Drosophila melanogaster Kondisyon Eğitim Protokolü ve Boyuna Performans Tahliller

Biz, önemli bir genetik modeli türleri için ilk dayanıklılık eğitimi protokolü açıklamak Drosophila melanogaster Ve mobilite aşağıdaki eğitim gelişmeler grafik birkaç testleri özetlemektedir.

Modern tıp araştırmacıları karşılaştığı en önemli sorunlardan biri, diyabet ve ^1-3 kardiyovasküler hastalık gibi ilişkili bozukluklarda sonucu artış, obezite kabaran seviyeleridir. Bu ilişkili sağlık sorunlarının bir araştırma önemli bir konu faydalı bir müdahale olarak dayanıklılık egzersiz rolü kapsar.

Egzersiz, aşırı vücut yağ ⁴ azalma dahil olmak üzere birçok faydalı sonuçlar, pahalı olmayan, non-invazif girişim olan anti-inflamatuar ve antioksidan yanıtları ^{6, 7} ve kardiyomiyositler geliştirilmiş kasılma kapasitesini arttırmış, iskelet kası ⁵ insülin duyarlılığı arttı. Düşük yoğunluklu egzersiz önemli bir ara ^9,10 olarak transkripsiyonel koaktivatör PGC1-α ile, insanlarda, farelerde ve ⁸ mitokondriyal aktivitesi ve biyogenezi arttırdığı bilinmektedir.

Despite pek çok önemli yaşa bağlı hastalıklarla mücadele için bir araç olarak egzersiz önemini, geniş uzunlamasına genetik çalışmalar kısa ömürlü bir genetik modeli türleri için bir dayanıklılık antrenmanı protokol eksikliği engellemektedir edilmiştir. Birlikte ömrünün kısa ve ucuz bakım Drosophila ile kullanılabilir genetik araçları, çeşitli, bu genetik mekanizmalar daha fazla çalışma için cazip bir model haline getiriyor. Bu göz önüne aldığımızda biz büyük ölçekli Drosophila melanogaster ¹¹ egzersiz eğitimi için Power Tower olarak bilinen yeni bir cihaz, geliştirdik. Power Tower tekrar tekrar hızlı bir tırmanma ikna etmek için sinekler 'içgüdüsel olumsuz geotaxis davranışı kullanır. Her zaman makinesi asansörleri, keser, sineklerin platformu, sinekler tırmanmaya indüklenir. Sinekler gibi uzun makine çalıştırma veya onlar da cevap yorgun olana kadar olduğu gibi yanıt vermeye devam. Böylece, araştırmacı s sağlamak için bu makineyi kullanabiliryaştaki ve genetik olarak özdeş sinekler büyük sayılardaki imultaneous eğitim. Ayrıca, eğitim sırasında sinek kohortlarında boyuna ilerlemeyi izlemek için yararlı ilgili deneyleri açıklar.

1. Power Tower Kurulumu ve İşletilmesi

1. Güç Tower bir tabloya kelepçelenir kontrplak bir dikdörtgen parça üzerine yerleştirilir. Grainger A 4.5 rpm vites motor dört 2 "x6" panoları ve bir ¾ inç kontrplak levha üzerine oturmaktadır. Motor, bir AC / DC hız kontrol, sigorta ve bir açma-kapama düğmesi / bir kavşaktan kutuya birlikte kablolu.
2. Motoru soğutmak için çapında bir delik 3 inç kontrplak dikey ½ inç parça halinde kesilir. Bir tarafta, bir 3-inch fan kontrplak takılır, ve diğer yandan, bir 3-inch çaplı metal silindiri monte edilir.
3. Ucuna monte edilmiş bir silindir ile bir ölçüye dönen kol motora bağlanmıştır. Motor ve ekli kolu bir kapı menteşesi ile kontrplak bağlı bir bükük ¾ inç kare tüp stokunun bir tarafı bastırarak, saat yönünde çevirin. Bir tekerlek bu directl olduğu platformda karşı rulo izin vermek için bir platform altında tüp stok üst tarafındadırYukarıda y.
4. Kol tüpü stoku bir ucunu iter ve iki düzey platformu (Şekil 1D) yükselterek, diğer ucunu kaldırır. Kol silindir tüp stok temizler zaman kol (Şekil 1F) geri platformu bırakarak, başlangıç ​​pozisyonuna geri dönmek için izin verir.
5. Platformları kontrplak üstüne yerleştirilir ve vida gözleri üzerine kanca olan bungee kabloları tarafından teminat altına alınmıştır raflar oluşur. Platformları parantez ile kontrplak bağlı olan çekmece sürgü boyunca yukarı ve aşağı doğru kaydırın.
6. Flakon raflar yerleştirilir ve bungee kabloları ile yerinde tutulur bir kare ızgara ekran yardımıyla sabitlenir.
7. Bir Strafor yastık damla şok kırmak için platform altına yerleştirilir.
8. Motor gücü tam bir dönme süresi 15 saniyeden uzun olacak şekilde ayarlanır.

2. Egzersiz protokolü

1. Sinekler% 50 nem ve 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde ile bir 25 ° C inkübatöründe içinde muhafaza edilir. Both egzersiz eğitimi ve egzersiz kapasitesinin değerlendirilmesi 25 ° C sıcaklık kontrollü odada yapılmaktadır.
2. Sinekler birbirinden 1-2 gün içinde toplandı ve yaş-eşleştirilir. 240 sinekler minimum dayanıklılık ve negatif geotaxis (tırmanma) yeteneği, egzersiz eğitiminin etkilerini yansıtan iki fizyolojik göstergeleri boyuna izlenmesi için gereklidir. Boyuna izleme kohort arasındaki varyasyonun karıştırıcı etkisi olmaksızın, her bir grup için başlangıç ​​değerlerine göre bağlı değişim izolasyonu sağlar. Gerektiği gibi ek deneyler için sinekler alınmalıdır.
3. Toplanmasından sonra, sineklerin icra edilmeyecektir egzersiz rejimi ve 120 kontrol sinek, maruz kalacağı 120 deneysel sinekler, ayrılır. Sinekler, her uçar 20 şişe içinde depolanır. Deneysel sineklerin şişeleri firma selüloz asetat Flugs ve kontrol flakon (unexercised) ile takıldığını sinekler yumuşak bir sünger tapalar, w ile takılıhich Power Tower sırasında sinekler hareketsiz aşağı itilmiş olabilir. Kendi adaptif boyutu flakon altına yakın kolayca yerleştirilmesini sağlar çünkü Sünger immobilizasyon için kullanılır. Yumuşak bir sünger malzeme de daha sağlam Flugs kaynaklanan yaralanmaları azaltır.
4. Power Tower sinekler depolanır ve boş şişeler içinde icra edildiği sinekler daha yumuşak bir iniş ile sağlamaktadır gıda, 5 mL içeren flakon icra edilir. Bir eğitim oturumu sırasında çoğu zaman yemek sinekler gözlemlemek olmasa da gıda tipik olarak,% 10 sukroz,% 10 maya, su ve% 2 agar oluşmaktadır. Boş şişeleri eğitim sırasında kullanılması halinde, rahatsızlıklar yaşayabilirsiniz sinekler yüzdesi giderek artmaktadır.
5. Güç Tower 25 'de muhafaza edilmektedir sıcaklık kontrollü bir odaya ° C'de işletilmektedir Deneysel sinekler Power Tower yerleştirilir ve tırmanmak için yapılır. Kontrol sinekler de Power Tower yerleştirilir, ancak sünger stoper v içine doğru itilirsinekler üzerinde ial yaklaşık 3 mm hareketi sınırlamak amacıyla. Bu grup egzersiz ilgisiz Power Tower herhangi bir etkileri için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Bazı oda hala manevra kabiliyeti bu sinekler için var olmasına karşın, sürekli olarak bu şartlar altında sinekler çok az çalıştırmak ve egzersiz fizyolojik bir tepki göstermek değil gözlemledim. Ayrıca tüm azından Güç kulesinin üstüne değildir ek bir kontrol grubu dahil edilmesi arzu edilebilir.
6. Sinekler rampalı bir programı (Şekil 2) kullanılarak, her hafta beş gün üst üste icra edilir. Haftada bir sırasında sinekler seans başına 2.5 saat 2 saat oturum başına, bir hafta iki icra edildiği ve seans başına 3 saat boyunca haftada üç. Diğer rejimler test edilmiş olsa da, bu protokol genotipler arasında ve farklı koşullar altında tutarlı sonuçlar üretir. Bu protokol, ancak, belirli bir deneme uygun olabilecek olası varyasyonları geniş bir dizi tabidir.

3. Egzersiz ve lokomotor Yorgunluk

1. Dayanıklılık egzersiz sırasında yorgunluk zaman belirli bir kohort egzersiz kapasitesini onaylamak ve / veya ölçmek için yararlı fizyolojik bir göstergesidir. Yorulma deneyleri eğitimi Deneylerde kullanılan edilecektir kohortlarında boylamasına gerçekleştirilebilir. Tahliller eğitimi protokolü ya da her ikisinin tamamlanmasından sonra, eğitim öncesinde ya da gerçekleştirilebilir. Eğitim sırasında artan ilerleme grafik isteniyorsa diğer ara zaman noktaları eklenebilir. Yorulma assay ayrıca, diyet değiştirme (Şekil 3B) olarak eğitimi protokolü, başka tedavilere cevap olarak egzersiz dayanıklılık ölçmek için kullanılabilir.
2. Eğitim yer alıyor değilken Yorulma deneyleri bir günde yapılmalıdır. Deney ve kontrol Hem sineklerin 20 her flakonlarda Power Tower yerleştirilir ve yorgun kadar tırmanmaya yapılır. Yorgunluk davranış tırmanma ile negatif geotaxis uyarıcıya yanıt vermek için başarısızlık olarak kabul edilmektedir. Yorgunluk behavior görsel gözlem tarafından atılırsa.
3. 5 veya daha az sinek arka arkaya dört damla için daha yüksek 2 inç tırmanmak mümkün olduğunda sineklerin bir şişe "yorgun" olarak kabul edilir. Hala çalışırken yorgunluk şişeleri Güç Tower kaldırılır ve çıkarılması süresi kaydedilmektedir. Kaldırma Times iç içe geçmiş bir histogram olarak, ya da bir "time-to-başarısızlık" komplo olarak çizilebilir. Bir "süre-başarısızlık" komplo Şekil 3B görüldüğü gibi verilerin bir örneği çizilmiştir.
4. Flakon 10 saat en fazla 10 dakika aralıklarla (Şekil 3B) izlenmektedir.

4. Egzersiz, Yaş ve lokomotor Yetenek

1. Bu eğitim protokolü bağlı çalışan davranışı dayandığından, eğitim etkileri miktarlarının için birincil test uzunlamasına eğitim sırasında hızı ortalama çalışan değişimi ölçmektir. Eğitim sırasında, icra ve unexercised sineklerin 120-sinek kohortlarında olumsuz geotaxis uyarana tepki için günlük test edilir. HALKA teknik dGargano ve ark escribed. (2005) sineklerin tırmanma yeteneği ¹² ölçmek için kullanılır. Kısaca, bu tekniğin olumsuz geotaxis indüksiyonu sonrası tanımlanmış bir süre boyunca uçan bir şişe ile tırmandı ortalama yükseklik ölçer. Tanımlanmış bir süre boyunca yükseldi yüksekliği hızı tırmanma eşdeğerdir. Ölçümler günün çalıştırdıktan sonra yorgunluktan komplikasyonları önlemek amacıyla günlük antrenman için makine üzerinde sinekler yerleştirmeden önce yapılır.
2. Standart protokolde, sinekler üç hafta olmak üzere toplam icra edildiği ve tırmanma yeteneği beş hafta olmak üzere toplam incelenir: (Şekil 2) egzersiz kesilmesinden sonra egzersiz eğitimi ve iki hafta boyunca üç hafta. Bu deneyci mobilite üzerine egzersizin etkisi programı kesilmesinden sonra devam edip grafik sağlar.
3. Her bir grupta günlük HALKA performansı dört fotoğraf yeteneği tırmanma analizi için kullanılmıştır. Altı şişeleri her fotoğraf dahil edilir. Negatif geotaxis uyarılan, ve bir kullananzamanlı kamera, fotoğraf saniye belirli sayıda ardından çekilir. Bu deneysel koşullarına bağlı olarak değiştirilebilir olmakla beraber, tipik olarak iki saniye kullanımı. Her fotoğraf için, her şişe eşit yükseklikte dört parçaya bölünür ve görüntü işleme yazılımı her anında onu ayrılan süre içinde ulaştı kadranda dayalı bir puan atamak için kullanılır. Üst kadranda, 4 puan alabilmeniz için tırmanmaya Sinekler sonraki en yüksek kadranda uçar 3 almak, bir 2 alırsınız en yüksek ikinci kadranda uçar ve en düşük kadranda sinekler 1 alırsınız. Tüm alt kısmında kapalı tırmanmaya değil Sineklerin 0 puan verilir.
4. Verilen bir fotoğrafını her şişe için, bir "tırmanma indisi" ki şişe içinde hepsi sineklerin skorlar ortalama tarafından üretilir. Dört fotoğraflarından Her flakon Kullanıcı endeksleri o gün için son bir tırmanma indeks vermek için ortalaması alınır.
5. Tüm negatif geotaxis deneyler uzunlamasına yapılmaktadır. Sonuçlar normalize t vardıryeteneği tırmanış sırasında kohort varyasyon etkisini azaltmak ve egzersiz sonucu bir kohort Kullanıcı tırmanma kapasitesi göreli boylamasına değişikliği vurgulamak amacıyla ilk "egzersiz öncesi" puan o. İlk puanı ilk üç gün tırmanış endeksleri ortalaması ile belirlenir ve 1 değeri atanır. Daha sonraki çalışmalarda daha sonra başlangıç ​​endeksi bir yüzdesi olarak ifade edilir.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Yabani tip sinekler gibi yaşı beş haftalık (Şekil 3A) arasında uzunlamasına HALKA tayinlerde yansıyan, eğitim bittikten sonra devam ederse tırmanma yeteneği bir azalma yaşa bağlı azalma olan bir dayanıklılık protokolü yanıt. Negatif geotaxis Bu gecikmiş düşüş yabani tip egzersiz yanıt normal meydana emin olmak için, pozitif kontrol olarak hizmet verebilir standart bir fenotipik bir yanıttır. Bu, verilerin bir dizi örnek olarak sunulmuştur nasıl Güç T tarafından egzersiz indüksiyonuOwer programı bir davranış giriş olarak kullanılabilir. Bu etkiyi modüle çeşitli genetik ve çevresel faktörlerin yeteneği daha sonra değerlendirilebilir.

Bunun tersine, aynı zamanda, çeşitli güç Tower deney tasarımı bir çıkış olarak kullanılabilir. Örneğin, genotipine, diyet, veya diğer koşullara çeşitlendirilebilir. Sonra, egzersiz fizyolojisi bu farklılıkların etkisi Power Tower kullanılarak test edilebilir. Burada, bu yaklaşımın bir örneğini gösterir. Diyetlerine sakaroz değişen bir yüzde ile uçar artan dayanıklılık kapasitesi (Şekil 3B) ile korele yorgunluk, artan sakkaroz içeriğe kez test edildiğinde.

Şekil 1.. Power Tower İşletilmesi. Bu bükük kare tüp ile temas kadar bağlı rulo ile (AC) motorlu bükülmüş kol saat yönünde dönmektedir. (D, E) kolu bükük kare tüp iter , Asansör sinek şişeleri ile dolu olduğu platformda neden olur. (F) kol gibi platformu sinekler şişenin dibine dönmek için zorlayarak, geri düşmek için izin verilen tüp temizler.

Şekil 2. Egzersiz Protokolü önerdi. Eğitim protokolü tabi uçar giderek 30 dakika her hafta ilk 2 saat arasında egzersiz süresi artar üç hafta süren rampalı rejimi altında her hafta beş gün için egzersiz yapılır. Standart analizler öncesi yorgunluk testleri içerir ve hafta ile 5. hafta 1 egzersiz programı ve HALKA deneyleri takip. Tüm testler negatif kontrol olarak unexercised sineklerin sayısı eşit iki kez yapılmaktadır. Araştırmacılar tarafından belirlendiği şekilde, çeşitli fizyolojik veya biyokimyasal yapılabilir.

3786fig3.jpg "/>
Şekil 3. Dayanıklılık egzersiz hareketlilik birden yönlerini değiştirir. (A) HALKA deneyleri erkek Y ¹ W ^67C23 kohortlarında tek bir çift de çağlar boyunca uzunlamasına yapılmıştır. Yaştaki, genetik özdeş icra ve unexercised kontrolü sinekler ortalama tırmanışı hız için günlük ölçüldü. Sonuçlar ölçüm ilk üç günü boyunca ortalama tırmanma yüksekliği normalize bir tırmanma endeksi olarak ifade edilir. Egzersiz eğitilmiş sinekler yaş (2-yönlü ANOVA, p <0.005) arasında yaştaki unexercised kardeşleri ile karşılaştırıldığında olumsuz geotaxis yeteneğinde bir azalma yaşa bağlı düşüş gösterdi. (B) Yorgunluk Testler 8 saat boyunca yürütülen yaştaki kadın Canton S sinekler yorgunluk (Log-rank, p <0.0001) zamanında diyet sakaroz içeriğinin bir etkisi gösterilememiştir. Deney öncesinde, sinekler% 10 ağırlık / hacim maya konsantrasyonu ve değişen bir yüzde ile, bir maya / sukroz / agar diyetle beslendidiyet sakaroz. 20 sinekler her beş şişe Her diyet için test edildi. Grafik hala belirli bir zaman noktasında çalışan beş veya daha fazla sinekler kaç şişe görüntüler. Bu sonuçlar en az beş sineklerin olumsuz geotaxis uyaranlara cevap vermeye devam zaman bir nokta olarak tanımlanan bir flakon için "başarısız" bir yaşam (veya başarısızlık zamanı) eğrisi gibi istatistiksel ve grafiksel olarak tedavi edilebilir. Birçok olası çalışma tasarımları ve istatistiksel tedaviler yapılabilir ve veri işleme ve ölçüm bireysel amaçlar uyacak şekilde özel gerektiğini unutmayın.

Burada sunulan genel bir protokol sonrasında antrenmanlara fizyolojik etkileri belgeleyen başarılı olmuştur. Ancak, bu protokolde çeşitli alanlarda, özellikle deneysel ihtiyaçlarınıza göre değişiklik tabidir. Örneğin, nöbetleri ve eğitim ve sayıda uzunluğu potansiyel programı daha az ya da çok zor olarak istenen olmak üzere farklı şekillerde olabilir. Negatif geotaxis yeteneği ölçüldüğü kabın yüksekliği belgelenmelidir iyileştirilmesi için kullanılabilir alanını artırmak üzere değiştirilebilir. Hız tırmanma kantitatif otomasyonunu çeşitli yöntemler uygulanabilir. Prensip olarak, arka plan sinek ayırt yeteneğine sahip herhangi bir yazılım programı veri toplama işlemi hızlandırmak için kullanılabilir.

Protokolünün bazı yönleri ise, büyük bir dikkatle sadece modifiye edilmelidir. Örneğin, ön deneyler kuvvetli haftada kalanı en az bir gün daha Göstrm kolaylaştırmak için eğilimi göstermektediramansız günlük egzersiz daha ovement. Buna ek olarak, sirkadiyen ritimler ve sıcaklık soğukkanlıdırlar hayvanların hareketleri etkiler bilinmektedir. Eğitim gerçekleşir o günün zaman sirkadiyen ritim karıştırıcı etkileri olasılığını önlemek için, çeşitli olabilir, ama her zaman karşılaştırma altında belli gruplar içinde tutarlı olmalıdır. Sıcaklık kontrolü de önemlidir ve biz ev egzersiz donanımları için sabit sıcaklıkta özel bir oda öneririz. Son olarak, erkeklerde ve kadınlarda egzersiz kapasitesi verimlilik ve cinsiyet farklılıkları karıştırıcı etkilerin önlenmesi için potansiyel olarak, ayrı ayrı ve yetiştirilen ölçülmelidir.

Bu metodoloji Potansiyel uygulamaları yalnızca araştırmacı hayal gücü ile sınırlıdır. Ön çalışma olarak, üç geniş uygulamalarda bu yöntem kullanılmaktadır adres:

1. Çağlar boyunca vahşi tip biyoloji çeşitli yönlerine ilişkin dayanıklılık egzersiz etkisini ölçmek için.
2. TBelirli mutant fenotipleri dayanıklılık egzersiz etkisini ölçmek o.
3. Egzersizin yararları yürütmek için gerekli olan genetik faktörler için taranması için

Bu uygulamaların her biri belirli bir olasılıklar çeşitli kapsar. Bizim ön tecrübeye dayanarak, mutant fenotipleri bu diyete göre değişir kadar egzersiz düzeyi ile değişebilir eğilimindedir. Daha iyi bir diyet, egzersiz fizyolojisi ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi anlamak için omurgasız modellerin kullanımı belki de bu protokolün en önemli genel bir uygulamadır.

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Bu çalışma NHLBI gelen RW için bir hibe ile desteklenmiştir.