طريقة عملية ومبتكرة لاستخراج الحمض النووي الجينوم من الدم أطقم مجموعة لحفظ البلازما بروتين

نحن تصف طريقة جديدة لعزل الحمض النووي الجيني من الدم الكامل التي جمعت لبلازما / الأمصال. بعد جمع البلازما، ويتم عادة تجاهل الدم المضغوط. يمثل طريقة لدينا رواية تحسنا كبيرا خلال الأساليب القائمة ويجعل الحمض النووي والبلازما المتاحة من مجموعة واحدة، دون طلب دم إضافية.

الاختبارات المعملية يمكن القيام به على الأجزاء الخلوية أو السوائل من الدم. استخدام مختلف أنابيب جمع الدم يحدد جزء من الدم الذي يمكن تحليلها (الدم الكامل، البلازما أو مصل). مختبرات تشارك في دراسة الأساس الجيني للاضطرابات الإنسان تعتمد على الدم الكامل anticoagulated جمعها في vacutainer المحتوية على EDTA-كمصدر من الحمض النووي للتحليل الجيني / الجيني. لأن معظم المختبرات السريرية أداء الكيمياء الحيوية، وإجراء اختبارات مصلية والفيروسية كخطوة أولى في تحقيق نتائج المظهري، ويتم جمع الدم anticoagulated أيضا في أنبوب يحتوي على الهيبارين-(أنبوب البلازما). لذلك عندما تكون هناك حاجة الحمض النووي والبلازما للتحليلات متزامنة ومتوازية من البيانات على حد سواء الجينومية والبروتين، فمن المعتاد أن جمع الدم في كل من EDTA والأنابيب الهيبارين. إذا يمكن جمع الدم في أنبوب واحد، ويكون بمثابة مصدر لكلا البلازما والحمض النووي، وستنظر هذه الطريقة على التقدم إلى المنهجيات القائمةالمواد المستنفدة للأوزون. استخدام الدم المضغوط بعد استخراج البلازما يمثل مصدرا بديلا للالحمض النووي الجيني، وبالتالي التقليل من كمية عينات الدم معالجتها والحد من عدد العينات المطلوبة من كل مريض. وهذا من شأنه في النهاية توفير الوقت والموارد.

تم إنشاء نظام لجمع الدم P100 دينار بحريني لحفظ بروتين البلازما كما تحسن أسلوب أكثر من بلازما السابقة أو جمع المصل أنابيب ^1، لتحقيق الاستقرار في محتوى البروتين من الدم، وتحسين واكتشاف العلامات البيولوجية البروتين والبروتينات التجريب من الدم البشري. وBD P100 أنابيب تحتوي على 15.8 مل من K2EDTA مجففة والملكية كوكتيل طيف واسع مجفف بالتجميد من مثبطات الأنزيم البروتيني لمنع تجلط الدم والعمل على استقرار بروتينات البلازما. وهي تشمل أيضا فاصل الميكانيكية، الذي يوفر حاجز مادي بين البلازما والكريات الخلية بعد الطرد المركزي. وقد وضعت عدد قليل من الطرق لاستخراج الحمض النووي من الدم المتجلط SAmples جمعها في أنابيب البلازما القديمة ^2-4. وارتبطت التحديات من هذه الأساليب أساسا مع نوع من الفاصل داخل الأنابيب (هلام الفاصل) وشملت صعوبة في استرداد الدم المتجلط، وإزعاج من تفتيت أو تشتيت كلوت، وعرقلة استخراج كلوت بواسطة الجل الفصل.

نقدم الأسلوب الأول الذي يستخرج وينقي الحمض النووي الجيني من الدم تعادل في BD أنابيب P100 جديدة. قارنا نوعية عينة من الحمض النووي من P100 إلى أن أنابيب من أنابيب EDTA. نهجنا هو بسيطة وفعالة. أنها تنطوي على أربع خطوات رئيسية كما يلي: 1) استخدام BD P100 البلازما (تشخيص BD، سباركس، MD، الولايات المتحدة الأمريكية) أنبوب مع فاصل الميكانيكية لجمع الدم، 2) إزالة الفاصل الميكانيكية باستخدام مزيج من السكروز وعلى العقيمة هوك مشبك معدني، 3) الفصل بين طبقة معطف الشهباء تحتوي على خلايا بيضاء و 4) عزل الحمض النووي الجيني منمعطف الشهباء باستخدام الحمض النووي تجارية عدة استخراج العادية أو بروتوكول قياسي مماثل.

1. جمع العينات

1. جمع عينات الدم من الأفراد للموافقة المسبقة عن المناسبة. لكل فرد، واستخلاص 4-5 مل من الدم في أنبوب P100 (تشخيص دينار بحريني، فرانكلين بحيرة، NY، الولايات المتحدة الأمريكية). لأغراض المقارنة، في وقت واحد جمع الدم في أنبوب EDTA.
2. وBD P100 أنابيب تحتوي على 15.8 مل K2EDTA مجففة والملكية كوكتيل طيف واسع مجفف بالتجميد من مثبطات الأنزيم البروتيني لمنع تجلط الدم والعمل على استقرار بروتينات البلازما. كما أنها تحتوي على فاصل الميكانيكية. بعد جمع الدم كله، والحفاظ على حد سواء الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة ليلة وضحاها حتى يحدث معالجة.
3. أجهزة الطرد المركزي في BD P100 أنابيب في 2،500 ز لمدة خمسة عشر دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل البلازما التي تم جمعها فوق فاصل الميكانيكية إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة.
4. تخزين P100 الأنابيب، الذي يحتوي على الدم ضغط دون فاصل، في -80 درجة مئوية حتى كنت على استعداد لبدء تحويلة DNAraction.

2.1 من دم P100 أنبوب (P100_DNA)

1. يتم تخزين أنابيب P100 في -80 درجة مئوية بعد استخراج البلازما. في غضون 3 إلى 4 أشهر، استرداد أنبوب P100 يحتوي على الدم المضغوط من الفريزر وذوبان الجليد عند 37 درجة في حمام مائي لمدة 5 دقائق (الشكل 1A). إزالة أي البلازما المتبقية التي يجلس فوق فاصل. إضافة 2 مل من 17٪ محلول السكروز (التدرج حل اختبارها في المنزل - بيانات غير منشورة) في P100 أنابيب فوق الفاصل (1B الشكل). أنابيب الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في 2،500 غرام؛ هذه العملية يدفع فاصل الميكانيكية إلى الأعلى من الأنبوب وينتج ثلاث طبقات من حل بما في ذلك معطف الشهباء (الشكل 1C). استخراج فاصل باستخدام مشبك معدني steriled الجزاء (1D الشكل) يدويا.
2. بعد استرداد الفاصل الميكانيكية من كل أنبوب (1D الشكل)، وإزالة وdiscarد طبقة السكروز أعلى. نقل الطبقة الوسطى، التي تمثل طبقة معطف الشهباء (BC)، في العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة الفوسفات عازلة المالحة (PBS) لزيادة حجم معطف الشهباء إلى 3 مل. استخراج الحمض النووي من معطف الشهباء باستخدام الكواشف من QIAGEN Puregene كيت الدم وفقا لتوصية الشركة الصانعة؛ باستثناء سرعة الطرد المركزي من 2،500 غرام (بدلا من 2،000 ز).
3. لليز وإزالة خلايا الدم الحمراء (RBC)، إضافة 9 مل من تحلل RBC إلى 3 مل من معطف الشهباء. عكس كل أنبوب عدة مرات، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة مع قلب في بعض الأحيان أثناء الحضانة. تدور كل الخليط إلى أسفل في 2،500 ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. علاج بيليه المتبقية في كل أنبوب مع 3 مل من محلول تحلل الخلايا ودوامة لمدة 15 ثانية. علاج المحللة مع 1 مل من البروتين حل هطول الأمطار ودوامة لمدة 15 ثانية.
4. أجهزة الطرد المركزي في 2،500 ز لمدة 5 دقائق ونقل طاف في أنبوب جديد 15 مل المخروطية التي تحتوي على3 مل من 100٪ الأيزوبروبانول. عكس أنابيب جديدة 10 مرات والطرد المركزي في 2500 ز لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف وإضافة 1 مل من الايثانول 70٪. عكس أنابيب مخروطية عدة مرات لطرد وغسل بيليه الحمض النووي. الطرد المركزي في 2،500 ز لمدة 1 دقيقة. تسمح بيليه لتجف لمدة 3 دقائق (وضع أنبوب رأسا على عقب) في درجة حرارة الغرفة ثم وقف الحمض النووي مع 250 مل من محلول معالجة الجفاف عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ونقل إلى ما قبل المسمى 1.7 مل microtube. تخزين الأنابيب في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2.2 من الدم من EDTA Ttube (EDTA_DNA)

1. يتم جمع الدم الكامل للاختبار الروتيني الدمويات المناعية في أنابيب بلاستيكية vaccutainer رذاذ المغلفة مع 10.8 ملغ من K ₂ EDTA وتخزينها في -80 درجة مئوية. لأن لا تحتوي على أنابيب فاصل الميكانيكية، لا يشمل استخراج الحمض النووي الخطوات التي تنطوي على فاصل الميكانيكية (2.1.1 و 2.1.2).
2. في غضون 3 إلى 4 أشهر من تخزين الدم، وDNA يتم استخراج باستخدام الرفراف فليكس (الحرارية فيشر العلمية، التايم، MA، الولايات المتحدة الأمريكية). وهو نظام استخراج الحمض النووي الأتمتة القائمة على التكنولوجيا الجسيمات المغناطيسية ويتكون من خلية تحلل / الحمض النووي ملزم، عدة خطوات غسل وشطف الحمض النووي.
3. عدة تستخدم في استخراج الحمض النووي هو الرفراف فليكس 24 DNA الدم مجموعة (QIAGEN، ألمانيا).

3. الحمض النووي الكمية وتقييم الجودة

تم تقييم كمية ونوعية وسلامة الحمض النووي الجيني من خلال مزيج من الأسلوب الذي يشمل picogreen، والتحليل الطيفي الكهربي.

1. يتم تحديد تركيز الحمض النووي الجيني عن طريق القياس الكمي معمل NanoDrop وpicogreen.
2. يتم تحديد نقاء من قياس 260/280 نسبة على معمل NanoDrop.
3. يتم تحميل العينة (500 نانوغرام) أيضا على 1٪ الاغاروز هلام لتقييم سلامة (تدهور) من الحمض النووي.

4. Genotypinز فحوصات وضبط الجودة

1. خمسة P100_DNA والعينات الخاصة EDTA_DNA المقابلة يتم اختيارهم عشوائيا لمزيد من التحليل باستخدام Immunochip مخصص (المناعية تحليل الحمض النووي BeadChip). Immunochip هو رقاقة التنميط الجيني Infinium تحتوي على 196524 الأشكال وتم تصميمها لإجراء دراسات مستمنع ^5.
2. لكل عينة، يتم تضخيمه 200 نانوغرام من الحمض النووي، مجزأة، عجلت ومعلق في المخزن المؤقت التهجين المناسبة.
3. يتم تهجين العينات التشويه والتحريف على Immunochips في 48 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 16 ساعة.
4. بعد التهجين، تتم معالجة Immunochips لردود الفعل ملحق قاعدة واحدة والملون.
5. ثم يتم تصويرها في immunochips باستخدام البورشيد Hiscan الخرزة قارئ مجموعة ويتم تحميل البيانات شدة حبة تطبيع في البرنامج GenomeStudio البورشيد وتحويلها إلى الأنماط الجينية. وتسمى المورثات باستخدام خوارزمية autocalling من GenomeStudio. مراقبة الجودة فيvolves استبعاد الأشكال المتعددة للتركيبات النووية المنفردة (النيوكلوتايد) مع سعر المكالمة <95٪.
6. ويستخدم سعر المكالمة SNP كمقياس لكفاءة الفحص immunochip. يتم احتسابها كنسبة مئوية من مجموع عدد فحوصات على رقاقة (196524 النيوكلوتايد المشفرة على كل رقاقة) التي تحقق كثافة إشارة كافية ونوعية لتلقي واجب التركيب الوراثي الآلي. من المتوقع أن يحقق ما لا يقل عن سعر المكالمة نفس سيطرة الحمض النووي هاب ماب المدرجة في فحص الحمض النووي immunochip جودة عالية (260/280 نسبة 1.8 أو أعلى وعدم وجود تدهور). مراقبة الجودة ينطوي على استبعاد تعدد الأشكال مع سعر المكالمة <95٪ في كل مجموعة بيانات.

تقييم الجودة وقياس تركيز الحمض النووي

وكانت غلة P100_DNAs أقل بكثير من تلك التي EDTA_DNAs (الجدولان 1 و 2). نقاء الحمض النووي التي يمثلها قيمة 260/280 النسبة مشابهة لكلا P100_DNA وEDTA_DNA عينة مجموعة (الجدولان 1 و 2). نوعية الحمض النووي هو موحدة إلى حد ما داخل كل مجموعة من عينة على الرغم من أن شهدت بعض التدهور في عينات EDTA_DNA، كما يتضح من مسحة خفيفة (الشكل 2). أظهرت EDTA_DNAs التي أظهرت أكثر علامات التدهور أيضا انخفاض تركيز الحمض النووي.

التنميط الجيني

وتمت مقارنة سعر المكالمة التنميط الجيني لكلا EDTA_DNAs وP100_DNAs. أنها حققت أسعار المكالمات مماثلة، وكانت على حد سواء مقارنة الحمض النووي السيطرة هاب ماب الداخلية (الجدول 3).

الشكل 1. بافي معطف العزلة.

الجدول 1. الحمض النووي العائد عينة (PicoGreen) ونسبة (معمل NanoDrop).

الجدول 2. مقارنة بين العائد والنقاء (ثنائي الطرف، عينة المقترنة اختبار t).

الجدول 3. سعر المكالمة التنميط الجيني (ثنائي الطرف، عينة المقترنة اختبار t).

التذييل. تقييم كمية الحمض النووي الموجودة في الخلية طبقة الدم الحمراء (RBC).

كثير من الأمراض التي تصيب الإنسان لها أسباب وراثية واستكشاف الأساس الجيني للمرض الإنسان تطالب زيادة الحمض النووي ذات جودة عالية. وanticoagulated المصدر الأكثر شيوعا من الحمض النووي المستخدمة في الدراسات الوراثية الدم الكامل. لأن معظم المختبرات السريرية أداء اختبار الكيمياء الحيوية، ومصلية، والفيروسية كخطوة أولى في تحقيق نتائج المظهري، وغالبا ما تجمع الدم في أنبوب البلازما. بعد جمع البلازما، وكثيرا ما تجاهل الدم المضغوط. لذلك، عندما تكون هناك حاجة لإجراء دراسات الحمض النووي الوراثي أو الاختبار، لا بد من وضع التعادل دم إضافية من نفس المريض. يمثل الدم المضغوط التخلص منها مصدرا محتملا من الحمض النووي لأنه يحتوي على خلايا الدم البيضاء. ولذلك، باستخدام الدم المضغوط من البلازما أنابيب يوفر فرصة لاستخدام عينة الدم التي تم جمعها بشكل أكثر كفاءة، من دون الحاجة إلى رسم فائض الدم أو يتذكر المريض للدم إضافية.

طرق مختلفة لالسابقينتم الإبلاغ عن الحمض النووي المسالك من الخلايا البيضاء من الدم المضغوط أو متخدر ^6-10. وارتبطت معظم التحديات من هذه الأساليب مع تصميم أنبوب جمع البلازما. الواردة أنابيب جمع البلازما في وقت سابق فاصل مصنوع من مادة هلامية (جل الفاصل) الذي، عندما طرد، شكلت حاجزا لفصل خلايا الدم (محاصرين تحت فاصل) من بلازما (تقع فوق الفاصل). لمنع التلوث من خلايا الدم مع مادة هلامية، يجب الفاصل الأول يمكن إزالتها بعناية من الأنبوب ^11. ويتبع هذا من قبل تجزئة تجلط الدم لضمان كفاءة استخراج الحمض النووي. عملية تجزئة غالبا ما يؤدي الى خسائر كبيرة في عينة من الدم وانخفاض في العائد الحمض النووي. لتقليل فقدان العينة وتحسين عملية، تم استخدام شبكة صغيرة من المسام إلى فرقت ميكانيكيا تجلط الدم الى قطع صغيرة ^12، ولكن لا يزال يتأثر محصول تجزئة الحمض النووي والجودة وهتشكل فين خطرا على الصحة إلى ¹³ فني.

وBD P100 أنابيب من BD العلوم البيولوجية هي أحدث جيل من أنابيب جمع البلازما تقييمها في مراكز متعددة المناعية دراسة بحثية ^14. مثل أنابيب البلازما السابقة، أنها تحتوي على مضادات التخثر لمنع تجلط الدم ومثبطات الأنزيم البروتيني لتحقيق الاستقرار في بروتينات البلازما. الابتكار الرئيسية للP100 أنبوب دينار بحريني يقيم في فاصل الميكانيكية (لا فاصل هلام) داخل كل أنبوب. يوفر الفاصل الميكانيكية أيضا حاجز مادي بين البلازما والخلايا بيليه بعد الطرد المركزي، ولكن على عكس الفاصل هلام، لا يقدم أي خطر التلوث عينة من مادة هلامية. البروتوكول يطبق في هذه الدراسة لا تتضمن تجزئة، وبالتالي لا يوجد أي خطر خطرا على الصحة.

تم استخراج الحمض النووي من معطف الشهباء، وذلك باستخدام بروتوكول عدة التجارية (انظر استخراج الحمض النووي). كان الدم المضغوط في أنابيب P100 BD cryopمحفوظة لمدة 3 إلى 4 أشهر قبل استخراج الحمض النووي. واستخدمت الحمض النووي المستخرج من EDTA أنابيب (EDTA_DNA) كعنصر تحكم في تقييم المحصول وجودة P100_DNA يناظرها. من الدراسات السابقة ^12،13،15، وكانت غلة من عينات EDTA_DNA أعلى بكثير من الحمض النووي من الدم من البلازما أنابيب السابقة. في هذه الدراسة، لنفس كمية الدم الكامل التي تم جمعها من كل مريض، أسفرت عن معطف الشهباء من الدم المضغوط أقل الحمض النووي (الجدول 2، ص = 0.00221). خلال استخراج الحمض النووي من الدم في أنابيب جديدة P100 البلازما، يتم فقدان بعض خلايا الدم البيضاء من الساحل إلى أحمر الشهباء طبقة خلايا الدم (أقل من ذلك) ولكن تمثل كمية ضئيلة من الحمض النووي مقارنة بتلك التي من معطف بافي (انظر التذييل الجدول). وتحاكي الاختلاف في العائد الذي يشهده EDTA_DNAs أيضا مع P100_DNA يوحي بأنه هو عينة التابعة. أن العينات مع ارتفاع حجم عادة تسفر عن مزيد من الحمض النووي وعيناتمع انخفاض حجم و / أو الحمض النووي المتدهورة قليلا سوف تسفر أقل الحمض النووي.

وكشفت التحليلات على agarose هلام (الشكل 2) أن EDTA_DNAs تظهر علامات تدهور (مسحة) لا ينظر في P100_DNAs يناظرها. على وجه الخصوص، واثنين من عينات EDTA_DNA (EDTA_01053 وEDTA_06030) مع أدنى العائد إظهار المزيد مسحة من غيرها. في دراستهم، حسبما ذكرت وونغ وآخرون. انخفض العائد ¹¹ الحمض النووي مع زيادة فترة التخزين. منذ تعرض جميع عينات الدم في مستودع لدينا في حالة تخزين نفس وتم اختيار عينة فرعية المستخدمة في هذه الدراسة بشكل عشوائي، وطول التخزين وحالة غير المرجح لحساب الاختلافات ينظر إليه على هلام الاغاروز بين P100_DNAs وEDTA_DNAs. حقيقة أن EDTA_DNAs فقط عرض التدهور يمكن أن تشارك فيها لعدم وجود مثبطات الأنزيم البروتيني في أنابيب EDTA.

كانت نقاء P100_DNAs وEDTA_DNAs لا تختلف كثيرا ( الجدول 2، ص = 0.09836). وهذا يدل على أن الحمض النووي ذات نوعية جيدة يمكن استخراجها بكفاءة من P100 أنابيب البلازما استخدام عدة التجارية الروتينية. حقيقة أن عينات EDTA_DNA المتدهورة قليلا تظهر أيضا نقاء جيد، مما يدل على أن الطهارة ليست مقياسا جيدا من الحمض النووي عينة النزاهة.

تم تجنيدهم العينات المستخدمة في الدراسات الجينية للمرض التهاب الامعاء. لذلك، لمقارنة أداء عينات من الحمض النووي المستخرج، تم اختيار immunochip ⁵ كمنصة اختبار التنميط الجيني. وقد استخدم immunochip كما رسم الخرائط غرامة منصة التنميط الجيني لالوراثيات المناعية ^16،17. تم استخدام الطبيعة على نطاق الجينوم من المقايسات التنميط الجيني SNP كإجراء صرامة من أداء الحمض النووي. متوسط ​​أسعار المكالمات التنميط الجيني لجميع اختبار الحمض النووي وعينات مراقبة هاب ماب، في جميع رقائق، وكانت 97.76٪ و 97.4٪ على التوالي، والتي تبين أداء ممتاز مقارنة الحمض النووي من كل من أنابيب جمع الدم ( الجدول 3، ص = 0.67970).

اختتام

الحمض النووي يمكن أن تكون معزولة من الدم المضغوط من BD P100 أنابيب، وتسهيل الاختبار الجيني من نفس عينة الدم المسحوبة لأغراض دراسات البروتينات البلازما. نتائجنا تمديد المرافق البحثية من الأنبوب P100. يمكن للحقيقة أن الحمض النووي في المحتوى الخلوي من الدم التي تم جمعها في P100 قابل للاستخدام لالتحليلات الجينية تساعد على تبسيط اكتساب عينة للدراسات التي سوف يتم تنفيذها التحليلات كلا البروتين والجينوم. ولذلك، هناك حاجة إلى أقل من الدم كل موضوع الإنسان وتحسين بتكلفة المرتبطة بها وفورات جهد لمقدمي مشروع القرار الدراسة والموظفين. هناك العديد من المزايا تظاهر:

• مطلوب أقل الدم لكل موضوع الإنسان عندما يحتاج أن يؤديها على حد سواء دراسات الجينية والبروتينات. هذه هي ذات قيمة خاصة للمرضى الذين يعانون من الحالات المرضية (مثل سرطان الدم) والتي تتطلب الحد حذرا من حجم الدم التي يمكن استخلاصها.
• فقط مطلوب أنبوب دم واحد خلال اقتناء العينة وخطوات المعالجة، وتبسيط البروتوكول بشكل عام.
• وقد ثبت وهناك عدة التجارية الروتينية كفاءة في استخراج الحمض النووي من الدم التي تم جمعها في BD P100 الأنابيب.
• يتم زيادة وفورات في التكاليف المرتبطة باستخدام وحيازة وتصنيع أنبوب واحد.

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.