Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados ​​celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons

Se describe un método para la determinación cuantitativa, medida en tiempo real de ADN glicosilasa y actividades AP endonucleasas en lisados ​​de células nucleares. El ensayo proporciona tasas de actividad ADN Reparación susceptibles de análisis cinético y es adaptable para la cuantificación de la actividad del ADN en el tejido de reparación y lisados ​​tumorales o con proteínas purificadas.

Se describe un método para la determinación cuantitativa en tiempo real, medición de ADN glycosylase y las actividades de AP endonucleasa en lisados ​​de células nucleares con base de reparación por escisión (BER) marcadores moleculares. El substrato (faro) se compone de un desoxioligonucleótido que contiene una lesión sola base con un 6-carboxifluoresceína (6-FAM) resto conjugado con el extremo 5 'y un resto Dabcyl conjugado con el extremo 3' del oligonucleótido. El faro BER molecular es de 43 bases de longitud y la secuencia está diseñado para promover la formación de una estructura de tallo-bucle con 13 nucleótidos en el bucle y 15 pares de bases en el ^1,2 vástago. Cuando se pliega en esta configuración, el resto 6-FAM se inactivó por Dabcyl de una manera no-fluorescente a través de Förster Resonancia transferencia de energía (FRET) ^3,4. La lesión está posicionado de tal manera que tras la retirada lesión base y escisión hebra el restante 5 oligonucleótido base que contiene la fracción 6-FAM se libera del tallo. Suelte unaª desprendimiento de las extintor (Dabcyl) resulta en un aumento de la fluorescencia que es proporcional al nivel de la reparación del ADN. Mediante la recopilación de varias lecturas de los valores de fluorescencia en tiempo real de evaluación de la actividad de REC es posible. El uso de la norma cuantitativa instrumentos PCR en tiempo real permite el análisis simultáneo de numerosas muestras. El diseño de estas balizas BER moleculares, con una lesión de una sola base, es susceptible de análisis cinéticos, cuantificación y validación de REC inhibidor y es adaptable para la cuantificación de la actividad de reparación de ADN en el tejido y lisados ​​de células tumorales o con proteínas purificadas. El análisis de la actividad de BER en lisados ​​tumorales o tejido aspira utilizando estos marcadores moleculares pueden ser aplicables a las mediciones de biomarcadores funcionales. Además, el análisis de la actividad de REC con las proteínas purificadas con este ensayo cuantitativo proporciona una rápida y de alto rendimiento método para el descubrimiento y la validación de los inhibidores de la BER.

1. Diseño Molecular Beacon

1.1 Diseño y ordenar su marcador molecular

El diseño de su marcador molecular debe considerar lo siguiente:

1. Tenemos buenos resultados con oligonucleótidos de ADN 43-mer. El contenido de GC debe ser> 32%. Excluir una base G en el extremo 5 '.
2. Solicitud de 6-FAM (6-carboxifluoresceína) conjugación en el extremo 5 'y Dabcyl como un 3' modificación.
3. La posición de la lesión en la base debe ser # 6 de los 5 'final.
4. La longitud del tallo o dúplex horquilla debe ser un mínimo de 15 pb.
5. La longitud del bucle recomendada es de 13 bases.
6. La estructura general de la baliza es como se muestra en la Figura 1.
7. Una vez que la secuencia y el tipo de lesión, se decidió, el oligonucleótido se puede pedir a la mayoría de las empresas de oligonucleótidos. Pedimos a nuestros oligonucleótidos de IDT y solicitar que los oligonucleótidos son purificados por HPLC y proveyendoed como un polvo o en un formato seco.

1.2 Recocido el marcador molecular

1. Disolver oligonucleótidos liofilizados de ADN en tampón de dilución Oligo (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,1 mM de EDTA) para dar una solución concentrada de archivo molecular faro de 40 m.
2. Prepare una solución de 200 millas náuticas molecular faro de trabajo de los años 40 mM solución madre Molecular Beacon con el tampón de reacción de REC (ver más abajo). Añadir la solución de 200 nM molecular faro de trabajo a un tubo estéril ml negro 1.5.
3. Incubar el tubo que contiene la solución de 200 nM marcador molecular que trabaja en un vaso grande de agua hirviendo durante 3 minutos.
4. Después de 3 minutos, retire el vaso de la fuente de calor y se incuban las balizas moleculares en el agua durante la noche para promover el recocido. El uso de aislamiento térmico de materiales, tanto más y en el vaso para frenar el proceso de enfriamiento.
5. Balizas en alícuotas estériles, negros tubos de 1,5 ml, 100 l para cada tubo.
6. Conservar a -30 ° C.

1.3 Evaluación de la calidad de su marcador molecular

1. Realizar un análisis de la curva de fusión para confirmar que las balizas moleculares BER no fluorescente hasta que se caliente, para determinar la temperatura de fusión óptima y para confirmar que cada baliza será fluorescente cuando se calienta.
2. Para cada baliza añadir el volumen indicado de la solución Beacon 200 nM molecular de trabajo y tampón de reacción de REC, como se indica en la Tabla 1, a 6 pocillos de una rápida óptico 96-pocillos (Applied Biosystems, Cat. # 4346906).
3. Utilice un instrumento PCR en tiempo real tales como la StepOnePlus (Applied Biosystems), el sistema o similar para controlar FAM-colorante de excitación durante el análisis de la curva de fusión.
4. Programa de su tiempo real instrumento de PCR (sistema StepOnePlus) para controlar la excitación FAM colorante como una función de aumento de la temperatura en pequeños incrementos para análisis de la curva de fusión. El sistema StepOnePlus está programado para medir FAM fluorescenciana y la rampa de 25 ° C a 95 ° C en 0,5 ° C intervalos. Una curva de fusión típico se muestra en la Figura 2.
5. Fluorescencia de fondo poca o ninguna debe ser visible a temperaturas inferiores a 50 ° C. Compruebe si hay un aumento uniforme y pronunciada en la fluorescencia, lo que indica la calidad de las balizas de puros y de alta. Valores de Tm alrededor de 60 ° C a 80 ° C son favorables y debe ser igual para todas las diluciones.
6. Determine T _max, la temperatura a la máxima fluorescencia [Fl (max)] los valores, a partir de este análisis. La proporcionalidad de los valores de fluorescencia a T _m T _max a la entrada del faro (la concentración) debe ser lineal. El valor de fluorescencia a T _max, Fl (max), debe superar los valores de referencia a 37 ° C por lo menos 5 veces.

2. Preparación de lisado nuclear

2.1 La escisión de base de reparación de tampón de reacción ⁵ Preparación

1. Agregar todos los componentes de la listaen la Tabla 2 y llevar el volumen del tampón a 900 ml con ddH ₂ O.
2. Ajustar el pH a 7,8 con hidróxido de potasio 8,0 N (Sigma, Cat # 17-8).
3. Llevar el volumen de la memoria intermedia a 1000 ml con ddH ₂ O.
4. Filtrar el tampón con 0,22 mM de filtro, filtro de Nalgene de 1 litro (cat # 167-0020).
5. Añadir ditiotreitol (DTT) inmediatamente antes de usar el tampón de reacción de REC.

2.2 Cultivo de células y aislamiento de células

1. Se sugiere que las células de cultivo hasta 90-100% confluentes. Aislar las células de 4-6 platos (150 mm) para obtener lisado nuclear suficiente para un conjunto completo de análisis (aproximadamente 5 x 10 ⁷ células en total).
2. Se recomienda preparar 3 culturas independientes de 3 gránulos de células independientes para obtener armas biológicas repeticiones para cada análisis.
3. Lisados ​​nucleares se preparan fácilmente usando el procedimiento de aislamiento NucBuster (Cat. EMD Bioscience Calbiochem # 71.183-3) ALTHough cualquier protocolo de aislamiento nuclear sería apropiado (véase la sección 2.3.).

2,3 preparación lisado nuclear

1. Antes de empezar, un cóctel inhibidor de la proteasa liofilizado (Calbiochem, Cat # 539131, Set 1) primero se re-suspendió en 100 l de agua estéril para preparar un stock de 100 veces. Usar inmediatamente o congelar en alícuotas a -20 ° C durante el almacenamiento a largo plazo. Calcule 1 l de la población 100 veces por cada 10 ⁷ células extraídas, según sea necesario.
2. Todos los pasos durante el procedimiento de extracción se debe realizar en hielo oa 4 ° C para garantizar la estabilidad de la proteína.
3. Etiqueta de 15 ml tubos Falcon y el lugar en el hielo.
4. Retire el medio de crecimiento de las células y lavar dos veces con 7,5 ml de PBS frío.
5. Añadir 5 ml de PBS frío a cada placa y las células raspado de la placa utilizando un levantador de células. Transferir las células a la refrigerada tubo Falcon de 15 ml.
6. Se centrifuga a baja velocidad (500x g, 4 ° C) durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadantey estimar el volumen del paquete celular en comparación. (Hasta 250 l de volumen de células empaquetadas se puede procesar en un tubo ml solo 1,5)
7. Centrifugar durante otro minuto 1 a 500x g, y eliminar el restante PBS con una pipeta. Resuspender el sedimento celular en reactivo de extracción NucBuster 1 de acuerdo con el tamaño del volumen de células empaquetadas: 150 l del reactivo de extracción NucBuster 1 por 50 l de volumen de células empaquetadas. (Alternativamente, el pellet de células pueden ser congelados rápidamente en hielo seco o con nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta el momento de proceder).
8. Después de la resuspensión, transferir lisado a un tubo ml de pre-enfriado 1,5.
9. Vortex 15 segundos a alta velocidad, se incuba en hielo durante 5 minutos, y de nuevo vórtice 15 segundos a alta velocidad.
10. Centrifugar a 13.000 xg durante 5 minutos a 4 ° C.
11. El sobrenadante contiene fracción citoplásmica. Retirar y almacenar a -80 ° C o descartar.
12. Vuelva a suspender el precipitado en una mezcla de 1 l de re-suspendido 100 veces cóctel inhibidor de la proteasa, 1 & mu, l de DTT 100 mM y 75 l de reactivo de extracción NucBuster 2 por un volumen de 50 l hematocrito.
13. Vortex 15 segundos a alta velocidad, se incuba en hielo durante 5 minutos, y segundos 15 nuevamente vórtice a alta velocidad.
14. Centrifugar a 13.000 xg durante 5 minutos a 4 ° C. El sobrenadante contiene proteínas nucleares. Recoger el sobrenadante y proceder a la siguiente etapa.

2.4 Diálisis, la cuantificación de proteínas y alícuotas

1. Todos los pasos durante el procedimiento de diálisis se debe realizar con el pre-refrigerados soluciones, materiales y equipos para garantizar la calidad del extracto.
2. Preparar tampón de diálisis (1 l requerido por muestra) como se detalla en la Tabla 3. Importante: Buffer debe estar fría (4 ° C). Se sugiere la preparación de por lo menos el día anterior. Tampón de diálisis filtrada se puede almacenar a 4 ° C indefinidamente si la TDT no se ha agregado.
3. Pre-enfriamiento (2 vasos de precipitados de 1 L vasos por muestra), tampón de diálisis, las cámaras de diálisis, micro centrífuga-tubos, jeringas y agujas.
4. Justo antes de usar - agregar 1 ml 1 M de TDT por cada litro de tampón de diálisis.
5. Dializar el lisado preparado en el paso 2.3 en 0,5 L tampón de diálisis antes de la helada durante 90 minutos a 4 ° C con agitación suave con un Slide-A-Lyzer PIERCE casete de diálisis (diálisis casetes 0,5-3 ml con 7.000 MW de corte).
6. Transferir casete de diálisis a un segundo vaso de precipitados que contiene 0,5 l de pre-enfriado tampón de diálisis y diálisis lisado durante 90 minutos a 4 ° C con agitación suave.
7. Recoger la solución dializada proteína nuclear desde el cassette de diálisis utilizando una jeringa (Fisher, cat # 309659). Utilizar una junta diferente utilizado previamente para inyectar la proteína en el cassette de diálisis. Nótese que el extracto puede haber cristalizado debido a altas concentraciones de proteína. Trate de incluir nublados cristales que buscan al quitar la solución dializada proteína nuclear.
8. Alícuotas de la muestra a tubos de microcentrífuga, 20 l cada uno. Congelación rápida en hielo seco y almacenamientoe a -80 ° C hasta su uso.
9. Determinar la concentración de la proteína se dializó utilizando protocolos estándar. Ejemplos de concentraciones esperadas lisado nucleares se muestran en la Tabla 4.
10. Finalmente, lisados ​​deben ser evaluados para el control de calidad. Evaluación de los lisados ​​variará con el experimento. Como se ha descrito anteriormente, de manera rutinaria analizar lisados ​​para la expresión de proteínas a través de varias BER ^1,2 inmunoblot.
11. La etapa de diálisis se utiliza para hacer una solución de reacción uniforme a través de las líneas celulares para facilitar la comparación. Omitiendo la etapa de diálisis puede afectar las tasas de enzimáticos y análisis cinético ya que las soluciones de sal y condiciones de reacción ya no son idénticos en las diferentes líneas celulares y preparados debido a las diversas diluciones requeridas. Sin embargo, hemos observado que el uso de lisados ​​de más de 5 g / l, y la adición de tampón de reacción suficiente no permite la omisión de la etapa de diálisis (datos no presentados). Para inhibidor ª estudiosa no requieren comparación entre los lisados ​​de células diferentes, la diálisis puede no ser necesaria. Sin embargo, se recomienda diálisis como se indica.

3. Ensayo Molecular Beacon

3.1 Requisitos del equipo

1. Un cuantitativos PCR en tiempo real del instrumento, tales como StepOnePlus QRT-PCR o comparables, o un fluorómetro placa de 96 pocillos capaz de detectar y medir la fluorescencia FAM en tiempo real. Nota: Este procedimiento es aplicable a cualquier máquina capaz de leer los valores de fluorescencia de las balizas y grabar en tiempo real. La máquina debe, sin embargo, que el usuario pueda acceder a los valores brutos de fluorescencia para el análisis de datos.
2. Centrifugar compatible con ópticas QRT-PCR tubos o placas que se utilizan.
3. Microsoft Excel para analizar los datos recogidos.

3.2 Los tampones y reactivos

1. Ópticos QRT-PCR tubos o placas con tapas correspondientes.
2. BER tampón de reacción (verBove y Tabla 2).
3. Proteína nuclear dializada extrae como se preparó en los pasos 2.3 y 2.4 y se diluyó a 2 g / l de proteína con tampón de reacción que contiene DTT BER.
4. Balizas Molecular diluyó a 200 micras con tampón de reacción de BER para crear la solución Beacons molecular de trabajo (ver arriba).

3.3 Ensayo de puesta en marcha (Tabla 5)

1. La máquina de QRT-PCR no se utiliza normalmente como un fluorímetro de modo que el método de ejecución debe ser cambiado.
   1. Programa de una primera etapa y establecer la temperatura de reacción a 37 ° C con un tiempo de ciclo (puntos de tiempo para las mediciones) de 20 segundos con un mínimo de 180 ciclos (o más, dependiendo del diseño del ensayo de reparación). Asegúrese de recoger datos durante los ciclos. Por lo tanto, la máquina se recogen datos cada 20 seg para un total de 1 h.
   2. Crear una segunda etapa que las rampas de la temperatura a Tmax de la baliza particular, la temperatura máxima con fluorescencia, como disuadirextraído en el paso 1.3 (evaluación de la calidad de su marcador molecular). El tiempo de ciclo de nuevo debe ser de 20 segundos con un total de 15 ciclos. Este recogerá los datos cada 20 segundos durante 5 minutos a la fluorescencia máxima posible de la baliza. Los valores de fluorescencia medidos durante los ciclos de Tmax se utiliza para normalizar los valores de fluorescencia en cada pocillo (paso 4.2a). Si utiliza varias balizas diferentes, asegúrese de incluir medidas que proporcionan valores similares y repetitivos de la Tmax de los faros también.
   3. Ajuste el volumen de reacción de 25 l.
2. Puesta en marcha del diseño de la placa en la máquina de QRT-PCR utilizando el software de Applied Biosystems. Sólo estamos interesados ​​en los valores de fluorescencia primas, así que seleccione la "curva estándar" - tipo de experimento.
3. Completar el diseño de la placa. Un ejemplo se muestra en la Tabla 5. No aportan nada a los pozos seleccionados, como la curva estándar.

3.4 se realiza la prueba

1. Diablilloortante: Uso de pre-enfriado material y soluciones. Mantener en lugar fresco hasta el funcionamiento y la detección.
2. Añadir la cantidad apropiada de DTT al tampón de reacción de BER para ser utilizado.
3. Diluir solución de proteína a una concentración de 2 g / l usando tampón de reacción BER (con DTT).
4. Para los experimentos iniciales, se aconseja utilizar 10 mg de lisado nuclear de dializado por pozo (5 l / pocillo) y 1 pmol de sustrato, el marcador molecular a una concentración final de 40 nM (5 l / pocillo). Hemos obtenido consistentemente alta calidad y resultados reproducibles con 10 g de lisado de células, aunque es posible que lisados ​​celulares diferentes o sustratos de balizas pueden dictar mayores o menores concentraciones de proteína.
   1. Los componentes del ensayo en cada pocillo de amortiguación son de 15 l de reacción de REC, 5 y 5 l faro de lisado nuclear l. Ejecutar cada combinación de faro / lisado por triplicado.
   2. Varios controles negativos se requieren para cada faro, incluidas las muestras, sin transmisor como el 25 ymu; l de tampón de reacción BER solamente, y 20 l tampón de reacción de REC con 5 l de lisado y 20 l de tampón de reacción de REC con 5 l de faro sin lisado.
   3. Varias muestras de control se requieren para cada lisado nuclear. Estos incluyen un control negativo [15 l tampón de reacción de REC, 5 balizas de control de l (sin lesión) y 5 lisado de muestra l]. También sugiere incluir controles positivos experimentales tales como la inclusión de THF que contiene las balizas que imitan abasic sitio contiene oligos y son fácilmente incisión [15 l tampón de reacción de REC, 5 l faro de THF y 5 ml de muestra lisado]. Por supuesto, el control positivo precisa dependerá del diseño experimental general.
5. Como un ejemplo, siga la Tabla 5 a continuación para la disposición de la placa.
6. Pipetear en tubos o placas ópticas, mientras que en el hielo o soporte refrigerado para minimizar la iniciación de reacción antes de la detección de la señal.
7. BER Pipetear primera reacción en todos los pocillos de amortiguamiento.
8. La balizas n pipeta de acuerdo con la disposición de la placa en los pozos correctos y pipeta siempre lisados ​​pasado en los pozos para minimizar inicio de la reacción antes de la detección de la señal.
9. Seal tubos o la placa a fondo, mezclar y girar con una centrífuga para recoger soluciones a la parte inferior de los tubos o la placa
10. Inserte la placa en la QRT-PCR de la máquina y comenzar a ensayo.
11. Después de la terminación, exportar los datos en bruto, preferentemente en formato Excel. Para el sistema StepOnePlus sólo los datos de múltiples componentes son necesarios. Este contiene todos los valores de fluorescencia en la cantidad de lecturas, ordenados por color de tinte y bien.

4. Análisis Molecular Beacon Ensayo

Se utilizó el software de Microsoft Excel para realizar estos análisis y los cálculos. Se recomienda el establecimiento de plantillas y macros que permitan el análisis rápido y fácil y muestra gráfica basada en datos derivados de los formatos estándar de 96 pocillos.

4.1 Eliminación de Antecedentes

4.2 Fl (Tmax) la normalización

Para hacer frente a la variabilidad de la pipeta y detección por fluorescencia en diferentes pozos, que la normalización de los datos a los valores máximos de fluorescencia (que se correlacionan con la entrada de la baliza).

1. Calcular los valores medios de fluorescencia de los ciclos de T _max para el bienestar individual: Fl (T _max) (paso 3.3aii).
2. Calcular la relación Fl (x ciclo) / Fl (T _max) y se multiplica por 100. Bajo el supuesto probable que Fl (T _max) corresponde a la máxima posible valor de fluorescencia cuando está totalmente incisión, estos datos normalizados representan% gratuita FAM (% = faro BER incisa).
3. Combine las muestras por triplicado el promedio de los datos (% gratis FAM) de los 3 pozos para cada ciclo (hasta el ciclo de 180) y calcular los errores en cada uno.
4. Calcular veces multiplicando 20 segundos para cada ciclo.
5. Dado que la varianza bien a bien en la detección de fluorescencia puede ser significativo, se recomienda añadir un colorante fluorescente como ROX a la población molecular faro que sirve como estándar para volver a ajustar los valores de fluorescencia de los pozos individuales. En este caso, el tinte ROX sería utilizado como un estándar interno (referencia pasivo) en cada solo pozo. ROXespectros de excitación y de emisión (excitación - 588 nm, emisión 608 nm) es distinta de la del colorante 6-FAM empleada en el ensayo (excitación - 495 nm, emisión - 520 nm). El tinte ROX permitiría una normalización paso similar a convencionales de RT-PCR procedimientos que permite la normalización de bien-a-así diferencias que pueden ocurrir debido a los artefactos. Estos pueden resultar de errores de pipeteo o pueden proceder de bien a bien la variación en la eficiencia de detección de fluorescencia.

4.3 Terreno

1. Parcela normalizaron los datos de fluorescencia (% gratis FAM) contra el tiempo (en segundos) en un gráfico de dispersión con los errores correspondientes.
2. Se recomienda analizar la cinética de reparación en al menos tres diferentes preparaciones lisado nucleares que representan repeticiones biológica. Para evaluar la variación, entre los errores experimentales, calculados a partir de los promedios de cada experimento se debe mostrar.
3. Un análisis representativo de dos lisados ​​de células tumorales: LN428, un gliomalínea de células con niveles indetectables de ADN glycosylase metil purina (MPG) y LN428/MPG, la misma línea celular diseñado para la expresión elevada de MPG, ambas líneas celulares tienen un nivel equivalente de AP endonucleasa 1 (APE1) ^1,2. Cada se probaron para APE1 actividad y actividad MPG utilizando el BER THF molecular faro (Figura 3) y el BER Hx molecular faro (Figura 4), ​​donde THF = tetrahidrofurano (un sustrato para APE1) y Hx = hipoxantina (un sustrato para MPG) . Nota: En la Figura 3 (sustrato THF), los resultados de los lisados ​​LN428/MPG muestran una menor fluorescencia máxima absoluta en comparación con los LN428 lisados. Este es el resultado de un valor inferior faro de entrada como se determina utilizando valores Tmax (ver 3.3a). Cuando este valor inferior se utiliza para normalizar los resultados, se produce un gran cambio en la trama. Esto ilustra muy bien la importancia de normalizar los datos. Representación de los valores de fluorescencia absolutos por sí solo sugieren la repatriacióntasas de IR entre LN428 y células LN428/MPG son diferentes. Sin embargo, cuando los datos se normalizaron a considerar la variabilidad bien a bien, la diferencia de reparación APE1 mediada tipo se demuestra que es mínima.

5. Los resultados representativos

Se describe un método para la determinación cuantitativa en tiempo real, medición de ADN glycosylase y las actividades de AP endonucleasa en lisados ​​de células nucleares con base de reparación por escisión (BER) marcadores moleculares (Figura 1). Una vez recocido, le sugerimos realizar un análisis de la curva de fusión (Tabla 1) como una evaluación de la calidad de su marcador molecular (Figura 2). Lisados ​​nucleares puede entonces ser preparada, usando los componentes del tampón listados en la Tabla 2. Dializar el lisado en 0,5 L tampón de diálisis pre-enfriada durante 90 minutos a 4 ° C con agitación suave utilizando un casete PIERCE Slide-A-Lyzer diálisis contra el tampón de diálisis enumeran en la Tabla 3. Recoger elsolución dializada proteína nuclear desde el cassette de diálisis utilizando una jeringa. Utilizar una junta diferente utilizado previamente para inyectar la proteína en el cassette de diálisis. Determinar la concentración de la proteína se dializó utilizando protocolos estándar. Ejemplos de concentraciones esperadas lisado nucleares se muestran en la Tabla 4. Ejecutar la reacción como se ha indicado anteriormente (paso 3,4), utilizando la disposición de la placa como se muestra en la Tabla 5. Un análisis representativo de dos lisados ​​de células tumorales: LN428, una línea de células de glioma con niveles indetectables de metil-purina del ADN glycosylase (MPG) y LN428/MPG, la misma línea celular diseñado para la expresión elevada de MPG, ambas líneas celulares tienen un nivel equivalente de AP endonucleasa 1 (APE1) ^1,2. Cada se probaron para APE1 actividad y actividad MPG utilizando el BER THF molecular faro (Figura 3) y el BER Hx molecular faro (Figura 4), ​​donde THF = tetrahidrofurano (un sustrato para APE1) y Hx = hipoxantina(Un sustrato para MPG). Por último, con un BER dU / Un marcador molecular que los informes sobre la actividad uracilo glycosylase, nos muestran que la señal de salida o de intensidad de la señal es máxima a 10μg de proteínas y disminuye a un nivel indetectable en 0,62 g de proteína (Figura 5).

Figura 1. Estructura general de la baliza BER molecular. Se muestra la secuencia y el diseño global de los faros BER moleculares utilizados aquí como una molécula de cadena simple, después del recocido y de nuevo después de la fusión. La parte en negrita, cursiva de la secuencia es la madre (15 bases) y la parte subrayada de la secuencia es el bucle (13 bases). FAM = 5 'tinte fluorescente 6-carboxifluoresceína [en el extremo 5'; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, coeficiente de extinción (260 nm): 20.960; coeficiente de extinción (a una absorbancia máxima): 75.000] y Dabcyl = el apagado 3 'agente de Dab cil [en el extremo 3 '; Abmax = 453 nm; enfriamiento Rango = 425-520 nm] X = la lesión (varía en función de la pregunta de investigación) y Y = la base frente a la lesión (varía en función de la pregunta de investigación). .

Figura 2. Fundir la curva. Una curva de fusión representativo se muestra para el control de Beacon BER molecular (A), y las balizas BER moleculares que contienen el tetrahidrofurano (THF) fracción (B) o la hipoxantina (Hx) radical (C). Concentraciones de oligonucleótidos osciló entre 0 nM (azul oscuro), 8 nm (rojo), 16 nm (verde), 32 nM (púrpura), 64 nm a 128 nm de color azul (color naranja). Como se describe en el Paso 1,3, los oligonucleótidos reasociados se calentaron desde 25 ° C a 95 ° C en 0,5 ° C intervalos y el sistema StepOnePlus está programado para medir FAM fluorescencia en cada intervalo de 0,5 ° C.

Figura 4. Los datos representativos utilizando el BER Hx Molecular Beacon ADN glycosylase actividad específica para la eliminación de la MPG sustrato hypoxanthine (Hx) se midió en lisados ​​nucleares de la línea celular de control (LN428) y el MPG sobre-expresión línea celular (LN428/MPG). Cada lisado fue analizada utilizando el control de REC marcador molecular (LN428, verde; LN428/MPG, morado) o el BER Hx Molecular Beacon (LN428, azul; LN428/MPG, rojo). Los resultados se presentan como (A) de las unidades medias de fluorescencia de respuesta y (B) los mismos datos normalizado según lo descrito en la Sección 4 (Hx = hipoxantina).

Figura 5. Los datos representativos utilizando el dU REC / Un marcador molecular en los niveles de proteína diferente. ADN glicosilasa (UNG) actividad específica para la eliminación de uracilo (dU / A) se midió en lisados ​​nucleares de células T98G. El lisado T98G se analizó utilizando el control de REC baliza molecular o la dU REC / Un marcador molecular, en los niveles de proteína de 10, 5, 2,5, 1,25 o 0,62 g, como se indica en la figura. Los resultados son de datos normalizado según lo descrito en la Sección 4.

Tabla 1. Diseño de un experimento de curva de fusión.

Tabla 2. BER tampón de reacción.

Tabla 3. La diálisis de amortiguación.

Tabla 4. Resultados de determinación de la proteína.

Tabla 5. Ensayo Molecular Beacon puesta a punto.

Hay más de 600 citas con "marcador molecular" el término para la detección y cuantificación de numerosas moléculas y las actividades enzimáticas, incluyendo la actividad helicasa ^6, la actividad de ADN polimerasa ^7,8, el ADN ligase de la actividad ^9, actividad de la telomerasa ^10, la actividad del ADN y el ADN fotoliasa ¹¹ / RNA híbridos ^12, entre muchos otros. Además de la utilización de marcadores moleculares para la medición de las actividades de reparación del ADN antes mencionados, y otros han demostrado la utilidad de estas sondas para el análisis de la actividad de REC ^1,2,13-15.

El ensayo de REC en tiempo real la actividad se describe en este documento incorpora una única base modificada y permite la evaluación cuantitativa de las tasas de BER para diferentes lesiones o alteraciones en la base frente a la lesión. Las aplicaciones pueden ir desde estudios sobre los mecanismos moleculares a las pantallas de inhibidores. Hemos demostrado la especificidad del BER mediante la comparación de Lysates de MPG que expresan las células con las células que expresan no ya la falta de actividad en las balizas de control. El ensayo es altamente sensible, permitiendo la detección de defectos en la expresión de la MPG BER ​​proteínas ² o XRCC1 ¹ y es suficiente para detectar cambios menores en los parámetros cinéticos de reparación del ADN y la eficacia de los inhibidores de reparación del ADN [manuscrito en preparación]. Varias lecturas durante todo el tiempo de reparación apoyo activo calculado las tasas de cinética y la importancia de cualquier cambio en las tasas de cinética. El ensayo de REC marcador molecular es por lo tanto conveniente para el alto rendimiento de los estudios realizados hasta la pantalla de los inhibidores de la enzima de reparación del ADN (inhibidores de pantallas) o para los estudios sobre el papel de cada uno de los componentes nucleares. El análisis de lisados ​​nucleares permite la evaluación de la reparación del ADN en el contexto completo del complejo de REC por tanto, también representa a las alteraciones o las influencias indirectas en la maquinaria de REC (por ejemplo, la traducción después de las modificaciones o mutaciones).

Laprotocolo, como se ha descrito, debe dar resultados altamente reproducibles y cuantitativos. Sin embargo, hay varios detalles a tener en cuenta para garantizar el correcto análisis: (1) Los valores de fondo de los controles negativos puede ser demasiado alto: Esto puede ser debido al mal almacenamiento o fabricación del oligonucleótido. Los valores altos de fondo en los lisados ​​sin balizas indican fluorescencia automática de confusión (es decir, por la contaminación o la expresión celular de las proteínas fluorescentes exógenos). Si la expresión de una proteína fluorescente es inevitable, los espectros de excitación / emisión para el reportero tinte y de la proteína fluorescente no se pueden superponer, (2) Fl (Tmáx) es baja: la concentración de ADN es diferente a la dada. Ver la concentración de ADN por espectrofotometría (OD _{260 nm),} por ejemplo, utilizando el Nanodrop. Concentración de ADN de alta con una baja Fl (Tmax) indica una insuficiente carga de la FAM en los faros. Purificación por HPLC evita la contaminación con el ADN no modificado (ver más arriba), (3) la actividad de reparación es deficiente: Si el FL (Tmax) en los valoreslos últimos ciclos indican la entrada faro suficiente y detección por fluorescencia, esto podría sugerir que la preparación de extracto nuclear no. La calidad del extracto nuclear es crucial. Las bajas temperaturas debe garantizarse durante todo el procedimiento incluso a largo plazo del almacenamiento a -80 ° C y (4) Reparación de curvas de actividad iniciar con altos valores: la exposición Incluso muy corto de las muestras a temperatura ambiente antes de su análisis inicia la reparación. Mantener fresco en todo momento.

Este ensayo BER altamente sensible y cuantitativa es también aplicable al análisis de proteínas purificadas, permitiendo estudios sobre la especificidad del sustrato mediante la alteración de las balizas molecular en consecuencia. Por último, el ensayo es aplicable a los análisis de tejido del tumor y lisados, proporcionando una oportunidad para medir variables funcionales de reparación del ADN como biomarcadores de respuesta o la eficacia terapéutica, como hemos sugerido para la evaluación de los tumores de la potenciación inhibidor PARP1 de la temozolomida agente alquilante ^2.

RWS es un Consultor Científico de Trevigen, Inc. El resto de los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Pittsburgh y los Institutos Nacionales de Salud (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] para RWS. Apoyo para el Fondo para la UPCI Lentiviral fue proporcionada a RWS por la subvención del Cáncer Centro de Soporte de los Institutos Nacionales de Salud [P30 CA047904]. También se prestó apoyo por el Departamento de la Universidad de Pittsburgh de Farmacología y Biología Química de DS. También se prestó apoyo a la CV por la ESTRO.