde bir kontrol olarak kullanılmıştır. Daha önceki çalışmalarda 12,13,15 itibaren, EDTA_DNA örneklerin verim önceki plazma tüplerin kandan DNA göre anlamlı olarak yüksek bulundu. Bu çalışmada, her bir hastadan toplanan aynı miktarda tam kan, kan sıkıştırılmış buffy coat az DNA (Tablo 2, p = 0,00221) elde edilmiştir. (Bkz. ek yeni P100 plazma tüplerine kan DNA ekstraksiyonu sırasında, buffy kıyıdan bazı beyaz kan hücreleri, alyuvar hücresi tabakasına kaybolur (aşağıya), ancak, buffy coat elde edilenlere kıyasla DNA önemsiz bir miktarını temsil eder tablo). EDTA_DNAs görülen verim değişimi de P100_DNA bağımlı örnek olduğunu düşündüren ile taklit edilir. Yüksek hacimli numuneler normalde daha fazla DNA ve örnekleri doğuracakdüşük ses ve / veya hafif bozulmuş DNA ile daha az DNA doğuracak.
Agaroz jel (Şekil 2) Analizleri EDTA_DNAs bunlara karşılık gelen P100_DNAs görülmeyen bozulma belirtileri (smear) göstermek olduğunu ortaya koydu. Özellikle, düşük verim iki EDTA_DNA örnekleri (EDTA_01053 ve EDTA_06030) diğerlerine göre daha fazla yayma göstermektedir. Yaptıkları çalışmada, Wong ve ark. 11 artan depolama süresi azalmıştır DNA verim bildirdi. Bizim depo tüm kan örnekleri aynı depolama durumuna tabi tutuldu ve bu çalışmada kullanılan örnek alt rastgele seçilen bu yana, depolama uzunluğu ve durumu P100_DNAs ve EDTA_DNAs arasındaki agaroz jel üzerinde görülen farklılıkların hesaba olası değildir. Sadece EDTA_DNAs gösterisi bozulması EDTA tüplerde proteaz inhibitörlerinin eksikliği ile ilişkili olabilir olması.
P100_DNAs ve EDTA_DNAs saflığını anlamlı olarak farklı değildi ( Tablo 2, p = 0,09836). Bu kaliteli DNA verimli rutin bir ticari kit kullanılarak P100 plazma tüpler elde edilebilir olduğunu göstermektedir. Biraz bozulmuş EDTA_DNA örnekleri de bu saflık düşündüren, iyi saflık göstermek gerçeği DNA örneği bütünlüğünün iyi bir ölçü değildir.
Kullanılan örnekler enflamatuvar bağırsak hastalığı genetik çalışmalar için seçilmiştir. Bu nedenle, çıkarılan DNA örnekleri performansını karşılaştırmak için, immunochip 5 genotiplendirme test platformu olarak seçildi. Immunochip immünogenetik 16,17 için iyi bir eşleme genotiplendirme platform olarak kullanılmıştır. SNP genotipleme tahlillerin genom DNA doğası performans sıkı bir ölçüsü olarak kullanılmıştır. Tüm DNA testi ve HapMap kontrol örnekleri için ortalama genotiplendirme arama oranları, tüm fişleri arasında, kan alma tüpleri hem de DNA karşılaştırılabilir mükemmel performans gösteren, sırasıyla 97.76% ve 97.4% idi ( Tablo 3, p = 0,67970).
Sonuç
DNA plazma proteomik çalışmaları için çizilmiş aynı kan numunesinden genomik test kolaylaştırmak BD P100 borular, sıkıştırılmış kandan izole edilebilir. Sonuçlarımız P100 tüp araştırma programı uzatmak. P100 toplanan kan hücresel içeriği DNA genomik analizler için kullanılabilir olması proteomik ve genomik hem analizleri yapılacak olan çalışmalar için örnek toplama basitleştirmeye yardımcı olabilir. Bu nedenle, daha az kan her insan konudan gereklidir ve çalışma sponsorlar ve personel için ilişkili bir maliyet ve çaba tasarruf artırıldı. Göstermiştir çeşitli avantajları vardır:
Çıkar çatışması ilan etti.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 | |
EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Paper clip | Office product | ||
15 ml tube | Corning | 430052 | |
Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
Bead array reader | Illumina | NA | |
GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır