Method Article
Biz DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Tahlil kinetik analiz mükellef DNA Onarım faaliyet oranları verir ve doku ve tümör lizatları veya saflaştırılmış proteinler ile DNA tamir aktivitesinin ölçümü için uyarlanabilir.
Biz baz eksizyon tamiri (BER) moleküler işaretleri kullanarak DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Substrat (işaret) bir 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) 5'end ve oligonükleotic'ten 3 'ucuna bir konjuge Dabcyl yarımına konjuge yarımı ile birlikte, tek bir baz ihtiva eden bir lezyonun deoxyoligonucleotide oluşur. BER moleküler işaret uzunluğu 43 bazlar ve sekansı kök 1,2 in halkası ve 15 baz çifti olarak 13 nükleotid ile birlikte bir kök döngülü yapısının oluşumunu teşvik etmek için tasarlanmıştır. Bu yapılandırmada, katlandığında 6-FAM yarımına Förster Rezonans enerji transferi (FRET) 3,4 yoluyla bir floresan olmayan bir şekilde Dabcyl ile söndürülmüştür. Lezyon 6-FAM parçası içeren kalan 5 baz oligonükleotid kök salınan şekilde aşağıdaki temel lezyon kaldırma ve iplik kesme konumlandırılmış. Bir serbest bırakınDNA onarım seviyesine orantılı floresans bir artış quencher (Dabcyl) sonuçları nd dekolmanı. Birden fazla toplayarak floresans değerlerinin okur, BER aktivitesinin gerçek zamanlı değerlendirmesi mümkündür. Standart kantitatif gerçek zamanlı PCR araçların kullanılması çok sayıda örnekleri arasında eşzamanlı analiz sağlar. Bu BER moleküler işaretlerinin tasarım, tek bir baz lezyonu olan, kinetik analizleri, BER ölçümü ve inhibitörü doğrulama mükellef ve doku ve tümör hücre lizatları DNA tamir aktivitesinin ölçümü için veya protein saflaştırılmış ile uyumludur. Bu moleküler işaretleri kullanarak tümör lizatları veya doku aspiratlarında BER faaliyet analizi fonksiyonel biyomarker ölçümü için geçerli olabilir. Dahası, bu niceliksel deneyi kullanılarak proteinleri ile saflaştırılmış BER aktivitesinin analizi BER inhibitörlerinin keşfi ve doğrulama için hızlı, yüksek verim bir yöntem sağlar.
1. Moleküler Beacon Tasarım
1.1 Tasarım ve moleküler işaret sipariş
Lütfen moleküler işaret tasarımı aşağıdaki düşünmek gerekir:
1.2 için moleküler işaret Tavlama
Lütfen moleküler işaret 1.3 Kalite değerlendirmesi
2. Nükleer Lysate Hazırlık
2.1 Baz Eksizyon Onarımı reaksiyon tamponu 5 hazırlığı
2.2 Hücre kültürü ve hücre izolasyonu
2.3 Nükleer lizat hazırlığı
2.4 Diyaliz, protein miktar ve aliquoting
3. Moleküler Beacon Assay
3.1 Ekipman gereksinimleri
3.2 Tamponlar ve reaktifler
3.3 Test set-up (Tablo 5)
3.4 Run testi
4. Moleküler Beacon Test Analizi
Biz bu analizleri ve hesaplamaları gerçekleştirmek için Microsoft Excel yazılımı kullanılmaktadır. Biz standart 96-biçimleri elde edilen verilere dayalı olarak kolay ve hızlı analiz ve grafik ekranlar sağlayacak kurulması şablonlar ve makrolar öneririz.
Arka Plan 4.1 Kaldırma
">4.2 Fl (Tmax) normalleştirme
Pipetleme ve farklı kuyularda floresan algılama değişkenliği gidermek için, maksimum floresans değerleri (işaret girişi ile ilişkili olduğunu) veri normalleştirmek.
4.3 Arsa
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Biz baz eksizyon tamiri (BER) moleküler işaretleri (Şekil 1) kullanarak DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Bir kez tavlanmış, sizin moleküler işaret bir kalite değerlendirme (Şekil 2) gibi bir erime eğrisi analizi (Tablo 1) performans göstermektedir. Nükleer lizatları sonra Tablo 2'de listelenmiş tampon bileşenleri kullanarak, hazırlanmış olabilir. 4 de 90 dakika boyunca 0.5 L ön-soğutulmuş diyaliz tamponu içinde lizat Dialyze ° C Tablo 3'de listelenmiştir diyaliz tamponu karşısında PIERCE Slide-A-Lyzer Diyaliz kaseti kullanılarak karıştırılarak yumuşak. Toplayınbir şırınga kullanılarak diyaliz kasetinden diyalizlenmiş nükleer protein çözüm. Diyaliz kaset içine protein enjekte önceden kullanılan farklı bir conta kullanın. Standart protokol kullanılarak diyalizlenmiş proteinin konsantrasyonunun belirlenmesi. Beklenen Nükleer lisatı konsantrasyonlarını örnekleri, Tablo 4'te gösterilmiştir. Tablo 5'te gösterildiği gibi, plaka düzeni kullanılarak, (adım 3.4) yukarıda belirtildiği gibi reaksiyona çalıştırın. Her iki hücre AP eş düzeyde var; LN428, metil pürin DNA glikozilaz (MPG) ve LN428/MPG, MPG yükselmiş ifadesi için tasarlanmış aynı hücre hattı belirlenemeyen seviyeleri ile glioma hücre hattı: İki tümör hücre lizatları temsilcisi analizi endonükleazlar 1 (APE1) 1,2. Her bir THF = tetrahidrofuran (APE1 için bir substratı) ve HX = hipoksantin BER THF Molecular İşaret (Şekil 3) ve BER Hx Molecular İşaret (Şekil 4), kullanılarak APE1 aktivitesi ve MPG faaliyeti için probed edildi(MTG için bir substratı). Son olarak, urasil glikozilaz aktivite raporlarını, biz bu sinyal çıkışı veya sinyal gücünü protein 10μg maksimumdur ve protein 0.62 mikrogram (Şekil 5) saptanamaz seviyeye düşüyor gösteren bir BER dU / A Moleküler Beacon kullanırken.
Şekil 1.. BER Moleküler İşaret genel yapısı. Gösterildiği tavlama sonra tekrar erime sonra, sırası ile tek damarlı bir molekül olarak burada kullanılan BER Molecular Beacons genel bir tasarımdır. Sekansının Koyu, Italics kısmı gövde (15 bazlar) ve altı çizili olarak sekansının kısmı loop (13 bazlar) 'dir. FAM = 5 'floresan boya 6-Carboxyfluorescein [5'end üzerine; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, Extinction Katsayısı (260 nm): 20.960; Extinction Katsayısı (absorbans max): 75.000] ve Dabcyl = 3 'söndürme ajanı Dab silindir [3'end üzerine; Abmax = 453 nm; Quenching Aralık = 425-520 nm] X = lezyon (araştırma sorusu bağlı olarak değişir) ve Y lezyon karşısında = tabanı (araştırma sorusu bağlı olarak değişir). .
Şekil 2. Temsili bir erime eğrisi (A) BER Molecular İşaret Kontrol için gösterilmiştir. Eğri eritilir ve tetrahidrofuran (THF) yarımı (B) veya Hipoksantin (Hx) yarımı (C) ihtiva eden BER Molecular Beacons. Oligonükleotid konsantrasyonu 128 nM (turuncu) mavi 0 nM (koyu mavi), 8 nM (kırmızı), 16 nM (yeşil), 32 nM (mor), 64 nM arasında değişmektedir. Adım gibi 1.3 'de tarif, tavlanmış oligonükleotidler 25 ısıtıldı ° C 95 ° C 0.5 ° C aralıklarla ve StepOnePlus sistemi her 0.5 ° C aralığında FAM floresans ölçmek için programlanmıştır.
Şekil 4. MPG substrat h çıkarılması için BER Hx Moleküler Beacon DNA glikozilaz aktivite özel kullanarak Temsilcisi veriypoxanthine (Hx) kontrolü hücre çizgisi (LN428) ve MPG aşırı ifadesi hücre çizgisi (LN428/MPG) nükleer lizatları ölçüldü. Veya BER Hx Moleküler Beacon (mavi LN428; LN428/MPG, kırmızı); Her lizat ya BER Moleküler Beacon Kontrolü (LN428/MPG, mor LN428, yeşil) kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar olarak rapor edilmiştir (A) ortalama floresan tepkisi birimleri ve (B) (Hx = hipoksantin) yukarıdaki Kısım 4'te tarif edildiği gibi normalize aynı veri.
Şekil 5. BER dU / farklı protein seviyelerinde bir Moleküler Beacon kullanırken veri Temsilcisi. Urasil kaldırılması (dU / A) için spesifik DNA glikozilaz (UNG) aktivitesi T98G hücrelerden nükleer lizatları ölçüldü. T98G lizatı 10 protein seviyeleri, 5, 2.5, 1.25 ve 0.62 g az, BER Moleküler İşaret Kontrol veya BER dU / A moleküler İşaret kullanılarak analiz edilmiştir olarak f belirtildiğiigure. Sonuçlar yukarıda Bölüm 4'te açıklandığı gibi normalleştirilmiş verilerdir.
Beacon Konsantrasyon (nM) | 0 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 |
Moleküler Beacon çalışma çözeltisi (200nm) eklendi (uL) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 |
BER reaksiyon Buffer (w / o DTT) (uL) | 25 | 24 | 23 | 21 | 17 | 9 |
Tablo 1. Bir erime eğrisi deney Düzen.
1 L Toplam | Stok Çözüm hacmi ihtiyaç | Con. Stok Çözüm | Final Con. |
HEPES-KOH | 25 mL | 1M pH7.8 | 25 mM |
KCl | 75 mL | 2 M | 150 mM |
EDTA | 1 mL | 0,5 M pH 8.0 | 0.5 mM |
Gliserin | 10 mL | N / A | % 1 |
DTT (Kullanmadan önce ekleyin) | 0,5 mL | 1 M | 0.5 mM |
H2O | 888,5 mL | N / A | N / A |
Tablo 2. BER reaksiyon tamponu.
1 L Toplam | Stok Çözüm hacmi ihtiyaç | Con. Stok Çözüm | Final Con. |
HEPES-KOH | 50 mL | 1M pH7.5 | 50 mM |
KCl | 50 mL | 2 M | 100 mM |
EDTA | 1 mL | 0,5 M pH 8.0 | 0.5 mM |
Gliserin | 200 mL | N / A | % 20 |
DTT (Kullanmadan önce ekleyin) | 1 mL | 1 M | 1 mM |
H2O | 698 ml | N / A | N / A |
Tablo 3. Diyaliz tampon.
Hücre Hattı | Protein Konsantrasyonu (mg / uL) |
LN428 | 5.34 |
LN428/MPG | 4.79 |
Tablo 4. Protein Tayini sonuçları.
Negatif Kontrol 25μL BER Tampon | (Arka Plan Kontrolü) 20μL BER Tampon 5μL Con Beacon NO lizat | (Üç kat Test) 15μL BER Tampon 5μL Con Beacon 5μL LN428 Lysate | (Üç kopya halinde Test) 15μL BER Tampon 5μL Con Beacon 5μL LN428/MPG Lysate |
Negatif Kontrol 25μL BER Tampon | (Arka Plan Kontrolü) 20μL BER Tampon 5μL THF Beacon NO lizat | (Üç kat Test) 15μL BER Tampon 5μL THF Beacon 5μL LN428 Lysate | (Üç kat Test) 15μL BER Tampon 5μL THF Beacon 5μL LN428/MPG Lysate |
Negatif Kontrol 20μL BER Tampon 5μL lizat | (Arka Plan Kontrolü) 20μL BER Tampon 5μL Hx Beacon NO lizat | (Üç kopya halinde Test) 15μL BER Tampon 5μL Hx Beacon 5μL LN428 Lysate | (Üç kat Test) 15μL BER Tampon 5μL Hx Beacon 5μL LN428/MPG Lydoyurmak |
Negatif Kontrol 20μL BER Tampon 5μL lizat |
Tablo 5. Moleküler Beacon Test set-up.
Birçok molekül ve helikaz etkinliği 6, DNA polimeraz aktivitesi 7,8, DNA ligaz aktivitesi 9, telomeraz aktivitesi 10, DNA fotolizaz aktivitesi 11 ve DNA / dahil enzimatik faaliyetleri, tespit ve ölçülmesi için dönem 'moleküler feneri' kullanarak 600 alıntılar üzerinde bulunmaktadır diğerleri arasında melez 12, RNA. Yukarıda listelenen DNA onarım faaliyetlerinin ölçümü için moleküler işaretçileri kullanımı yanı sıra, bu ve diğer BER aktivitesi 1,2,13-15 analizi için, bu prob faydalı olduğunu göstermiştir.
Biz burada tarif gerçek zamanlı BER aktivite tayini için tek bir modifiye tabanı içerir ve lezyonun karşısındaki tabanı farklı lezyonlar veya değişiklik için BER oranlarının nicel değerlendirmesi için olanak sağlar. Uygulamalar moleküler mekanik çalışmalardan inhibitörü ekranları arasında olabilir. Biz lysa karşılaştırarak BER özgünlük gösterdiMPG TES non-salgılayan hücrelerin ve kontrol sinyalleri aktivite eksikliği ile hücre ifade. Assay BER proteinleri MPG 2 ya XRCC1 1 ile ifade kusurların algılama sağlayan çok hassastır ve [lığa] küçük DNA tamir kinetik parametreleri değişiklikler ve DNA onarım inhibitörlerinin etkisini tespit etmek için yeterli olur. Çoklu kinetik oranları ve bu kinetik oranlarında herhangi bir değişikliğe önemi hesaplanan aktif onarım süresi boyunca destek okur. BER moleküler işaret testi bu nedenle DNA onarım enzimi inhibitörleri (inhibitörü ekranlar) veya tek tek nükleer bileşenlerinin rolü üzerinde çalışmaları için ekrana yüksek verimli çalışmalar için uygundur. Nükleer lizatlarının analizi BER kompleksinin tam bağlamında DNA tamir değerlendirmenin bu nedenle, aynı zamanda BER makine (örneğin, post-çevirisi tadilatları ya da mutasyonları) üzerinde dolaylı bir değişiklik veya etkiler gösteren sağlar.
protokolü, tarif edildiği gibi, yüksek tekrarlanabilir ve niceliksel sonuçların elde edilmelidir. Ancak, doğru analiz sağlamak için düşünmeye pek çok ayrıntı vardır: (1) negatif kontrollerin Arkaplan değerleri çok yüksek olabilir: Bu kötü depolama veya Oligonükleotid imalatı bağlı olabilir. Işaretleri olmadan lizatları Yüksek arka plan değerleri karıştırıcı otomatik floresans (kirlenme veya eksojen floresan proteinlerin hücresel ifadesi ile yani) gösterir. Bir floresan proteini ifade kaçınılmaz ise, muhabir boya ve floresan protein için uyarma / emisyon spektrumları üst üste olmayabilir, (2) Fl (Tmax) düşüktür: DNA konsantrasyonu verilen farklıdır. Nanodrop kullanarak, örneğin spektrofotometri ile DNA konsantrasyonu (OD 260 nm) kontrol edin. Düşük Fl (Tmax) Yüksek DNA konsantrasyonu işaretleri üzerinde yetersiz bir FAM yükleme gösterir. HPLC arıtma değiştirilmemiş DNA (yukarıya bakınız) kirlenmesini önler, (3) Tamir aktivite kötü: Fl (Tmax) değerleri iseson devir yeterli işaret giriş ve floresan tespiti gösterir, bu nükleer özü hazırlanması başarısız olduğunu öne sürebilir. Nükleer özü kalitesi çok önemlidir. Analizden önce oda sıcaklığına örneklerin bile çok kısa maruz onarım başlatır: düşük sıcaklıklarda, uzun süreli depolama -80 ° C ve (4) tamir aktivitesi eğrileri yüksek değerler de dahil olmak üzere başlatabilir işlem boyunca sağlanmalıdır. Her zaman serin tutun.
Bu son derece hassas ve kantitatif BER testi de buna göre moleküler işaretleri değiştirerek substrat özgünlüğü üzerinde çalışmaların yapılacağı, saflaştırılmış protein analizi için geçerlidir. Son olarak, tahlil biz alkilleyici ajan temozolomide 2 PARP1 inhibitörü potansiyasyonu için tümörlerin değerlendirilmesinde iddia ettikleri gibi, yanıt veya tedavi edici biyolojik olarak işlevsel bir DNA tamir uç noktaları ölçmek için bir fırsat sağlayarak, tümör ve doku lizatlarının analizi için geçerlidir.
RWS Trevigen, Inc yazarların kalanı Çıkar çatışması olduğunu açıklamak üzere bir Bilimsel danışmanıdır.
RWS Bu çalışma Pittsburgh Vakfı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) [;; CA148629 ES019498 GM087798] hibe ile desteklenmiştir. UPCI lentiviral Tesis desteği Ulusal Sağlık Enstitüleri Kanser Merkezi Destek Hibe tarafından RWS sağlanmıştır [P30 CA047904]. Destek aynı zamanda Pittsburgh Üniversitesi Farmakoloji Anabilim Dalı & DS Kimya Biyoloji tarafından sağlandı. Destek de CV Estro tarafından sağlandı.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
Potasyum Klorür | Balıkçı | P217-500 | Moleküler notu |
EDTA | Balıkçı | BP120-500 | |
Gliserin | Balıkçı | BP229-1 | Moleküler notu |
DTT | Balıkçı | BP172-5 | |
HEPES-Çözüm | Invitrogen | 15630 | |
HEPES-Tuz | Sigma | H4034-500G | |
Potasyum hidroksit | Sigma | 17-8 | |
0.22μM filtresi | Nalgene | 167-0020 | |
Slide-A-Lyzer Diyaliz Ürünler | Delmek | 66373 | MW 7000 |
Şırınga | Balıkçı | 309659 | |
Iğne | Balıkçı | 305196 | |
1.5 mL Mikrosantrifüj Tüpler | Balıkçı | 05-408-129 | Siyah |
15 ml Falcon Tüpler | Balıkçı | 352097 | |
NucBuster Protein Ekstraksiyonu Kiti | Calbiochem | 71183 | |
PBS | Invitrogen | 14190 | |
Moleküler İşaretleri | IDT | ||
BioRad Protein boya deneyi yenidenajan konsantresi | BioRad | Katalog # 500-0006 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır